Новая роль интерлейкина (IL) в фиброзе

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Часть Ⅰ: Ядерный IL-33 сдерживает раннее превращение фибробластов в фенотип, секретирующий внеклеточный матрикс

Франческа Гатти, Собуй Миа, Клара Хаммарстрём и др.

интерлейкин(IL)-33 представляет собой цитокин, который, по-видимому, опосредуетфиброзпутем передачи сигналов через свой рецептор ST2 (IL(интерлейкин)-33R/ILiRL1). Однако это также белок, который после синтеза сортируется в ядре клетки, где он, по-видимому, влияет на укладку хроматина. Здесь мы описываем новую роль ядерной IL(интерлейкин)-33 в регуляции фенотипа фибробластов у мышей.почкафиброзобусловлен односторонней обструкцией мочеточника. Транскрипционное профилирование IL(интерлейкин)-33-дефицит почек через 24 часа после лигирования выявил повышенную экспрессию фиброгенных генов и обогащение наборов генов, участвующих в формировании и ремоделировании внеклеточного матрикса. Эти изменения были связаны с внутриклеточными эффектами ИЛ.(интерлейкин)-33, потому что они не были воспроизведены при обработке нейтрализующим антителом к ​​L.33, которое предотвращает ИЛ.(интерлейкин)-Передача сигналов рецептора 33R/ST2L также не наблюдалась в почках с дефицитом L-33R/ST2-. Для дальнейшего изучения внутриклеточной функции IL-33 мы установили профили транскрипции фибробластов человека, наблюдая, что нокдаун IL-33 искажал профиль транскрипции от воспалительного к фенотипу миофибробластов, что отражалось в более высоких уровнях COL3Al , COL5A1 и белок трансгелин, а также более низкие уровни экспрессии IL6, CXCL8, CLL7 и CCL8. В заключение, наши данные свидетельствуют о том, что ядерный IL(интерлейкин)-33 в фибробластах ослабляет первоначальный профибротический ответ до тех пор, пока постоянные стимулы, вызванные UUO, не смогут преодолеть этот защитный механизм.

интерлейкин-33 (Ил-33/Ил(интерлейкин)1F1l) является членоминтерлейкин-1 надсемейство, привлекшее значительное внимание как предполагаемый посредникфиброзразработка. Во многом этот интерес был усилен наблюдением, что повторные инъекции IL(интерлейкин)-33, действуя через трансмембранный рецептор ST2(IL(интерлейкин)33RJ/ИЛ(интерлейкин)1RL1), индуцированный кожнымфиброз' и заметив, что IL(интерлейкин)-33-дефицит существенно снижает индуцированную четыреххлористым углеродом печеньфиброз. Действительно, ИЛ(интерлейкин)-33 может продвигатьфиброзпутем образования профибротической IL(интерлейкин)-13 из врожденных лимфоидных клеток 2 типа (ILC2) и Т-хелперных 2-лимфоцитов.

Почечный интерстициальныйфибрози потеря паренхиматозных тубулярных клеток являются частыми конечными результатами хронических заболеваний почек и хорошими предикторами прогрессирования заболевания. Текущие данные, полученные на двух разных моделях мышей, подтверждают гипотезу о том, что IL(интерлейкин)-33 также способствует патологии почекфиброз: при односторонней обструкции мочеточника (UUO) Chen et al. сообщили о снижении паренхиматозной потери и усилении эпителиальной пролиферации как при ИЛ, так и при(интерлейкин)-33- и мышей с 2-дефицитом ST, а также при почечной ишемии-реперфузии Liang et al. показали, что ингибирование IL(интерлейкин)-33 сигнализация путем введения растворимой ИЛ(интерлейкин)-33 рецептор (sST2) также снижаетсяфиброз.

Отчеты, посвященные фиброгенным свойствам ИЛ.(интерлейкин)-33 обычно выполняются и интерпретируются с учетом механизма, с помощью которого IL(интерлейкин)-33, высвобождаемый из стрессовых или поврежденных клеток, связывается с внеклеточным доменом своего рецептора. Напротив, сортировка IL.(интерлейкин)-33 в ядро ​​клетки после синтеза, и его способность влиять на рецептор-независимую укладку хроматина предполагает, что IL -33 может также выполнять функции, подобные фактору транскрипции, независимые от рецептора, способ действия, которому уделялось гораздо меньше экспериментального внимания. . Эти рассуждения тем более интересны в связи с тем, что ядерная локализация ИЖ(интерлейкин)-33 имеет жизненно важное значение, о чем свидетельствует летальное неразрешающееся воспаление при нарушении сигнала ядерной локализации».

