Новая воспалительная дендритная клетка, которая является многочисленной и смежной с Т-клетками в почках пациентов с волчаночным нефритом

edmund.chen@wecistanche.com

Механизмы, которые способствуют локальному воспалительному повреждению во время обострения волчаночного нефрита (ВН), в значительной степени неизвестны. Понимание ключевых иммунных клеток, которые вызывают внутрипочечное воспаление, расширит наши знания о патогенезе заболевания и даст информацию для разработки новых терапевтических средств для лечения ВН. В этом исследовании мы проанализировалипочка биопсии пациентов с пролиферативным ВН и идентифицировали новую популяцию воспалительных дендритных клеток (infDC), которая высоко экспрессируется в ВН.почка, но минимально присутствует у здорового человекапочки.Во время агностической оценки экспрессии иммунных транскриптов впочкиу пациентов с пролиферативным ВН наиболее обильно сверхэкспрессированным транскриптом из изолированных клубочков был FCER1G, который кодирует гамма-цепь Fc-рецептора (FcR). Для идентификации типов клеток, экспрессирующих FcR, которые проникают впочкав ЛН проводились исследованияпочкабиопсии пациентов с активным ВН с использованием конфокальной иммунофлуоресцентной (ИФ) микроскопии. Это показало, что FcR в изобилии присутствует в перигломерулярной (PG) области мозга.почкаи в меньшей степени в тубулоинтерстиции (ТИ). Дальнейшее исследование поверхностных маркеров этих клеток показало, что это были FcR plus, MHC II plus, CD11c plus, CD163 plus, CD5, DC-SIGN plus, CD64 plus, CD14 plus, CD16 plus, SIRP plus, CD206, CD68, CD123. , CD3 и CD11bV, предполагая, что клетки были инфДК. Количественная оценка инфДК показала в среднем 10-кратно более высокий уровень инфДК в ЛУ.почкапо сравнению со здоровымпочки. Важно отметить, что IF идентифицировал CD3 плюс Т-клетки как соседние с этими инфДК в PG-пространстве ЛУ.почка,тогда как оба типа клеток минимально присутствуют в здоровомпочка.Таким образом, мы идентифицировали ранее неописанный ДК при волчанке.почкикоторые могут взаимодействовать с внутрипочечными Т-клетками и играть роль в патогенезеповреждение почекво время вспышки LN.

Ключевые слова:воспалительные дендритные клетки, волчаночный нефрит, почки, аутоиммунитет, адаптивный иммунный ответ, Т-клетки, СКВ

ВВЕДЕНИЕ 

Волчаночный нефрит (ВН) — тяжелое осложнение системной красной волчанки (СКВ), связанное со значительной заболеваемостью и смертностью. До 30 процентов пациентов с ВН прогрессируют до терминальной стадии.Болезнь почек(ЕСКД) (1). Не существует конкретных одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) методов лечения ВН, и современные методы лечения дают субоптимальную частоту ответа со значительной цитотоксичностью (2). Мы и другие исследователи изучали молекулярную патологиюпочкаво время активного ВН, чтобы лучше понять патогенезповреждение почекв ВН и пути, которые могут быть специально нацелены на лечение ВН.

