Сравнительное исследование антивозрастных свойств и механизма: ресвератрол и ограничение калорий

АБСТРАКТНЫЙ

Ресвератрол и ограничение калорийности (CR) являются мощными терапевтическими вариантами дляпротив старения. Здесь их сравнительное влияние наген, связанный с долголетиемрегулятор информации о молчании (SIRT1) оценивали in vitro и in vivo. Клетки IMR-90, обработанные 2,2'-азобис(2-амидинопропан)дигидрохлоридом (AAPH), применяли для создания модели клеточного старения, а также использовали крыс, обработанных D-галактозой (D-gal). какмодель стареющего животного. Ресвератрол и CR продемонстрировали сходныеантивозрастные мероприятия, о чем свидетельствуетингибирование старения и апоптоза и восстановление когнитивных нарушений и окислительного повреждения. Более того, они моглиактивировать теломеразу(ТЭ) активность,увеличить экспрессию SIRT1, forkhead box 3a (Foxo3a), активный регулятор SIRT1 (AROS) и Hu антигена R (HuR), но снижает уровни p53 и удаляется при раке молочной железы 1 (DBC1). Тем не менее, 10 мкМ ресвератрола in vitro и группа с высокой дозой in vivo показалиотносительно более сильное действие антивозрастных и стимулирующих уровней SIRT1, чем CR. В заключение, ресвератрол и CR показали схожиеантивозрастные мероприятияпо сигнализации SIRT1,подразумевая потенциал ресвератрола как миметика CR.

Нажмите здесь, чтобы узнать о травяном лечении Цистанхе против старения

ВВЕДЕНИЕ

Улучшения в области здравоохранения помогли увеличить ожидаемую продолжительность жизни человека в последние десятилетия, и, таким образом, значительно увеличивается численность пожилого населения. К сожалению, это по-прежнему означает увеличение периодов плохого здоровья или инвалидности. В настоящее время различные заболевания, связанные со старением, становятся самой серьезной угрозой для здоровья в большинстве развитых стран. Хотя пока невозможно изменить наш генетический фон, в настоящее время появляются различные стратегии борьбы со старением, такие как здоровый образ жизни и терапевтические вмешательства, направленные на снижение частоты возникновения факторов риска плохого здоровья [1].

CR, снижение потребления калорий без недоедания, является одним из самых надежных вмешательств, которые увеличивают продолжительность жизни модельных организмов от дрожжей до приматов [2]. Это может защитить от ухудшения биологических функций, снизить заболеваемость и отсрочить начало многих возрастных заболеваний. Механизм, с помощью которого CR продлевает продолжительность жизни, включает замедление роста, уменьшение жировых отложений, задержку нейроэндокринных или иммунологических изменений, увеличение способности репарации ДНК, измененную экспрессию генов, усиленный апоптоз, снижение температуры тела и снижение скорости метаболизма, а также улучшение окислительных процессов. стресс [3]. Антивозрастной эффект CR тесно связан с повышенным уровнем и активацией членов семейства сиртуинов, а также связан с другими молекулярными сигнальными путями, включая коактиватор G-рецептора, активируемого пролифератором пероксисом - 1 (PGC{{ 6}} ), аденозинмонофосфат-активируемая протеинкиназа (AMPK), инсулин/фактор роста инсулина-1 и мишень рапамицина [1, 4]. Однако большинство людей не стали бы соблюдать такую ​​строгую диетическую программу, особенно в долгосрочной перспективе. Поэтому недавние исследования все чаще направлены на определение возможности и эффективности натуральных и/или фармакологических молекул/лечений-миметиков CR без снижения потребления пищи [5].

Ресвератрол — это растительный полифенол, который обычно содержится в различных растениях, включая кожицу винограда, ягоды и арахис. Интересно, что включение ресвератрола в пищевые добавки или продукты питания может быть мощным терапевтическим средством против старения, и в нескольких сообщениях указывается, что лечение ресвератролом оказывает благотворное влияние, подобное эффекту CR [6], что подразумевает потенциал ресвератрола как миметика CR. [4]. Недавно было продемонстрировано, что ресвератрол продлевает продолжительность жизни за счет значительного увеличения активности SIRT1, что приводит к увеличению сродства SIRT1 как к НАД плюс, так и к ацетилированному субстрату [7, 8], что также отвечает за долголетие, вызванное CR. Хотя ресвератрол и CR широко изучались на предмет их потенциальной пользы для здоровья, мало что известно об их сравнительных эффектах. В этом исследовании мы сравнили омолаживающий эффект ресвератрола и CR in vivo и in vitro путем обнаружения пути SIRT1.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Ресвератрол и CR снижали окрашивание связанной со старением -галактозидазы (SA-gal) в клетках IMR-90, обработанных AAPH.