Ключевой клеточный медиаторфиброзЭто миофибробласты, которые при активации служат в качестве первичных коллаген-продуцирующих и сократительных клеток восстановления тканей. Для миофибробластов характерна экспрессия а-гладкомышечного актина (а-SMAACTA2), который обеспечивает их сократительную функцию и способствует деструктивному эффектуфиброзРанее мы продемонстрировали, что ядерный I -33 быстро и сильно индуцируется в миофибробластах во время экспериментального заживления ран, язвы желудка и язвенного колита. Действительно, экспрессия IL(интерлейкин)-33, по-видимому, является общим признаком a-SMA-положительных миофибробластов, поскольку он также обнаруживается в поджелудочной железе.фибрози в миофибробластоподобных звездчатых клетках печени. Взятые вместе, эти результаты делают интересным вопрос, действительно ли IL(интерлейкин)-33 может играть роль в регуляции функции и дифференцировки миофибробластов.

Здесь мы описываем новую роль ядерного lL-33 в регуляции фенотипа миофибробластов. Путем генетической делеции или фармакологического ингибирования IL(интерлейкин)-33 в модели UUO, а также истощение IL(интерлейкин)-33 в активированных первичных культурах дермальных фибробластов человека мы демонстрируем, что ядерный IL(интерлейкин)-33 сдерживает раннюю конверсию в полноценный миофибробластический фенотип и поддерживает воспалительный фенотип. Истощение ИЛ(интерлейкин)-33 увеличивает экспрессию компонентов внеклеточного матрикса COL1Al, COL1A2, COL3A1, COL5A1 и трансгелина, но ингибирует экспрессию провоспалительного цитокина IL(интерлейкин)-6 и хемокины CXCL8, CCL7 и CCL8. Таким образом, наши результаты открывают новую перспективу для понимания роли IL-33 вфиброзразвития и тканевого гомеостаза.

Цистанхетрубчатыйпредотвращаетпочкаболезнь, нажмите здесь, чтобы получить образец

Полученные результаты

Миофибробласты являются доминирующим IL(интерлейкин)-33-экспрессирующие клетки в мышином UUO.В недавнем исследовании Чена и его коллег сообщалось об увеличении экспрессии IL.(интерлейкин)-33 и ST2 на 4-й день после односторонней обструкции мочеточника. Мы подошли к их эксперименту, собирая почки через 1, 7 и 21 день после UUO у мышей C57BL / 6J, наблюдая устойчивое увеличение IL.(интерлейкин)33 транскрипта мРНК (рис. 1А) и увеличенное количество клеток, экспрессирующих ядерный ИЛ.(интерлейкин)-33(рис. 1B). Мы также наблюдали транскрипцию и экспрессию белка коллагена I типа, что отражало развитиефиброз(рис. IC, D). Затем мы проанализировали фенотип ИЛ.(интерлейкин)-33-экспрессирующие клетки. Подобно Chen et al., мы заметили, что IL(интерлейкин)-33-субпопуляция экспрессирующих клеток, наблюдаемая на 2-й день, состояла преимущественно из a-SMA-позитивных миофибробластов, однако мы не обнаружили сигнала для ИЛ(интерлейкин)-33 ни в CD31-положительных эндотелиальных клетках, ни в CD45-положительных лейкоцитах (рис. IE и рис. S1). Мы также наблюдали ИЛ(интерлейкин)-33 в рассеянных перицитах (красная стрелка на рис. 1A, панель 21-й день). Парное иммуноокрашивание на PDGFRB, еще один маркер миофибробластов и перицитов, выявило обширную колокализацию (рис. IE).(интерлейкин)33 был колокализован с известными маркерами активации фибробластов, обнаружив, что экспрессия S100A4 (также известного как специфичный для фибробластов белок, FSP-1) скорее экспрессируется в эндотелиальных клетках капилляров и сосудов среднего размера (рис. IE). . Точно так же VIM/виментин также был обнаружен преимущественно в эндотелиальных клетках, в частности, в клубочках и сосудах среднего размера, и не было явной коэкспрессии в IL.(интерлейкин).33-положительные клетки (рис. 1E). Дальнейший анализ ИЛ(интерлейкин)-33-экспрессия миофибробластов на 7-й день показала, что они были в основном локализованы в коре и кортикомедуллярном соединении. и менее многочисленны в мозговом веществе и сосочках (рис. 1F).