CISTANCHE УЛУЧШИТ ФУНКЦИЮ ПОЧЕК / ПОЧЕК

В ходе независимой оценки экспрессии транскриптов в лазерных микродиссекцияхпочкаткани из клинических биопсий ЛУ мы обнаружили, что наиболее обильно сверхэкспрессированным транскриптом в клубочковом компартменте был FCER1G, кодирующий гамма-цепь Fc-рецептора (FcR). Предполагалось, что этот транскрипт отражает инфильтрацию иммунными клеткамипочкаво время активного ВН, и эта работа была предпринята для идентификации типов клеток, представленных сверхэкспрессированным FcR. Таким образом, в этом исследовании транскриптомные данные использовались для руководства исследованиями конфокальной иммунофлуоресценции (IF) для характеристики основных инфильтрирующих иммунных клеток, присутствующих впочкаво время вспышки LN. Мы идентифицировали уникальную популяцию FcR-экспрессирующих воспалительных дендритных клеток (infDC), которая находится в перигломерулярном (PG) пространстве и примыкает к CD3 плюс Т-клеткам, что указывает на потенциальное взаимодействие между популяциями infDC и T-клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальная дизайнЦелью данной работы было проведение транскрипционного анализа и IF напочкабиопсии, сделанные во время вспышки лимфатического узла, для выявления основных инфильтрирующих иммунных клеток, присутствующих впочкаво время вспышки LN. Транскриптомный анализ проводили напочкабиопсии, полученные во время вспышки ВН от 58 пациентов с пролиферативным (класс III/IV ± V) ВН в период с 2007 по 2013 год. Архивные биоптаты были использованы после завершения клинических испытаний. Выполняли микродиссекцию с лазерным захватом (LCM) и раздельно выделяли клубочки и тубулоинтерстиций (TI). Преимплантационный живой донорпочкабиопсии (n=10) служили здоровым контролем (HCs) и анализировались параллельно с биоптатами LN. Всех больных лечил один и тот же нефролог (АМ), а один опытный нефропатолог (ВА) читалпочкабиопсии. Совет по этике больницы Фернандес (Буэнос-Айрес) и институциональный наблюдательный совет Университета штата Огайо одобрили расследование инцидента.почкабиопсии.

Экстракция и анализ РНК

Биоптаты, использованные для транскриптомного анализа, фиксировали в формалине и заливали парафином (FFPE). Из парафиновых блоков из каждой биопсии вырезали срезы толщиной 10 мкм. После депарафинизации все доступные клубочки и TI были разделены с помощью лазерной микродиссекции (PALM MicroBeam, Zeiss Labs, Bernried, Germany), захвачены и расщеплены протеиназой K. ДНК была удалена ДНКазой. РНК осаждали, экстрагировали с помощью спин-колонок RNeasy MinElute (Qiagen, Редвуд-Сити, Калифорния, США) и элюировали водой, не содержащей РНКазы. Экспрессию транскрипта анализировали из 250 нг выделенной РНК с использованием платформы NanoString nCounter и панели транскриптов иммунологии человека GX [NanoString Technologies, Сиэтл, Вашингтон, США; (3–5)]. Панель иммунологии человека v2 состояла из 579 генов иммунного ответа, 6 генов положительного контроля и 6 генов отрицательного контроля. Полный список этих генов можно найти в более ранней публикации нашей группы (6). Для конфокальной микроскопии IF, замороженныепочкабиопсийные ткани четырех пациентов с активным ВН класса IV были получены из биорепозитория нефропатологии штата Огайо. В качестве HC использовали три замороженных образца нефрэктомии. Нефрэктомии выполняли у больных спочечныйклеточная карцинома. Ткань, полученную для анализа, отделяли от раковой ткани. Окружающая ткань, использованная для анализа, показала себя здоровой при гистологическом анализе. Нефрэктомия использовалась в качестве контроля, потому что требовались замороженные образцы, а в нашем биорепозитории не было замороженной донорской ткани трансплантата.

антитела

Все первичные антитела (Abs), используемые для IF, перечислены в дополнительной таблице 1. Антитела, использованные в этом исследовании, были подтверждены для IF либо с использованием лимфатических узлов человека, либо с использованием печени человека в качестве положительного контроля (данные не показаны). Используемые изотипические контроли представляют собой нормальный IgG кролика ChromoPure, нормальный мышиный IgG (Jackson ImmunoResearch, Уэст-Гроув, Пенсильвания, США), мышиный IgG1κ (BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США) и мышиный IgG2bκ (Jackson ImmunoResearch). Вторичными антителами, используемыми для IF, были козий F(ab')2 антимышиный IgG 488 (Jackson ImmunoResearch) и козий антикроличий IgG 568, козий антикроличий IgG 488 и козий антикроличий IgG 647 от Invitrogen (Thermo Fisher Научный, Уолтем, Массачусетс, США).

