Трансгенная модель раскрывает роль Клото в развитии рака поджелудочной железы и прокладывает путь для новой терапии на основе Клото

Пожалуйста, нажмитеoscar.xiao@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

Простое резюме:Мы стремились изучить роль антивозрастного белка klotho и его секретируемой изоформы UK в развитии рака поджелудочной железы. Три модели in vivo, включая новую генетическую модель мыши и биоинформатические анализы, показали, что klotho является супрессором опухоли при аденокарциноме протоков поджелудочной железы, и выявили уникальный паттерн гиперметилирования ДНК klotho в опухолях поджелудочной железы. Эти результаты обладают значительной прогностической ценностью и позволяют предположить, что она может служить терапевтическим средством при аденокарциноме протоков поджелудочной железы.

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Резюме: Klotho представляет собой антивозрастной трансмембранный белок, который может отщепляться и функционировать как гормон. Накопленные данные указывают на то, что klotho является супрессором опухоли при широком спектре злокачественных новообразований, и обозначают субдомен KL1 как активную область белка для этой активности. Мы стремились изучить роль klotho как супрессора опухоли при аденокарциноме протоков поджелудочной железы (PDAC). Биоинформатический анализ наборов данных Атласа генома рака (TCGA) выявил корреляцию между выживаемостью пациентов с PDAC, уровнями экспрессии klotho и метилированием ДНК, а также продемонстрировал уникальный паттерн гиперметилирования klotho в опухолях поджелудочной железы. Эффекты klotho и KL1 in vivo исследовали с использованием трех моделей мышей. Используя новую генетическую модель, сочетающую нокдаун klotho поджелудочной железы с мутацией Kras, отсутствие klotho способствовало образованию PDAC и снижению выживаемости мышей. В модели ксенотрансплантата введение вирусных частиц, несущих скай, сплайсированную изоформу клото, содержащую домен KL1, ингибировало опухоли поджелудочной железы.купить цистанхеНаконец, лечение растворимым небом продлевало выживание Pdx1-Cre; КрасГ12Д/плюс ; Мыши Trp53R172H/plus (KPC), модель, как известно, воспроизводит человеческий PDAC.биофлавоноиды,В заключение, это исследование предоставляет доказательства того, что klotho является супрессором опухоли при PDAC. Кроме того, эти данные предполагают, что уровни экспрессии klotho и метилирования ДНК могут иметь прогностическое значение у пациентов с PDAC, и что введение экзогенных sKL может служить новой терапевтической стратегией для лечения PDAC.

Ключевые слова:клото; КЛ1; сКЛ; супрессор опухоли; панкреатический рак; PDAC

1. Введение

Рак поджелудочной железы относится к числу наиболее агрессивных видов рака, при этом 5-годовая выживаемость составляет 9 процентов . Заболеваемость и смертность растут: только в США в 2021 году ожидается 60 430 новых случаев и 48 220 смертей[1]. Аденокарцинома протоков поджелудочной железы (PDAC) составляет 85-90 процентов всех злокачественных новообразований поджелудочной железы. Текущие модели указывают на его развитие от доброкачественной интраэпителиальной неоплазии поджелудочной железы (PanlN) 1-3 до инвазивной карциномы наряду с приобретением генетических мутаций. Активация Kras считается первым шагом к малигнизации [2] и на моделях мышей приводит к развитию PanIN к 9 месяцам [3]. Хотя явный PDAC у этих мышей встречается редко, в модели KPC, сочетающей мутацию Kras с потерей опухолевого супрессора p53 [4], PDAC обычно развивается в возрасте 3-6 месяцев [5].

Цистанхе может омолаживать

Klotho (здесь используется как klotho) представляет собой трансмембранный белок I типа, участвующий в регуляции старения [6]. У мышей дефицит klotho приводит к синдрому, напоминающему ускоренное старение, тогда как сверхэкспрессия klotho увеличивает продолжительность жизни [7,8]. Внеклеточная область klotho состоит из двух гомологичных доменов, KL1 и KL2, которые могут отщепляться от мембраны и действовать как циркулирующие гормоны [9-11]. Секретируется вторая, дифференциально сплайсированная изоформа klotho (UK). Sky идентичен KL1, плюс 15 дополнительных аминокислот на С-конце. Описаны различные активности klotho, в том числе активация передачи сигналов фактора роста фибробластов (FGF)23 [12,13], регуляция переходного рецепторного потенциала катионных каналов члена V подсемейства (TRPV)5 кальциевых каналов [14,15] и ингибирование пути инсулина и инсулиноподобного фактора роста (IGF)-1 [8,16,17].