Рисунок 1. Односторонняя обструкция мочеточника вызывает ИЛ(интерлейкин)Экспрессия -33 в почках мышей.

(A, C) Относительная экспрессия 33 и Collal в почках здоровых контрольных мышей (n=2) или мышей, подвергшихся ложной операции (n=1) или UUO через 1, 7 или 21 день. (n=3 в каждый момент времени). Уровни транскрипции определяли количественно, как подробно описано в материалах и методах, с помощью qRT-PCR. Точки данных представляют отдельных мышей. (B, DF) Репрезентативные микрофотографии срезов тканей, окрашенных на ИЛ.(интерлейкин)-33 [коричневый сигнал на (B) и (F), коричневый или бирюзовый сигнал на (E)], COL1 (коричневый сигнал на панели D), Asma (красный, E, F), CD31 (фиолетовый, E ), PDGFRB (бирюзовый, E), виментин (бирюзовый, E) и S100A4 (фиолетовый, E) в почках здоровых контрольных мышей или мышей, подвергшихся воздействию UUO2 дня (E), 7 дней (B, D, F) или 21 дня. (Б,Г) ранее. На панели （F） показаны различные области почки, отмеченные метками. Масштабные полосы=20 мкм.

Генетическая делеция I-33 оказывает незначительное влияние на прогрессирование фиброза при UUO, но способствует раннему усилению синтеза коллагена.Затем мы оценили предполагаемую роль IL(интерлейкин)-33 путем сравнения ответа на почечную обструкцию при ИЛ(интерлейкин)-33 и мыши дикого типа. В отличие от Чена и его коллег, которые сообщили о снижениифиброзразработка в ИЛ(интерлейкин)-33-мышей с дефицитом UUO, мы не наблюдали различий между IL(интерлейкин)33-- и WT'мыши в развитии фиброза на 7 или 21 день после UUO по иммуногистохимическому анализу коллагена I типа (рис. 2A, B). Тем не менее, анализируя фиброзный ответ на уровне транскрипции путем оценки транскриптов коллагена, мы наблюдали раннее значительное повышение уровня транскриптов коллаля до двукратного повышения и тенденцию к увеличению Col3al при сравнении IL.(интерлейкин)-33-дефицитные почки и почки дикого типа на 1-й день (рис. 2C, D). Поэтому мы решили воспроизвести экспериментальный план Chen et al. также анализируя образцы на 4-й день после UUO и включая мышей с дефицитом ST2-, сравнивая их с IL(интерлейкин)-33-мыши с дефицитом и WT. Эти анализы выявили значительное увеличение Colla2 в IL.(интерлейкин).33-Почки с дефицитом по сравнению с почками дикого типа на 4-й день, но без соответствующего увеличения в почках с -2-дефицитом ST (рис. 2E). Не было явных различий в уровнях транскриптов Collar и Col3al между генотипами на 4-й день, что указывает на более короткую продолжительность эффекта на эти гены (данные не показаны и рис. 2F).

Рисунок 2. Экспрессия коллагена в IL(интерлейкин)-33-/и почки дикого типа во время UUO.

(A, B) Репрезентативные микрофотографии срезов тканей, окрашенных на COL1 (коричневый) в почках мышей I-33-- и WT через 7 и 21 день после UUO. (C, D) Временная динамика, сравнивающая транскрипцию мРНК Collal и Col3al в Иллинойс(интерлейкин)-33--и мыши дикого типа, показаны здоровые контрольные мыши (n=2), ложнооперированные мыши (n=1) и мыши, подвергнутые UUO1,7 или 21 день назад (n{{ 7}} в каждый момент времени и для каждого генотипа). (E, F) Сравнение транскрипции Collal и Col3al в почках из IL(интерлейкин)Мыши -33-, ST2- и WT через 4 дня после имитации операции (n=5 на генотип) или UUO (n=10 на генотип). Уровни транскрипции количественно определяли с помощью qRT-PCR мРНК. Точки данных представляют отдельных мышей, столбцы показывают средние значения.*p<><><>