CISTANCHE УЛУЧШИТ ЗАБОЛЕВАНИЕ ПОЧЕК / ПОЧЕК

ИммунофлуоресценцияЗамороженная нефрэктомия и ВНпочкабиопсии делали срезы (срез 5 мкм на предметное стекло), фиксировали в 4-процентном параформальдегидфосфатном буферном растворе (PBS) в течение 15 минут при комнатной температуре и промывали PBS (с 0,02-процентным азидом натрия). Срезы блокировали 5-процентным молоком в PBS с последующей инкубацией в течение ночи с первичными антителами. После трех промывок PBS в течение 1 ч срезы инкубировали с флуоресцентно мечеными вторичными антителами еще в течение часа при комнатной температуре и окрашивали ядра DAPI (100 нг/мл) в течение 10 мин. Затем срезы покрывали Prolong Gold (Invitrogen) под покровными стеклами. Контрольные антитела относятся к списку изотипных антител с соответствующими вторичными антителами. Изображения были получены с использованием лазерного сканирующего конфокального микроскопа Olympus FluoView 1000, оснащенного (Olympus Corp., Токио, Япония) системой спектрального детектирования для более тонкого разделения флуорохромов (спектры FV1000) вместе с масляной иммерсионной линзой ×60 при комнатной температуре.

Количественная микроскопияУровень экспрессии infDC в LN и HCпочкиколичественно оценивали по изображениям, которые окрашивали на infDC с использованием анти-CD163. Общую интенсивность CD163 на основе экспрессии infDC рассчитывали с использованием программного обеспечения ImageJ (Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США). Интенсивность CD163 была получена после вычитания фоновой флуоресценции из изотипа плюс вторичные изображения, окрашенные Ab, и путем измерения площади и средней интенсивности флуоресценции зеленых пикселей, исходящих от infDC, с использованием антитела к CD163, как описано ранее (7).

Статистический анализДля транскриптомного анализа описательная статистика представлена ​​в виде среднего ± стандартное отклонение или в процентах. Для клинических переменных при необходимости применялись t-тесты, ANOVA или критерий суммы рангов Уилкоксона. Для категориальных клинических переменных использовали точный критерий Фишера. Для данных нанострун необработанные подсчеты были нормализованы к положительным контрольным всплескам, а затем преобразованы в log2. Чтобы уменьшить техническую погрешность, гены с уровнем экспрессии ниже среднего плюс два стандартных отклонения отрицательных контролей были отфильтрованы. К остальным транскриптам была применена квантильная нормализация (522 для клубочков и 502 для TI). Образцы клубочков анализировали отдельно от образцов TI. Чтобы определить дифференциальную экспрессию, экспрессию клубочков и транскриптов TI из LNпочкисравнивали с контролем. 1,5-кратное изменение и p < 0,05="" были="" необходимы="" для="" того,="" чтобы="" транскрипт="" считался="" дифференциально="" выраженным.="" для="" статистического="" анализа="" конфокальной="" микроскопии="" использовали="" двусторонний="" t-критерий="" стьюдента="" для="" сравнения="" двух="" групп,="" и="" значение="" p="">< 0,05="" считалось="" значимым.="" все="" анализы="" проводились="" с="" использованием="" origin="" pro="" версии="" 2020="" (originlab="" corp.,="" нортгемптон,="" массачусетс,="">

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Транскриптомный анализ биоптатов почек при обострении ВН выявил значительную гиперэкспрессию FCER1G в клубочках и TI при обострении ВНМы провели транскриптомный анализ РНК, выделенной из клубочков, и TI с использованием LCM изпочкабиопсии, полученные при пролиферативном обострении ВН (n=58). Преимплантационный живой донортрансплантацияпочкибиоптаты использовались в качестве HCs (n {{0}}). Транскриптомный анализ 579 иммунных транскриптов показал, что FCER1G является наиболее значительно сверхэкспрессированным гломерулярным транскриптом [изменение кратности (FC): 3,6, p-значение (p): 1E -10], но также был значительно сверхэкспрессирован в TI (FC: 1.7, p=0.001) при вспышке LN (рисунок 1 и дополнительная таблица 2) по сравнению с HC. Кроме того, экспрессия FCER1G коррелировала с гистологическим индексом активности заболевания NIH (r=-0,43, p=0,01).