Klotho экспрессируется преимущественно в почках и головном мозге, а также в различных тканях, включая экзокринную и эндокринную поджелудочную железу [7,17-20]. Его физиологическая активность в поджелудочной железе еще не определена; однако есть доказательства его участия в регуляции гомеостаза глюкозы. Klotho индуцирует выработку и секрецию инсулина in vitro и in vivo, ослабляет чувствительность к инсулину у мышей и истощает островки поджелудочной железы у пациентов с сахарным диабетом 2 типа (СД2) [8, 19-22]. Klotho является мощным супрессором опухолей при многих злокачественных новообразованиях, включая рак желудочно-кишечного тракта [16,17,23-30]. Он эпигенетически замалчивается при раке, и как klotho, так и Karl снижают рост раковых клеток in vitro и in vivo [16,17,23,25,26,28,31-33]. При раке поджелудочной железы снижение активности klotho коррелирует с выживаемостью пациентов. In vitro klotho снижает рост раковых клеток поджелудочной железы и ингибирует пути IGF-I и bFGF [17,34].

В этом исследовании мы стремились расшифровать роль klotho как супрессора опухоли при PDAC, используя три модели in vivo. Используя новую генетическую модель, мы показали, что нокдаун klotho поджелудочной железы способствует развитию PDAC и снижает выживаемость мышей с мутацией Kras. Во второй модели мы показали, что введение вирусных частиц, несущих sKL, ингибирует опухоли поджелудочной железы в модели ксенотрансплантата. Наконец, лечение растворимым рекомбинантным скай увеличивало выживаемость мышей КРС. Эти результаты демонстрируют роль кото как важного игрока в развитии PDAC и предлагают klotho в качестве терапевтической стратегии для лечения пациентов с PDAC.

2. Материалы и методы

2.1. Анализ TCGA с использованием браузера UCSC Xena

Наборы данных экспрессии генов RNAseg (IlluminaHiSeq) и метилирования ДНК (Methylation450k) для когорты The Cancer Genome Atlas (TCGA) Рак поджелудочной железы (PAAD) были изучены с использованием браузера Xena Калифорнийского университета в Санта-Круз (UCSC) (http://ксена.ucscedu/, по состоянию на 19 июля 2020 г.)[35].цистанхС помощью Xena Browser была проанализирована общая выживаемость и интервал без прогрессирования у пациентов с раком поджелудочной железы в соответствии либо с экспрессией klotho, либо с метилированием ДНК KLOTHO, и были созданы графики Каплана-Мейера. Дублированные индивидуальные данные удалялись путем фильтрации только первичных опухолей. Данные об экспрессии генов, представленные в единицах log2(x плюс 1), были разделены на две группы в соответствии с медианой; Данные по метилированию ДНК были разделены на две группы в соответствии с нижним и верхним квартилями.

Для сайт-специфического метилирования ДНК KLOTHO дополнительно анализировали образцы с низким или высоким уровнем экспрессии klotho, что определялось нижним или верхним квартилями соответственно. Рассчитывали значения 36] для каждого сайта метилирования и корреляцию с экспрессией klotho в соответствующем образце исследовали с помощью коэффициента корреляции Пирсона (r).

2.2. Химические вещества, антитела и конструкции

Химические вещества, использованные в этом исследовании, включали растворимый вариант сплайсинга человека klotho, содержащий аминокислоты34-549(ski-домен; регистрационный номер BAA24941.1) с уникальной последовательностью 15-аминокислот на С-конце({ {6}}; PeproTech Inc, Роки Хилл, Нью-Джерси, США); глюкоза (Флорис, Мисгав, Израиль), человеческий инсулин (Актрапид; Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Дания) и люциферин (122799; PerkinElmer, Уолтем, Массачусетс, США).