Воспользовавшись моделью индуцированного AAPH старения клеток IMR-90, мы проверили возможное влияние на окрашивание SA- -gal. Как показано на рисунке 1, клетки, обработанные AAPH, демонстрировали более широкое и сильное положительное окрашивание, чем в контрольных клетках, а положительное окрашивание в контрольных клетках было относительно слабым. Было обнаружено, что обработка ресвератролом (5 мкМ, 10 мкМ и 20 мкМ) или CR обеспечивает заметную защиту от старения, вызванного AAPH. Более того, сравнивая эффект ресвератрола с CR, клетки, обработанные 10 мкМ ресвератрола, относительно реже демонстрировали положительное окрашивание SA- -Gal, чем обработка CR. Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что 10 мкМ ресвератрола более эффективно ингибируют старение, вызванное AAPH, чем CR.

Сканирующий электронный микроскопический анализ клеток IMR- 90

Исследование с помощью сканирующей электронной микроскопии предоставило некоторые новые подробности о структуре клеток, обработанных AAPH (рис. 2). Нормальный IMR-90 представлял собой полностью расправленные клетки типичной веретенообразной формы. Большинство клеток содержало два сужающихся отростка и имело несколько пузырьков. Клетки, обработанные AAPH, имели увеличенную и уплощенную морфологию с многочисленными пузырьками. С другой стороны, сканирующая электронная микроскопия образцов IMR-90, обработанных ресвератролом или CR после введения AAPH, ясно показала, что, хотя некоторые пузырьки могут быть обнаружены, нормальная веретенообразная форма обычно сохраняется вместе с полным распространением.

Ресвератрол и CR снижали апоптоз в клетках IMR-90, обработанных AAPH

Фосфатидилсерин на поверхности клеток, считающийся отличительной чертой апоптоза на ранней стадии, определяли с помощью анализа окрашивания PI/аннексином V (рис. 3). Апоптотические клетки состоят как из ранних апоптотических клеток, окрашенных аннексином-V-FITC, так и из поздних апоптотических или некротических клеток, окрашенных аннексином-V-FITC и PI. Популяция апоптотических клеток значительно увеличивалась в группе AAPH (34,54 процента) по сравнению с отрицательной группой (7,32 процента). Принимая во внимание, что лечение ресвератролом (5 мкМ, 10 мкМ и 20 мкМ) или CR снижает апоптоз в клетках IMR-90, индуцированных AAPH. Кроме того, лечение 10 мкМ ресвератрола (11,58%) более эффективно уменьшало апоптоз, вызванный AAPH, чем лечение CR (16,78%).

Изменение общего вида и массы тела

В течение всего эксперимента стареющим модельным крысам ежедневно вводили D-gal в дозе 200 мг/кг и наблюдали за общим внешним видом. По сравнению с нормальными контрольными крысами крысы в ​​экспериментальной группе D-gal постепенно становились апатичными, тупыми и медленными в ответ; волосы модельной группы постепенно теряли эластичность и становились ломкими; кожа стала тонкой, неэластичной и понемногу обвисла. Однако одновременное лечение ресвератролом или CR с D-gal у крыс показало обратное изменение вышеуказанных изменений по сравнению с группой D-gal. Различий в массе тела между опытными группами в период лечения не было, за исключением группы CR, у которой практически не было прибавки массы тела в течение эксперимента (рис. 4).