Почечный FcR высоко экспрессируется при обострении лимфатического узла и ограничен перигломерулярной областьюЧтобы охарактеризовать иммунную клетку, которая экспрессирует FCER1G, мы проанализировали белок, кодируемый FCER1G, гамма-цепь рецептора Fc [FcR; (8)] у человека LN и HCпочкаткани с помощью IF-микроскопического анализа с использованием специфического антитела. Анализ IF показал, что FcR минимально экспрессируется в клубочках (идентифицируется с помощью маркера подоцитов, синаптоподина), но обильно экспрессируется в областях PG и TI в биоптатах fllare LN. Клетки, экспрессирующие FcR, по-видимому, имели типичный вид клеточного инфильтрата в области PG под микроскопом (рис. 2). Анализ IF показал, что во время вспышки LN область PG расширена из-за наличия клеточного инфильтрата, тогда как область PG тонкая и без клеточной инфифильтрации при HC, как видно на объединенных изображениях на рисунке 2.

и дополнительная фигура 4. Что наиболее важно, мы наблюдали слабую или нулевую экспрессию FcR в LN и HCs с использованием контролей изотипических антител, которые обрабатывались одновременно (данные не показаны). Эти данные подтверждают транскриптомные данные о том, что FCER1G кодирует FcR и обильно сверхэкспрессируется при пролиферативном LN flare.

Макрофагальные маркеры CD11b и CD68 не локализовались совместно с FcR в почках ЛУ человека

Основываясь на предыдущих описаниях интерстициальных лейкоцитов в лимфатических узлах (9–11), мы предположили, что клетка, экспрессирующая FcR, будет макрофагом. Мы дважды окрашивали срезы биопсии анти-FcR антителами FcR антителами против маркеров макрофагов CD68, CD206 и CD11b. Неожиданно, окрашивание на M2-специфические маркеры макрофагов, CD11b и CD206 [(12); данные не показаны], экспрессия в LN была от слабой до нулевой.почка.Тем временем панмакрофагальный маркер CD68 (13) проявлял гломерулярную экспрессию; таким образом, можно предположить, что макрофаги M1 были обнаружены в основном в клубочках. Однако окрашивание CD68 не совпадало с окрашиванием PG и TI для FcR (рис. 3). Эти данные демонстрируют, что экспрессирующие FcR клетки впочкане являются макрофагами. Хотя антитела против CD206, CD68 и CD11b давали слабый сигнал или отсутствовали в ЛУ.почка, они сильно окрашивали клетки Купффера в печени здорового человека, подтверждая надежность и специфичность антител [(14); данные не показаны].

FcR, совместно локализованный с обычным маркером дендритных клеток CD11c и MHCII в лимфатических узлах почки 

Чтобы определить, является ли клетка, экспрессирующая FcR, дендритной клеткой (ДК), была проведена трехцветная IF-микроскопия с использованием обычного маркера ДК CD11c и MHCII, который, как известно, высоко экспрессируется во всех ДК человека (15, 16), в дополнение к другие миелоидные клетки. Качественный анализ показал, что экспрессия FcR (помеченная с использованием анти-FcR-антитела, а затем вторичного антитела, конъюгированного с красителем Alexa-594 (Invitrogen), которое показало красную эмиссию при конфокальной микроскопии) колокализовалась как с CD11c, так и с MHCII. CD11c/MHCII были помечены с использованием антитела CD11c/MHC II, а затем вторичного антитела, конъюгированного с красителем Alexa-488 (Invitrogen), которое показало зеленый цвет эмиссии при конфокальной микроскопии (рис. 4). Колокализация привела к желтому цвету, отражающему присутствие как флуоресцирующего FcR (красный), так и CD11c/MHCII (зеленый), которые одновременно встречаются в одном и том же месте/клетке в измерении XY (рис. 4). Картина окрашивания CD11c совпадала с FcR (фиг. 4) в области PG и TI, и ни одно антитело не окрашивалось в клубочках. В соответствии с CD11c, MHCII (рис. 4, нижний ряд) также сильно окрашивался в PG, локализуясь совместно с FcR. Но, в дополнение к сильному окрашиванию PG, MHCII также продемонстрировал слабое окрашивание в клубочках, предполагая наличие слабо экспрессирующих MHCII гломерулярных клеток, которые могут быть миелоидными клетками.