Иллинойс(интерлейкин)-33 ослабляет экспрессию профибротических генов на ранней стадии UUO.Повышенная экспрессия Collar и Col31 на 1-й день (рис. 1CD) и Colla2 на 4-й день (рис. 2E) при ИЛ(интерлейкин).33-мыши с дефицитом указывают на роль IL(интерлейкин)-33 при ранней реакции на травму. Мы изучили эту возможность, включив больше животных в расширенный эксперимент, наблюдая повышенные уровни транскриптов Collar, Colla2 и Col3al в IL.(интерлейкин).-33-мыши с дефицитом в 1-й день (рис. 3A-C).

Заметив, что ИЛ(интерлейкин)-33 в тканях почек мышей, подвергшихся UUO, локализованных в ядрах клеток, мы затем спросили, наблюдается ли измененная экспрессия генов при IL.(интерлейкин)-33-недостаточность мышей на 1-й день после UUO была обусловлена ​​высвобождением импрессионной, ядерной функции IL-33 или отсутствием внеклеточной IL(интерлейкин)-33. Мы рассмотрели последний вариант путем введения нейтрализующего антитела, нацеленного на ИЛ.(интерлейкин)-33 мышам дикого типа до UUO (рис. 3D). Это лечение не воспроизводило фиброгенный фенотип ИЛ.(интерлейкин)33 мутанта, что подтверждает гипотезу о том, что увеличение экспрессии профибротических генов наблюдается в отсутствие ИЛ.(интерлейкин)-33 было связано с отсутствием ядерной, а не внеклеточной ИЛ(интерлейкин)-33.

Рисунок 3.ИЛ(интерлейкин)-33 ослабляет экспрессию коллагенов на ранней стадии UUO.

(AC) Транскрипция Collal, Colla2 и Col3al в почках из IL(интерлейкин)Мыши -33-/ и WT на 1-й день после ложной операции (n=5 на генотип) или UUO (n=10 на генотип). (D) Транскрипция Col3al в почках мышей дикого типа, получавших анти-IL(интерлейкин)-33, контрольные антитела изотипа или носитель перед UUO. Почки собирали через 24 часа после UUO (n=10 на группу лечения) или ложной операции (n=5). Уровни транскрипции количественно определяли с помощью qRT-PCR. Точки данных представляют отдельных мышей, столбцы показывают средние значения.**p<><>

Транскриптомный анализ IL(интерлейкин)-33-дефицит почек показывает профиль реорганизации внеклеточного матрикса и образования коллагена.Для более детального исследования раннего ответа на UUO с помощью транскрипционного профилирования РНК выделяли из почек IL.(интерлейкин)-33-дефицитные мыши и мыши дикого типа через 24 часа после UUO. Попарный линейный дискриминант Фишера24 был использован для идентификации верхних 5 процентов (200 генов) дифференциально экспрессируемых генов между WT и IL.(интерлейкин)-33-дефицит почек, демонстрирующий четкое разделение между генотипами в анализе основных компонентов (рис. 4А). Нестрогий подход (стр.<0.05,><0.25, and="" fold="" change="">1.3) идентифицировал 134 подавленных и 46 активированных зондов в контрастной ИЛ.(интерлейкин)33-/- (n=5) по сравнению с WT (n=4) (Suppl. Table S1), среди последних особенно Col1a1, Col1a12 и Col3a1, а также связанный с миофибробластами Acta2 (рис. 4B) . Кроме того, генный онтологический анализ дифференциально экспрессируемых генов с использованием кластеризации аннотаций DAVID (таблица S2) выявил положительное обогащение для GO-терминов, связанных с коллагенами и ингибиторами протеазы, а также связывание PDGF и взаимодействие ECM-рецептор, и отрицательное обогащение для GO- термины, связанные с активностью оксидоредуктазы и натрий-независимыми переносчиками анионов.

Рисунок 4. Сводка транскрипционных различий между IL(интерлейкин)-33-мыши с дефицитом и дикого типа через 24 часа после UUO.

(A) Трехмерный график рассеяния показывает распределение образцов на основе анализа основных компонентов 200 генов. (B) Тепловая карта лучших генов с дифференциальной экспрессией.