Антитела, использованные в этом исследовании, включали контроль изотипа крысиного IgG2a (02-9688; Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) и анти- -актин (A5441; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). . Антитела против klotho, направленные против домена KL1 (KM2076), были любезным подарком от Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Токио, Япония.

2.3. Производство и очистка вектора AAV

Векторы AAV9, нулевой пустой вектор и скай (содержащие секретируемую изоформу сплайс-варианта klotho, регистрационный номер BAA24941.1) были получены и очищены на объектах уровня биологической безопасности 2 United Mixta UAB-VHIR и в подразделении по производству векторов (VPU). , векторы были созданы с использованием системы тройной трансфекции в клетках HEK293. Через 48 ч векторы AAV собирали, обрабатывали бензоназой, очищали в градиенте йодиксанола и титровали с использованием PicoGreen [37]. Экспрессия трансгена управлялась промотором CMV, как описано ранее [37].

2.4. Содержание животных

Содержание мышей и эксперименты проводились в Медицинском центре Сураски (Тель-Авив, Израиль) и в соответствии с правилами и стандартами Комитета по уходу и использованию животных Медицинского центра Сураски.

Все штаммы мышей, использованные для трансгенных моделей, имели смешанный фон C57BL/6 и JVB/NJ. Мыши Pdx1-Cre, LSL-KrasG12D/ plus и LSL-Trp53R172H/ plus t были любезно предоставлены доктором Зивом Гилом (Технион-Израильский технологический институт в Рамбаме, Хайфа, Израиль).

2.5. Модели мышей KLOTHO Knockdowm для поджелудочной железы

Чтобы нацелить нокдаун KLOTHO на поджелудочную железу мыши, были созданы мыши, несущие аллели floxed KLOTHO (KLlox), как описано ранее [38].цистанчеМышей Keflex/flox скрещивали с мышами Pdx1-Cre, экспрессирующими рекомбиназу Cre, контролируемую промотором Pdxl, в результате чего получали Pdx1-Cre; KL-/-мыши. Нокдаун KLOTHO поджелудочной железы был подтвержден с помощью иммуногистохимии и уровней мРНК, как описано ниже.

Для получения мышей, несущих контролируемый промотором Pdxl нокдаун KLOTHO и мутантную экспрессию Kras, мышей LSL-KrasG12D/plus [3], несущих последовательность Lox-Stop-Lox, за которой следует мутантный аллель Kras, скрещивали с мышами KLflox/flox. Этих мышей далее скрестили с мышами Pdx1-Cre, получив Pdx1-Cre; КЛ-/-; КрасГ12Д/ плюс мыши. LSL-KrasG12D/ plus также отдельно скрещивали с мышами Pdx1-Cre, и этот Pdx1-Cre; В качестве контроля использовали мышей KrasG12D/plus. Мышей ежедневно осматривали на наличие признаков страданий, включая затрудненное дыхание, значительные изменения веса и большие опухоли (более 1 см), а тех, которые соответствовали критериям, установленным этическим комитетом, умерщвляли. Мышей отслеживали на выживаемость, при этом смерть определяли либо спонтанно, либо по признакам, требующим умерщвления. Из-за быстрого переваривания ткани поджелудочной железы панкреатическими жидкостями мы могли исследовать только поджелудочную железу мышей, которые были забиты. Ткани собирали и выдерживали в формальдегиде в течение 24 часов, который затем заменяли 70-процентным этанолом.

2.6. Исследования ксенотрансплантатов опухолей мышей

Самок голых бестимусных мышей (фон BALB/c) в возрасте {{0}} недель приобретали у Envigo RMS (Иерусалим, Израиль). Мышей содержали и содержали в ламинарных боксах в особых условиях отсутствия патогенов. В первый день эксперимента клетки MIA PaCa-2, стабильно экспрессирующие m-Cherry/люциферазу, подкожно (п/к) инокулировали в их бока (n=21, 1 × 10 градусных клеток в 100 мкл 5 процент FCS среды DMEM）. Через десять дней после инокуляции опухоли ей внутримышечно вводили высокую дозу (5×1011 GC/мл, n=7) или низкую дозу (5×1010 GC/мл, n=6) человеческого AAV. (im).AAV-null служил в качестве контроля (5×1010 GC/мл, n=8). Опухоли измеряли цифровым штангенциркулем три раза в неделю, а объем рассчитывали по формуле расчета объема эллипсоида (0,5×длина×ширина2). На 20-й день эксперимента опухоли оценивали in vivo путем мониторинга активности люциферазы клеток MIA PaCa-2 путем внутрибрюшинной инъекции 150 мкг/мл люциферина, а интенсивность люциферазы измеряли с помощью Biospase.

