Новая стратегия скрининга активных компонентов Cistanche Tubulosa на основе анализа взаимосвязи спектр-эффект и сетевой фармакологии Ⅱ

3. Результаты и их обсуждение

3.1. Отпечатки пальцев ВЭЖХ

3.1.1. Проверка метода

Валидация метода ВЭЖХ показала, что относительное стандартное отклонение (RSD) точности, воспроизводимости и стабильности метода составляет менее 2,85 процента для относительной площади пика (n = 11) и 0,77 процента. для относительного времени удерживания (n = 11). Точность того же раствора образца оказалась в диапазоне 0.05–{{10}}.77 процентов для относительного времени и 0.28– 2,70 процента для относительной площади общих пиков. Воспроизводимость эксперимента находилась в пределах 0.03–0.20% для относительного времени и 0,23–2,59% для относительной площади общих пиков. Стабильность образцов составила 0,09–0,24 % по относительному времени удерживания и 0,75–2,85 % по относительной площади общих пиков. Эти результаты показали, что установленный отпечаток пальца был удовлетворен. Линейные зависимости для генипозидовой кислоты,эхинакозид, актеозид, тубулозид А, иизоактеозидпоказаны в таблице S4. Значение R-квадрата равно 1,0000, что указывает на хорошую линейность. Результаты извлечения образцов показали, что средние извлечения генипозидовой кислоты, эхинакозида,актеозид, тубулозид А, иизоактеозидсоставляли 100,37 % , 103,59 % , 98,46 % , 100,81 % и 101,19 % , а относительное стандартное отклонение извлечения проб было менее 2,68 % .

Нажмите здесь, чтобы получить более подробную информацию об активных компонентах Cistanche

3.1.2. Площадь пика (PA) и относительное время удерживания (RRT)

Эталонные отпечатки пальцев и отпечатки пальцев ТМ, WE и HR из 11 партий C. Tubulosa представлены на рисунке 2. Одиннадцать пиков, которые продемонстрировали хорошее разделение и разрешение, были идентифицированы как общие пики среди HM, WE и HR. Пять стандартных соединений были идентифицированы как генипозидовая кислота (A2),эхинакозид(A8),актеозид (A9), тубулозидА (А10) иизоактеозид(А11). Стандартный состав,эхинакозид, который присутствовал на всех хроматограммах (среднее время удерживания 12,86 мин) с подходящей площадью пика и хорошей стабильностью, был выбран в качестве эталонного пика и использован для расчета относительного времени удерживания (RRT) других десяти общие пики. RRT этих различных форм находятся в диапазоне 0,16–1,51. PA и коэффициент дисперсии (CV процентов) этих общих пиков перечислены в таблицах S5–S7. Исходя из данных, процентные значения CV для PA в различных формах составляют 25,78% -142,02%, 23,36% -150,38% и 28,91% -112,78% для HM, WE и HR соответственно. Эти результаты показывают значительные различия в концентрации каждогоЦистанхе трубчатаясоединения различных форм. Отпечатки пальцев HM, WE и HR показаны на рисунке 3.

Рисунок 2. ВЭЖХ-отпечатки стандартных образцов.

3.1.3. Содержание HM, WE и HR

Пять стандартных компонентовС. тубулозабыли измерены. Содержание основных компонентов показано в табл. 1. Сравнение ТМ, ВЭ и ГВ показано в табл. 2 и на рис. 4. ФГ C. Tubulosa биологически активны, но термочувствительны. Термочувствительные компоненты, растворяющиеся в воде, могут быть эффективно извлечены разумным методом. Как правило, траву цистанхе экстрагируют водой, а затем выпаривают в концентрированный раствор для последующего химического анализа [26, 27, 30]. После экстракции и концентрирования использовали технологию распылительной сушки, и процедура была изменена по сравнению с предыдущей статьей. Из жидкого пара быстро удаляли воду, после чего получали сухие экстракты сырья из растений. На этом этапе добавление мальтодекстрина считается обычным носителем для улучшения дисперсии и увеличения времени хранения. Затем в ходе ряда производственных процессов травяные растения прессовали в гранулы формулы с добавками. Этот этап добавления вспомогательных веществ не был включен в эксперимент. Вообще говоря, наш производственный процесс включает экстракцию, концентрирование и сушку распылением, как описано в разделе 2.2, параллельно с процессом производства гранул рецептуры. Для производства этих полуфабрикатов необходимо выполнить три вышеуказанных шага. Процедура формирования РВ включает концентрирование и распылительную сушку, при которых легко происходит потеря термочувствительных компонентов, а ТВ получают после экстрагирования и сушки ТМ. Мы задаемся вопросом, возможно ли, чтобы активные компоненты оставались в HR. Согласно нашим результатам, содержание вербаскозида значительно снижалось при переходе от HM к WE и HR (соответственно). Термическую стабильность вербаскозида исследуют, наблюдая за изменениями площади пика с помощью ВЭЖХ в процессе нагревания. После нагревания в течение 4 ч остается 41,6% вербаскозида. Это указывает на термочувствительность вербаскозида [31]. Изоактеозид, тубулозид А и эхинакозид в WE оставались стабильными после сложных процедур обработки. В процессе длительной сушки накопление ФГ значительно уменьшилось, что может быть связано с термической деструкцией этих термочувствительных компонентов [32]. По другим целевым компонентам HR и WE существенно не отличались, за исключением вербаскозида. Наше понимание этой разницы позволит нам в будущем разработать более качественные стандарты для травяных отбросов и продвигать их в продукты.