Истощение фибробластов IL.33 способствует сигнатуре гена, согласующейся с повышенным отложением внеклеточного матрикса.Изучить функцию IL(интерлейкин)-33в доминирующем IL(интерлейкин)-33-экспрессируя клеточную популяцию пораженных почек, мы сместили культивируемые фибробласты человека в сторону фенотипа миофибробластов, подвергнув их воздействию IFN-γ и TGF- в течение 24 ч² после siRNA-опосредованного нокдауна I-33. Эффективный нокдаун был подтвержден как на уровне белка, так и на уровне транскрипта (рис. 5А) и сопровождался повышением уровней мРНК и белка профибротических COL3A1, COL5A1 и TAGLN (рис. 5B-D). Первоначальный анализ показал участие TGF- и побудил нас провести транскрипционный профиль объединенных культивируемых фибробластов человека, обработанных siRNA, до IL.(интерлейкин)-33 и активируется IFN-y (чтобы вызвать IL(интерлейкин)-33 экспрессия) или комбинацией IFN-y и TGF-B в течение 24 ч. Этот анализ идентифицировал 64 дифференциально экспрессируемых гена, ассоциированных с истощением IL.(интерлейкин)-33(прил. р<0.05 and="" fold="" change="">1.5, рис. 5E), 35 из которых были общими для обоих видов лечения цитокинами (рис. 5E, F). Кроме того, большинство генов демонстрировали сходные тенденции в обоих условиях, даже если они достигали выбранного порога дифференциальной экспрессии только в одном из них (рис. 5F), подтверждая предположение, что эффект ингибирования IL(интерлейкин)-33 был одинаковым в обоих случаях. Поэтому для анализа генной онтологии мы рассмотрели гены, которые по-разному экспрессировались IL.(интерлейкин)-33 истощение по крайней мере при одном условии и выполненная кластеризация аннотаций (таблица S3). В соответствии с нашими выводами в случае воздействия UUO, IL(интерлейкин)-33-недостаточность почек, мы обнаружили, что ингибирование IL(интерлейкин)-33 в фибробластах приводило к повышенной экспрессии генов, обогащенных GO-терминами, связанными с коллагеном и компонентами внеклеточного матрикса. Кроме того, гены, репрессированные истощением I -33, были обогащены GO-терминами, связанными с ответом на воспалительную стимуляцию. В совокупности наши данные показывают, что IL(интерлейкин)Экспрессия -33 в фибробластах служит для подавления активации транскриптов, связанных с отложением внеклеточного матрикса и активацией миофибробластов, в то время как воспалительные транскрипты в некоторой степени поддерживаются IL(интерлейкин)-33.

Рисунок 5. Истощение фибробластов IL(интерлейкин)-33обеспечивает сигнатуру гена, согласующуюся с повышенным отложением внеклеточного матрикса.

Экспрессия ИЛ(интерлейкин)33(A), экспрессия COL5A1(B), FIBL5(C) и TGLN(D) в фибробластах человека, обработанных IL(интерлейкин)-33-специфическую и скремблированную миРНК измеряли с помощью gRT-PCR (верхние панели) и вестерн-блоттинга (нижние панели). Столбики показывают средние значения 4 независимых экспериментов,*p<0.05.(e)venn diagram="" comparing="" differential="" expression="" of="" transcripts="" in="" response="" to="" the="" silencing="" of="">(интерлейкин)33 между контрольными и активированными клетками.

(F) Тепловая карта, показывающая дифференциально экспрессируемые транскрипты в ответ на миРНК-сайленсинг IL.(интерлейкин)-33 в контрольных и активированных ячейках.