FcR не локализуется совместно с маркером плазмацитоидных дендритных клеток CD123, но совместно локализуется с маркером дендритных клеток моноцитного происхождения DC-SIGN

Чтобы определить, какое подмножество FcR-экспрессирующих DC обнаруживается в области PG во время вспышки LN, ткань биопсии окрашивали на CD123, специфический маркер плазмоцитоидных DC (pDC) (16, 17). Клетки CD123 plus были обнаружены в области TI (рис. 5, верхний ряд), но отсутствовали в клубочках и в области PG ЛУ.почки. Клетки CD123 плюс были редкими, и окрашивание CD123 в TI не совпадало с окрашиванием FcR. Это говорит о том, что внутрипочечный FcR-экспрессирующий DC в LN не является pDC. Экспрессия сигнального регуляторного белка альфа (SIRP ) колокализована с FcR (рис. 5, средний ряд), что свидетельствует о том, что PG DC не являются миелоидными обычными DC 1 типа (cDC1) (16). Остальные возможности заключались в том, что PG DCs являются обычными миелоидными DCs 2 типа (cDCs2) или DCs, происходящими из моноцитов (moDCs). Чтобы различать эти подмножества DC, оценивали экспрессию DC-SIGN, маркера, специфичного для moDC. DC-SIGN колокализуется с FcR в области PG (рис. 5, нижняя панель), что позволяет предположить, что PG DC представляет собой moDC.

FcR совместно локализован с CD64, CD16 и CD14 в перигломерулярной области почки и подтвердил, что ДК 

Нашел в ЛНПочкаat Flare являются moDC. Чтобы подтвердить, что FcR-экспрессирующие DC являются moDC, их дополнительно охарактеризовали путем оценки присутствия дополнительных маркеров клеточной поверхности, о которых известно, что они присутствуют на moDC, включая CD64, CD16 и CD14. Каждый из этих маркеров был обнаружен в ЛУ.почкаткани и колокализованы с помощью FcR (дополнительная фигура 1).

FcR, совместно локализованный с ранее идентифицированным циркулирующим маркером infDC CD163, и экспрессия CD163 сверхэкспрессированы при LN Flare

Впоследствии был проведен анализ колокализации CD163 с FcR, чтобы определить, может ли наблюдаемая здесь популяция moDC быть недавно описанным циркулирующим infDC (18). Рисунок 6 подтверждает колокализацию CD163 (зеленый) с FcR (красный) в области PG (рисунок 6A) и TI (рисунок 6B), что убедительно свидетельствует о том, что подмножество moDC присутствует впочкаво время вспышки LN действительно являются инфДК. Поскольку infDCs не экспрессируют CD5 (18),почкаткань окрашивали на CD5. Хотя CD5-экспрессирующие клетки присутствовали впочка, они не были расположены в непосредственной близости от области PG и не колокализовались с FcR (дополнительная фигура 2), что позволяет предположить, что в этих infDC отсутствует экспрессия CD5. Количественно оценить разницу в infDC в LN и HCпочки, infDC количественно определяли путем измерения площади экспрессии CD163 после окрашивания моноклональным антителом против CD163 и средней интенсивности флуоресценции CD163. Использование 16 гломерулярных изображений из 4 вспышек LNпочки, и 18 гломерулярных изображений из трех HCпочки, мы обнаружили от 9- до 21-кратно более высокий уровень infDC в почках LN по сравнению с HC (рис. 6C). Поскольку ранее было показано, что infDCs экспрессируют CD11b (19, 20), мы дополнительно проанализировали LN человека.почкас крысиным mAb против CD11b человека (клон M1/70) вместе с антителом против CD163. В соответствии с предыдущими выводами в этой рукописи (рисунок 3), клон M1/70 давал сигнал от слабого до нуля в infDC (дополнительная фигура 3).