Таблица 1. Состав 11 партий C. Tubulosa

Таблица 2 Сравнение содержания основных компонентов (n = 11).

,

Рис. 4. Определение содержания пяти компонентов из разных форм (n = 11). , нс: не имеет значения.

3.1.4. Анализ сходства отпечатков пальцев

Было оценено сходство между тремя группами C. Tubulosa. Значения сходства растительный материал-водный экстракт, растительный материал-растительный остаток и водный экстракт-растительный остаток находились в диапазонах 0,943–0,994, 0,847–{ {9}},995 и 0,938–1,000 соответственно (табл. 3).

Таблица 3. Сходства HM-WE, HM-HR и WE-HR для 11 партий C. Tubulosa.

3.2. Результаты теста антиоксидантной активности

Антиоксидантная активность различных форм C. Tubulosa была определена с использованием анализов DPPH и поглощающей способности, и соответствующие результаты представлены на рисунке 5. В таблице S8 диапазоны для DPPH и результатов анализа поглощающей способности были следующие: {2}}.04–37,80, 0,98–843,90 и 0,32–27,65 мг/мл для трех различных форм среди 11 партий C. Tubulosa. В трех тестах на антиоксидантную активность HM и WE показали близкую ингибирующую активность, тогда как HR показали самую слабую ингибирующую активность.

Было обнаружено, что WE, высушенные распылением, проявляют значительную активность даже при низких концентрациях. В предыдущем отчете указывалось, что Vernonia amygdalina WE, высушенная распылением, достигла 50-процентного ингибирования очистки при 0,17 мг/мл [33]. Применение длительного времени экстракции и высоких температур является палкой о двух концах. С одной стороны, увеличение времени экстракции и температуры на входе в распылительную сушку повышает выход и эффективность. Более того, экстракты обладают сильной антиоксидантной активностью и более высокими концентрациями биологических компонентов, чем эти растения [34]. С другой стороны, чрезмерно горячий воздух на входе разрушает биологически активные соединения. Такие повышенные температуры воздуха на входе приводили к потере антиоксидантной активности экстракта Bidens pilosa и объяснялись снижением содержания фенольных соединений [35]. Настоящие результаты согласуются с вышеупомянутым отчетом. Например, WE в S6 проявлял более слабую способность ингибировать радикалы, чем как HM, так и HR. Кроме того, HR в S5 продемонстрировал более сильную способность поглощать DPPH и супероксид-анион, чем HM и WE. Структура ФГ состоит из гликозидных связей и ацетильных групп, которые легко гидролизуются ферментативным действием или разлагаются при высоких температурах. Эти реакции могут объяснять снижение содержания некоторых основных компонентов при крупномасштабном производстве. Однако гидролиз или изомеризация некоторых компонентов может ускорить синтез других компонентов. Такие превращения обычны при обработке трав цистанхов [36–38]. Водорастворимость PhG означает, что большинство биологических компонентов можно использовать путем водной экстракции. Утверждение о том, что большинство активных компонентов остается в ВЭ, существует на протяжении десятилетий, поэтому кажется разумным предположить, что влажные остаточные материалы можно выбросить после экстракции. Однако считать ГО C. Tubulosa отходами некорректно. Исследователи отмечают, что PhG нестабильны и подвержены ферментативной или гидролитической деградации [39]. Реакции гидролиза или изомеризации, которые способствуют снижению содержания биологических ингредиентов в фитопрепаратах во время обработки, могут в то же время открывать новые возможности для использования HR. Путем преобразования традиционных методов экстракции лекарственные остатки могут быть разработаны и использованы более эффективно. Ферментативный гидролиз проводили для превращения остатка женьшеня Panax в моносахара. Увеличился выход полисахаридов и гинсенозидов, таких как сахар, янтарная кислота, полисахариды женьшеня и гинзенозиды [40]. Остатки Sophora flavescens реэкстрагируют ультразвуковыми волнами с этилацетатом [41]. Обновленные технологии утилизации растительных остатков обобщены Huang et al. [42].