Ресвератрол и CR улучшили пространственное обучение и память крыс SD

Мы оценили способность крыс к пространственному обучению и памяти, выполнив тест водного лабиринта Морриса. Как показано на Рисунке 5, все пять групп смогли успешно усвоить задание, о чем свидетельствует постепенное уменьшение задержки выхода и увеличение скорости плавания в 4-дневную фазу навигации по месту. При анализе с помощью двухстороннего метода ANOVA были показаны значительные различия как в средней латентности побега, так и в скорости плавания между тренировочными днями (F(3,138)=41,660, P < 0. 01; F(3,138)=10.013, P < 0.01 соответственно) и между курсами лечения (F(4,46) )=36.762, P < {{40}}.01; F(4,46)=20.102, P <0,01 соответственно), но отсутствие взаимодействия между днями факторов и лечением (F(12,138)=0,846, P>0,05; F(12,138)=1,084, P>0,05 соответственно). Латентный период побега в группе D-gal был заметно больше, чем в контрольной группе (P <0,01) (Post-hoc анализ, рисунок 5A). Между тем, у крыс в группе ресвератрол плюс D-гал или в группе CR плюс D-гал продемонстрировано обращение вспять вышеупомянутых изменений в латентном периоде ускользания по сравнению с группой D-гал (P <0,01) (рис. 5А), и заметно сократилось время ускользания. латентность до аналогичных уровней с контрольной группой. Сходные результаты были получены для скорости плавания крыс (рис. 5В), и крысы в ​​группе ресвератрола плюс D-гал и группе CR плюс D-гал продемонстрировали заметное увеличение скорости плавания по сравнению с группой D-гал (P <0,01). ). Тем не менее, крысы, получавшие высокую дозу ресвератрола плюс D-гал, демонстрировали относительно более длительный латентный период и более низкую скорость плавания по сравнению с группой, получавшей CR плюс D-гал.

Рисунок 1: Ресвератрол и ограничение калорийности снижают окрашивание SA- -gal в клетках IMR-90, обработанных AAPH. Клетки IMR- 90, индуцированные AAPH, обрабатывали ограничением калорийности (CR) или ресвератролом (RES) в указанной концентрации в течение 2 дней. Увеличение составляло 20×.

Рисунок 2: Анализ клеток IMR-90 с помощью сканирующей электронной микроскопии. Клетки IMR-90, индуцированные AAPH, обрабатывали ограничением калорийности (CR) или ресвератролом (RES) в указанной концентрации в течение 2 дней. Увеличение составило 6000×.

Рисунок 3: Ресвератрол (RES) и ограничение калорийности (CR) снижали апоптоз в клетках IMR-90, обработанных AAPH. Клетки окрашивали аннексином V-FITC/PI и анализировали с помощью проточной цитометрии. Канал FL1 использовали для обнаружения окрашивания аннексином-V-FITC, а канал FL2 — для окрашивания PI.

В фазе пространственного зондирования (рис. 5C и 5D) можно было увидеть, что в группе D-gal произошло заметное сокращение пересечений платформ по сравнению с контрольной группой (P <0.{{6} }1). Интересно, что среднее количество раз, когда крысы пересекали платформу, значительно улучшилось после введения ресвератрола или CR по сравнению с группой D-gal (P <0,01). Однако крысы в ​​группе высоких доз ресвератрола плюс D-гал пересекали платформу чаще, чем крысы в ​​группе CR плюс D-гал.

Эти результаты показали, что у стареющих модельных крыс были нарушения пространственного обучения и памяти, в то время как лечение ресвератролом или CR могло восстановить возрастные когнитивные нарушения, вызванные введением D-gal. Кроме того, стареющие модели крыс, получавших высокие дозы ресвератрола, показали относительно более эффективное поведение, чем крысы, получавшие CR.

Влияние ресвератрола и CR на уровни SOD, T-AOC, MDA и липофусцина у стареющих крыс

Уровни SOD, T-AOC, MDA и липофусцина у крыс оценивали, чтобы подтвердить, были ли омолаживающие эффекты ресвератрола и CR опосредованы облегчением окислительного стресса, вызванного введением D-gal. В таблице 1 представлены уровни СОД, Т-АОС и МДА в сыворотке крови, печени и головном мозге у нормальных и стареющих крыс. Воздействие D-gal значительно снизило уровни SOD и T-AOC, но повысило уровень MDA в сыворотке, печени и головном мозге по сравнению с контрольной группой (P < 0,05). Одновременное введение ресвератрола или КР с D-гал у крыс вызывало снижение активности уровня МДА, но повышало уровни СОД и Т-АОС по сравнению с группой, получавшей Д-гал. Однако по сравнению с лечением CR результаты показали, что введение высоких доз ресвератрола было относительно лучше.