Воспалительные дендритные клетки присутствовали в непосредственной близости от Т-клеток при вспышке LN

волчаночный нефритпочкасрезы окрашивали маркером Т-клеток CD3 и антителами к FcR и CD163 для пространственной локализации Т-клеток и инфДК. Костенирование CD3 с маркерами infDC проводили двумя способами с использованием двух разных клонов антител против CD3 (мышиное mAb UCHT1 и кроличье mAb SP7) и 2 маркеров infDC. Окрашивание CD3 mAb UCHT1 и анти-FcR показало присутствие CD3 плюс Т-клетки, расположенные рядом с FcR плюс infDC в PG-области ЛУ.почка(Рисунок 7А). Окрашивание анти-CD163 плюс CD3 mAb SP7 (фиг. 7B) подтвердило, что infDC присутствовали в непосредственной близости от CD3 плюс Т-клетки в ЛН человека.почка.Хотя совместное окрашивание CD3 с маркерами infDC показало в основном дискретное окрашивание в зеленый и красный цвет для обоих типов клеток, в некоторых местах красное и зеленое окрашивание перекрывалось.

ОБСУЖДЕНИЕ В этом исследовании мы идентифицировали новую популяцию infDC, проникающую впочкана факеле ЛН. Эти инфДК проникают, локализуются в пространствах PG и TI, и их экспрессия была в 10- раз выше во вспышке LN.почкапо сравнению с ХК. Доказательства того, что они являются новыми, основаны на их поверхностных маркерах, таких как FcR plus, MHCII plus, CD11c plus, CD163 plus, CD5, DC-SIGN plus, CD64 plus, CD14 plus, CD16 plus, SIRP plus, CD206, CD68, CD123. , CD3 и CD11bV. Примечательно, что эти инфДК присутствовали в близком приближении к Т-клеткам в PG-области.почкаво время вспышки LN. Наблюдения этого исследования подтверждаются предыдущими исследованиями, в которых была обнаружена инфильтрация PG DC в различных мышиных моделях экспериментального гломерулонефрита (21, 22). Однако неясно, почему infDC оседают в пространстве PG. Предшествующая литература предполагает, чтопочечныйDC начинаются в клубочках и проходят от мезангиума через клубочковый пучок и лимфатические сосуды к дренирующим лимфатическим узлам, чтобы представить антиген Т-клеткам в PG (23). В этом случаепочечныйДК могут начинаться в клубочках, но к тому времени, когда ВН становится клинически очевидным, эти ДК уже выдвинулись из клубочка и обосновались в пространстве ЗГ. Ингибирующие сигналы могут затем высвобождаться и блокировать цитокины/хемокины, необходимые для дифференцировки моноцитов в инфДК, что объясняет отсутствие инфДК в клубочках ЛУ во время биопсии. В качестве альтернативы возможно, что хемотаксические факторы ДК высвобождаются непосредственно изпочечныйтубулярные клетки, привлекающие инфильтрирующие DC (24). Мы предполагаем, что оба они возникают в ответ на воспалительные стимулы, приводящие к накоплению PG и TI инфДК во время ВН.

Это исследование установило, что PG DC не являются плазмоцитоидными или обычными DC. Экспрессия маркеров моноцитов CD14, CD64 и CD16, о которых сообщалось ранее, подтвердила, что эти PG DC представляют собой moDC (16, 25, 26). При активном воспалении или инфекции моДК называют инфДК (27). Дальнейшая характеристика этих moDCs выявила уникальную популяцию infDC, ранее не описанную в лимфатических узлах человека. Примечательно, однако, что недавнее транскриптомное исследование иммунных клеток периферической крови у пациентов с СКВ выявило сигнатуру инфДК, которая представляла собой CD163 плюс, CD14 плюс и CD5h, что сходно с популяцией внутрипочечных инфДК, описанной здесь (18). Недавно была проведена обширная оценка иммунных клеток с использованием одноклеточной РНК-Seq изпочкабиопсии на вспышке LN (28). В этом исследовании было идентифицировано несколько кластеров моноцитов, причем один кластер моноцитов экспрессировал сигнатуру CD163 plus, CD14 plus, CD16 plus, CD64 plus и DC-SIGN plus, аналогичную описанной здесь infDC. Кроме того, считалось, что охарактеризованная линия моноцитов представляет собой субпопуляцию инфильтрирующих моноцитов, поскольку она была минимально экспрессирована у здоровых людей.почки. Хотя эти исследования IF не обеспечивают точного измерения уровня экспрессии маркера клона, и это может сделать идентификацию переходных стадий превращения моноцитов в DC dDFOult, эти результаты позволяют характеризовать и пространственную ориентацию для информирования дальнейших количественных исследований.