Основываясь на результатах PLSR и BCA, пять верхних пиков различных форм были проверены с использованием анализов DPPH, супероксид-анионов и гидроксильных радикалов для определения наиболее важных пиков. Результаты проиллюстрированы на диаграмме Венна (рис. 7). A2, A6, A8 и A10 являются общими пиками, которые являются общими для HM, WE и HR (рис. 7(a) и 7(c)) в анализах удаления супероксидных анионов и гидроксильных радикалов, тогда как HM, WE и HR не имеет пиков анализа DPPH. Между тем, модели BCA показывают, что A1, A2, A3 и A6 являются общими пиками, общими для HM, WE и HR (рис. 7 (d)–7 (f)). Примечательно, что перекрытия на диаграмме Венна указывают на то, что модель BCA кажется более подходящей, чем модель PLSR, поскольку первая демонстрирует большее повторение. Коэффициенты модели ВСА и значения IC50 антиоксидантной способности анализировали с помощью RDA. Как RDA показано на рисунке 8, A1, A3 и A6 из HM и HR положительно связаны с антиоксидантными индексами, за исключением того, что A3 отрицательно связан со способностью поглощать гидроксильные радикалы. A1 и A6 из ЗЕ имеют сильную корреляцию с DPPH и анионом супероксида. Пики A6, отмеченные для различных форм, демонстрируют самую сильную связь с DPPH, супероксидным анионом и гидроксильными радикалами. A1 и A3 также демонстрируют аналогичную связь.

Рисунок 7

Диаграммы Венна модели PLSR и BCA: ( а ) анализ DPPH. (b) анализ очистки. (c) анализ очистки был проанализирован с помощью модели PLSR. (d) анализ DPPH. (e) анализ очистки. (f) анализ очистки был проанализирован с помощью модели BCA. Перекрывающийся участок был общим пиковым осколком для HM, WE и HR.

3.4. Сетевой фармакологический анализ

3.4.1. Строительство сети ТТ

Всего из базы данных GeneCards и базы данных OMIM было получено 4359 мишеней, связанных с антиоксидантной активностью. В то же время активные компоненты были проверены из базы данных TCMSP и базы данных SwissTargetPrediction. Затем 198 целей были собраны и стандартизированы через базу данных UniPort. Было выявлено 159 генов-мишеней, общих для активных компонентов и заболеваний, связанных с антиоксидантами (см. рис. S1). Сеть CT была построена для иллюстрации корреляции между соединениями и ключевыми генами-мишенями (рис. 9).

Рисунок 9 Сеть ТТ. Сеть показала корреляцию между активными компонентами и ключевыми генами-мишенями.

3.4.2. Построение сети PPI и проверка ключевых целей

PPI визуализировали с использованием базы данных STRING (рис. 10). Сеть включала 159 узлов и 2528 ребер. Во всей сети взаимодействия соединительные компоненты или узлы с большим количеством точек-мишеней могут быть ключевым компонентом или геном-мишенью, играющим антиоксидантную роль у C. Tubulosa. Результаты были загружены и введены в Cytoscape для визуализации. Чем выше значение DC, тем темнее цвет, и чем больше суммарное значение оценки, тем толще край. Мы обнаружили, что серин/треонин-протеинкиназа RAC-альфа (AKT1), интерлукин -6 (IL6), фактор некроза опухоли (TNF) и фактор роста эндотелия сосудов A (VEGFA) были расположены в центре (рис. 11), что указывает на то, что они были ключевыми мишенями, когда активные компоненты оказывали антиоксидантное действие. Сообщается, что эхинакозид снижает митохондриальную дисфункцию посредством регуляции митоген-активируемых протеинкиназ (MAPK) и AKT и их фосфорилированных форм [43]. Исследователи предположили, что противодиабетический эффект гликозидов C. Tubulosa может быть связан с антиоксидантной активностью PhG за счет подавления провоспалительных цитокинов, таких как IL -6 и TNF- [44]. Кроме того, эхинакозид может нарушать рост раковых клеток яичников, подавляя экспрессию VEGFA для ингибирования ангиогенеза [45], что тесно связано с системой АФК, поскольку АФК индуцирует экспрессию передачи сигналов VEGF [46].