Рисунок 4: Влияние ресвератрола и ограничения калорийности на массу тела крыс, получавших D-gal, во время эксперимента. Все значения были выражены как среднее значение ± стандартное отклонение. NG, группа отрицательного контроля; MG, группа управления моделью; RESL, группа низких доз ресвератрола; RESH, группа высоких доз ресвератрола; CR, группа ограничения калорийности.

Рисунок 5: Влияние ресвератрола и ограничения калорийности на поведение крыс, получавших D-gal, в водном лабиринте Морриса. (A) Сравнение задержек с платформой в течение 4 тренировочных дней. Каждую мышь подвергали 4 испытаниям в день. (B) Сравнение скорости плавания в течение 4 тренировочных дней. (C) Сравнение количества перекрестных платформ, где платформа была удалена для испытания зонда. (D) Типичная плавательная дорожка в пробном испытании. Все значения были выражены как среднее значение ± стандартное отклонение. * P < 0.05, **P < {{10}}.01 по сравнению с группой отрицательного контроля; # P <0,05, ##P <0,01 по сравнению с контрольной группой. NG, группа отрицательного контроля; MG, группа управления моделью; RESL, группа низких доз ресвератрола; RESH, группа высоких доз ресвератрола; CR, группа ограничения калорийности.

Таблица 1: Антиоксидантный статус в тканях и крови крыс каждой группы

Примечание. Значения представляли собой среднее значение ± стандартное отклонение. * P < {{0}}.05, **P < 0.01 по сравнению с контрольной группой (все группы); # P < 0,05, ##P <0,01 по сравнению с модельной группой (группа CR и группа RES); ∆P < 0,05, ∆∆P < 0,01 по сравнению с группой CR (группа RES). NG, группа отрицательного контроля; MG, группа управления моделью; RESL, группа низких доз ресвератрола; RESH, группа высоких доз ресвератрола; CR, группа ограничения калорийности.

относительно выше. Накопление липофусцина является одним из наиболее устойчивых признаков старения мозга. Как показано на рисунке 6, у крыс, получавших D-gal, наблюдалось значительное повышение уровня липофусцина по сравнению с контрольной группой (P < 0.01). Однако лечение ресвератролом и CR снижало накопление липофусцина в коре головного мозга стареющих крыс по сравнению с крысами, получавшими D-gal (P < 0,01). Кроме того, не было различий между группой ресвератрол плюс D-гал и группой CR плюс D-гал (P > 0,05).

Ресвератрол и CR повышали активность теломеразы у стареющих крыс

Мы оценили влияние ресвератрола и CR на активность теломеразы в тканях печени и головного мозга (рис. 7). Наши результаты показали, что лечение не оказало существенного влияния на активность теломеразы в тканях печени (P > 0.05). Однако активность теломеразы была снижена в группе введения D-gal по сравнению с контролем (P < 0,05). Между тем, ресвератрол или CR могут повышать активность теломеразы в группе, получавшей D-gal плюс ресвератрол или CR. Кроме того, не было различий между группой ресвератрола и группой CR (P > 0,05).

Рисунок 6: Влияние ресвератрола и ограничения калорийности на уровень липофусцина у стареющих крыс. Все значения были выражены как среднее значение ± стандартное отклонение. * P < 0.05 по сравнению с группой отрицательного контроля; # P <0,05 по сравнению с контрольной группой. NG, группа отрицательного контроля; MG, группа управления моделью; RESL, группа низких доз ресвератрола; RESH, группа высоких доз ресвератрола; CR, группа ограничения калорийности.

Ресвератрол и CR увеличивали индуцированную AAPH экспрессию мРНК SIRT1. Чтобы изучить роль SIRT1 в терапевтических эффектах ресвератрола и CR, уровни экспрессии мРНК SIRT1 в клетках и тканях IMR-90 были исследованы с помощью количественного RT-анализа в режиме реального времени. ПЦР. Результаты показали, что экспрессия мРНК SIRT1 в клетках IMR-90 была значительно снижена с помощью AAPH. Ресвератрол и CR могли эффективно восстанавливать уровни экспрессии мРНК SIRT1 в клетках, обработанных AAPH, а 1{14}} мкМ ресвератрола была оптимальной концентрацией для стимуляции экспрессии мРНК SIRT1 в клетках IMR-90 (P < 0,01; рис. 8)