Эта новая популяция infDC также напоминает ранее описанные infDC из лимфатических узлов мышей, инфицированных Listeria (CD64 плюс CD11c плюс MHCII плюс ) (27), и слизистой оболочки кишечника при глютеновой болезни (29). InfDC также ранее были описаны в синовиальной жидкости человека при артрите у пациентов с ревматоидным артритом (20). Тем не менее, infDC, описанный в LNпочкаотличается от синовиальной жидкости infDC; в этом у них отсутствуют маркеры макрофагов CD11b и CD206, которые присутствуют в синовиальной жидкости infDC. Это говорит о том, что описанная здесь популяция инфДК отличается от инфДК, наблюдаемой по крайней мере при некоторых других аутоиммунных заболеваниях, и может быть уникальной для данного заболевания.почкаво время вспышки LN. Более того, более ранние исследования идентифицировали FcεRI [(19, 30); идентифицированы с использованием антитела против FcεRI (eBioscience, Inc., Сан-Диего, Калифорния, США) для сайта связывания антитела], чтобы быть лучшим маркером для различения infDC

РИСУНОК 6|Гамма-цепь Fc-рецептора совместно локализована с ранее идентифицированным маркером CD163 циркулирующих воспалительных дендритных клеток (infDC), и экспрессия CD163 сверхэкспрессируется в ВН человека по сравнению с HCs. (A) Три цветных изображения IF, которые представляют 3 человека LNпочкипоказывающая колокализацию CD163 зеленым цветом. РИСУНОК 6|(Fifirst) с FcR, отмеченным красным (посередине) в области PG. Во второй строке показана увеличенная часть изображений верхней строки, выделенных пунктирным квадратом. Третий столбец показывает слияние fifirst 2 вместе с окрашиванием ядер DIC и DAPI (синий). (B) Три цветных изображения IF, которые являются репрезентативными для 3 LN человека.почкипоказывает совместную локализацию CD163 зеленым цветом (сначала) с FcR красным цветом (в середине) в тубулоинтерстициальной (TI) области. (C) На гистограмме показана количественная оценка infDC на основе экспрессии CD163 с использованием зеленого цвета окрашивания анти-CD163 из 18 изображений G 3 разных HCs и 16 изображений клубочков из 4 разных образцов LN с использованием программного обеспечения ImageJ. Только площадь (график слева) и площадь × средняя интенсивность флуоресценции (график слева) CD163 (зеленый) были измерены и нанесены на график со средним значением ± стандартное отклонение. Данные были проанализированы с помощью непарного t-критерия (одностороннего) с использованием каждого измерения, и p-значения были указаны на гистограмме. РИСУНОК 7|строка изображает 3 цветных изображения IF, которые представляют три разных LN.почкидемонстрируя присутствие CD3 (маркер пан-Т-клеток, выделенный красным) рядом с CD163 (маркер infDC, выделенный зеленым), которые сильно увеличены из области PG. В нижнем ряду показаны объединенные изображения первых двух столбцов справа и объединенные изображения первых двух столбцов, а также окрашивание ядер ДИК и DAPI (синий цвет) слева. из макрофагов и cDC с помощью проточной цитометрии. Наши исследования показывают, что FcR, цитоплазматическая гамма-субъединица, через которую функционируют несколько FcR, включая FcεRI, Fc RI, Fc RIIIa и Fc RI, а также другие иммунные рецепторы, такие как GPVI, OSCAR и TREM (8), является надежным маркер для исследований IF на образцах биопсии пациентов. Вполне вероятно, что infDC в LNпочкаэкспрессируют FcεRI, аналогично Fc RI и Fc RIIIa (дополнительная фигура 1), поскольку присутствие FcR косвенно предполагает наличие множества рецепторов, включая FcεRI.