Рисунок 10 Сеть PPI.

3.4.3. Анализ обогащения и создание сети CTP

Потенциальные антиоксидантные соединения действовали на многочисленные биологические функции, включая BP, CC и MF. На рисунке 12(а) показаны 10 основных путей. Прогнозируемые мишени из сети PPI в основном реагировали на многие биологические процессы, такие как органические циклические соединения, ксенобиотические стимулы, неорганические вещества, уровни кислорода и положительную регуляцию движения клеточных компонентов. Анализ клеточного компонента показал, что гены в основном связаны с мембранным рафтом, внеклеточным матриксом, просветом секреторных гранул, комплексом регуляторов транскрипции и апикальной частью клетки. Эти мишени также участвуют во многих молекулярных функциях, включая связывание ДНК-связывающего фактора транскрипции, активность гомодимеризации белка, специфичное связывание белкового домена и связывание рецептора цитокинов.

Рисунок 12 Анализ обогащения: (a) Анализ обогащения GO. (b) Анализ обогащения KEGG.

Чтобы исследовать биологические функции этих основных узлов, был проведен анализ обогащения путей. По результатам обогащения KEGG была построена пузырьковая диаграмма, показывающая 20 основных путей. Чем больше было пятно, тем больше генов было включено в путь. Как показано на рисунке 12(b), ключевые пути C. Tubulosa были связаны с путями при раке, липидном и атеросклерозе, сигнальным путем AGE-RAGE при диабетических осложнениях, химическим канцерогенезом — активацией рецептора и сигнальным путем MAPK. Было исследовано влияние C. Tubulosa на апоптоз и клеточный окислительно-восстановительный гомеостаз. Данные свидетельствуют о том, что C. Tubulosa может быть многообещающим кандидатом для лечения рака толстой кишки [47]. Экстракт C. Deserticola обнаруживается у пожилых людей [48].

Фигура 13 иллюстрирует корреляцию между путями и связанными с ними мишенями и взаимосвязь между перекрывающимися генами-мишенями и биологически активными компонентами C. Tubulosa. Было создано глобальное представление сети CTP, которое состояло из 12 ингредиентов, 159 целей и 20 путей. Большинство мишеней были общими для активных соединений-кандидатов. Эти активные ингредиенты-кандидаты с высокой степенью взаимосвязи были ответственны за высокую взаимосвязанность сети CTP, особенно кверцетин (степень = 131). Большинство мишеней, таких как AKT1, IL6, TNF и VEGFA, были сопоставлены с путями KEGG, связанными с путями при раке.

Рисунок 13 Сеть CTP.

4. Выводы

В этом исследовании мы в первую очередь исследовали сложные ситуации при рассмотрении взаимосвязей спектр-эффект между HM, WE и HR.С. тубулоза. Отпечатки пальцев ВЭЖХ иантиоксидантные анализыбыли использованы для выявления различий между Hs, WEs и HRsС. тубулоза. По данным ВЭЖХ, 11 пиков были общими среди 11 партий Hs, WEs и HRs. генипозидовая кислота,эхинакозид, вербаскозид, тубулозид А, иизоактеозидбыли идентифицированы среди этих пиков. Содержание этих пяти компонентов было определено. Кроме того, антиоксидантное действиеС. тубулозаHs, WEs и HR варьировались из-за изменений в химическом составе, вызванных сложными производственными условиями. Основываясь на разнообразных статистических моделях, исследование соотношения спектр-эффект показало, что пик A6 может быть наиболее важным компонентом среди трех формС. тубулоза. Исследование было основано на сетевой фармакологии для изучения потенциальных механизмовС. тубулозанаантиоксидантпутем скрининга соединений, прогнозирования ключевых целей, построения сетей и проведения анализа обогащения. Наши результаты обеспечивают теоретическую основу для переработки растительных остатков и потенциалС. тубулозав лечениизаболевания, связанные с антиоксидантами.