Истощение ИЛ(интерлейкин)-33 в активированных фибробластах отдает предпочтение миофибробластическому фенотипу, а не воспалительному.Основываясь на наших наблюдениях, эффект I-33, по-видимому, сохраняется и становится более заметным с течением времени, несмотря на то, что IL(интерлейкин)-33 экспрессия снижается (рис. S2A, B), затем мы спросили, является ли основная ядерная функция IL(интерлейкин)-33 может быть скорее регуляцией дифференцировки фибробластов, чем прямой регуляцией профибротических эффекторов. При стимуляции покоящиеся фибробласты и другие мезенхимальные клетки развивают воспалительные и/или сократительные функции. Спектр между воспалительными фибробластами и сократительными миофибробластами остается плохо определенным и, вероятно, представляет собой скользящий переход, а не два различных фенотипа. Тем не менее, недавняя публикация Ohlund et al.23 сравнила ассоциированные с раком фибробласты (CAFs) с покоящимися звездчатыми клетками поджелудочной железы, идентифицировав воспалительный фенотип, названный iCAFs (совместно культивируемые в Transwells с секретирующими цитокины опухолевыми органоидами и экспрессирующие высокие и низкие уровни Иллинойс(интерлейкин)6 и SMA соответственно [IL(интерлейкин).dPa-SMAl]) и сократительный миофибробластический фенотип, myCAFs (IL(интерлейкин)6"a-SMA-, культивируемых в плотных монослоях), профилирование транскрипции и сравнение iCAF и mvCAF выявили характерные профили транскрипции. В то время как фибробласты с воспалительным фенотипом (iCAF) повышали экспрессиюинтерлейкиныи хемокины с миофибробластическим фенотипом (myCAFs) характеризовались усиленной экспрессией генов TGF-ответа и компонентов внеклеточного матрикса, включая коллагены3. Мы использовали этот набор данных для создания сигнатурных списков, состоящих из наиболее дифференциально регулируемых генов между фенотипами, и выполнили анализ обогащения набора генов в программном обеспечении GSEA. Результаты показали, что ингибирование I -33 поддерживает сократительный миофибробластический фенотип (myFBL) и ингибирует воспалительный фенотип (iFBL) в фибробластах человека (рис. 6A, B, таблица S4), что согласуется с результатами нашего анализа онтологии генов. . В этот момент мы обратили внимание на IL(интерлейкин)6 и CXCL8, цитокинов, которые были предложены в качестве маркеров для iCAF, обнаружив, что, хотя эти гены не соответствуют критериям дифференциальной экспрессии в нашем анализе транскриптома, снижение уровней их экспрессии может быть обнаружено с помощью qRT-PCR после истощения IL.(интерлейкин)-33(рис. 6C, D). Среди медиаторов воспаления, экспрессия которых снижена в нашем анализе транскриптома (рис. 5F), мы также подтвердили снижение экспрессии CCL7 и CCL8 в клетках, обработанных анти-IL.(интерлейкин)-33 миРНК (рис. 6E, F).

Эти наблюдения побудили нас исследовать, можно ли перенести наши результаты на модель UUO у мышей в первый день. Иммуногистохимический анализ (Fg.6G) и количественная оценка (рис. 6H) выявили индукцию IL.(интерлейкин)6-экспрессирующие клетки в почках дикого типа, аналогично наблюдениям Chen et al4 на уровне транскриптов. Напротив, мы наблюдали значительно уменьшенное количество IL.(интерлейкин)-6-положительные клетки в IL(интерлейкин)-33- мышей, что хорошо согласуется с нашими данными о человеческих фибробластах, полученных in vitro.

Рисунок 6. Истощение IL(интерлейкин)-33 искажает фибробласты в сторону миофибробластического фенотипа.

(A,B) Анализ обогащения набора генов показал, что клетки, обработанные IL(интерлейкин)-33-конкретные siRNA были положительно обогащены для сигнатуры миофибробластов (myFBL) по сравнению с воспалительными фибробластами (iFBL) и отрицательно обогащены для сигнатуры воспалительных по сравнению с покоящимися фибробластами. (CF) Транскрипция IL(интерлейкин)6(С), Иллинойс(интерлейкин)8(D), CCL7(E) и CCL8(F) в фибробластах человека, обработанных IL.(интерлейкин)33-специфическую или скремблированную миРНК измеряли с помощью gRT-PCR. Каждая точка данных показывает средние значения технических трех повторов из независимых экспериментов. (G) Репрезентативные микрофотографии срезов почек, собранных через 4 дня после фиктивной или UUO-операции от WT и IL.(интерлейкин)-33-/- мыши и иммуноокрашенные на ИЛ(интерлейкин)-6(коричневый сигнал). Масштабные полосы =100 мкм. (H) Слепое количественное определение сигнала, перечисляющее среднее количество положительных клеток в поле зрения при высоком увеличении. Отдельные точки данных показывают среднее количество положительных клеток у одной мыши, считая 3 поля с высоким увеличением в областях с наибольшей плотностью. *п<>

НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ, ЧТОБЫ ЧАСТЬ Ⅱ