CISTANCHE УЛУЧШИТ ЗАБОЛЕВАНИЕ ПОЧЕК / ПОЧЕК

Важность характеристики внутрипочечного типа клеток, экспрессирующих CD163, усиливается недавними открытиями нашей группы, показывающими, что уровни CD163 в моче были значительно выше при активном ВН по сравнению с внепочечной СКВ или неактивной СКВ (31). CD163 в моче коррелировал с тяжестью заболевания и индексом гистологической активности. В то время как исследование Mejia et al (31). предположив, что CD163 происходит от макрофагов M2, теперь мы предполагаем, что CD163 мочи также происходит от infDC, подтверждая идею о том, что CD163 мочи является биомаркером, который отражает активность заболевания в ВН.

Что касается происхождения этих инфДК, экспрессия маркеров моноцитов позволяет предположить, что инфДК могут быть дифференцированы от инфильтрированных моноцитов впочкапри воспалении, вызванном различными аутоиммунными стимулами, в том числе иммунными комплексами. С другой стороны, наличие CD163 плюс CD14 плюс инфДК у пациентов с циркуляцией волчанки (18) предполагает, что инфДК из периферического кровообращения попадают впочкав ЛН. Возможно также, что оба механизма объясняютпочечныйинфдЦ. Механизмы, с помощью которых infDC взаимодействуют с Т-клетками во время ВН человека, в настоящее время неизвестны. Хотя совместное окрашивание CD3 вместе с маркерами инфДК показывает, в основном, дискретные популяции обоих типов клеток в непосредственной близости (рис. 7В), есть также свидетельства некоторого перекрытия, предполагающего образование иммунологических синапсов и взаимодействия между этими инфДК и Т-клетками в ЛУ.почка.Однако Т-клетки готовы мигрировать во вторичные лимфоидные органы; недавний отчет показал наличие иммунных агрегатов, организованных в виде третичных лимфоидных структур (TLS) у пациентов с ВН и мышиным ВН.почкикоторые напоминают лимфатические узлы по сигнатурам генов и клеточному составу (32). Это согласуется с предыдущим отчетом, в котором идентифицировались зародышевые центры с агрегатами Т- и В-клеток в лимфатических узлах.почка(33). Рассмотрение этих выводов в контексте выявления инфДК в LNпочкапредполагает, что infDCs в PG и TI могут быть важными факторами местного адаптивного иммунного ответа в почке LN. Хотя еще не ясно, являются ли эти Т-клетки резидентными Т-клетками или праймированными Т-клетками, известно, что infDC при различных болезненных состояниях обладают способностью запускать развитие основных субпопуляций Т-хелперных клеток, а именно Th1, Th2 и Th17 (20). , 34, 35). Хотя исследования in vitro предполагают, что инфДК участвуют в инициации и поддержании ответа Th17 (19), дальнейшие исследования нового ВНпочка яnfDC необходимы, потому что воспалительный стимул и тканевое микроокружение определяют функцию infDC in situ (36).

ВЫВОД

В заключение мы идентифицировали новую популяцию infDC, которая ранее не была описана в LN.почка.Эти infDCs находятся в области PG и примыкают к инфильтрирующим Т-клеткам. Наши результаты в сочетании с недавней литературой, определяющей циркулирующий CD163 плюс инфДК при СКВ и CD163 в моче как ценный маркер активности заболевания при ВН, позволяют предположить, что инфДК и их Т-клеточные партнеры могут играть ключевую роль в управлении локальным адаптивным иммунным ответом во время активного ВН. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить подмножества Т-клеток, расположенных рядом с инфДК, и понять механизмы, с помощью которых инфДК PG взаимодействуют с Т-клетками, чтобы вызвать локальное воспаление в ВН.