В тот же день эксперимент закончился, и мышей усыпили. Опухоли удаляли, взвешивали и измеряли цифровым штангенциркулем. Перед эвтаназией собирали кровь и измеряли уровни клото человека в сыворотке с помощью ELISA (IBL, Миннеаполис, Миннесота, США). Пятьдесят микролитров сыворотки на образец (в повторах) использовали для ELISA, и анализ проводили в соответствии с инструкциями производителя. Корреляцию между массой опухолей и уровнем клото в крови человека исследовали с помощью коэффициента корреляции Пирсона.

2.7. Модели мышей KPC

Получение мышей KPC осуществляли путем скрещивания мышей LSL-Trp53R172H/ plus [5], несущих последовательность Lox-Stop-Lox, за которой следовал точечный мутантный аллель p53, функционирующий как нулевая мутация, с мышами LSL-KrasG12D/ plus t. Затем их скрещивали с мышами Pdx1-Cre, в результате чего получали Pdx1-Cre; КрасГ12Д/плюс ; Trp53R172H/ плюс мыши. Мышей подбирали по полу, возрасту и весу и случайным образом распределяли для лечения внутрибрюшинными (в/б) инъекциями растворимой кожи человека (15 мг/кг, два раза в неделю) или контрольным носителем (n =6 для группа, получавшая скай; n =7 для контрольной группы). Лечение продолжалось до 30 недель. Мышей ежедневно осматривали на наличие признаков страданий, включая затрудненное дыхание, значительные изменения веса и большие опухоли (более 1 см), а тех, которые соответствовали критериям, установленным этическим комитетом, умерщвляли. Мышей отслеживали на выживаемость, при этом смерть определяли либо спонтанно, либо по признакам, требующим умерщвления.

2.8. Генотипирование

Хвосты мышей брали в возрасте 3 недель для генотипирования. ДНК экстрагировали путем инкубации хвоста в щелочном лизирующем растворе, состоящем из 250 мкМ NaOH и 2 мкМ динатрия ЭДТА (pH 12.0), в течение 30-60 мин при 95°С. с последующей нейтрализацией 0,4 мМ трис-HCL (pH 5,0). Затем ДНК подвергали ПЦР-амплификации для различных генотипов с использованием реакционной смеси REDTaq ReadyMix для ПЦР (Sigma-Aldrich, Реховот, Израиль). Праймеры имели конечную концентрацию 1000 нМ. Циклы ПЦР и праймеры подробно описаны в таблице S1. Продукты подвергали электрофорезу на 1,5% агарозных гелях и окрашивали бромистым этидием.

2.9. Иммуногистохимический (ИГХ) анализ

Ткани фиксировали в 4-процентном параформальдегиде, а встроенные ткани делали серийные срезы. Срезы либо окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и исследовали под микроскопом опытным патологоанатомом, либо окрашивали ИГХ, как описано. Для klotho IHC фиксированные формалином и залитые парафином срезы толщиной 4 мкм депарафинизировали в ксилоле и регидратировали. Извлечение антигена проводили с использованием горячей бани (95°С) в течение 20 мин в цитратном буфере pH 6,0. После охлаждения в течение 30 мин предметные стекла промывали буфером TBS-тритон (TBS-T).преимущества цистанхеЗатем проводили блокаду эндогенной пероксидазы в течение 10 минут в 3% H, O/метаноле. После промывания в TBS-T срезы блокировали на 30 минут с использованием 5% BSA в TBS-T, а затем инкубировали в течение ночи с первичным антителом klotho при 4°С. Детекцию проводили с помощью ZytoChem Plus(HRP) One-Step Polymer против мышей/кроликов/крыс (ZUC053; Zytomed Systems, Берлин, Германия). Крысиный IgG2a служил изотипическим контролем.

2.10. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

Поджелудочная железа из умерщвленного Pdxl-Cre; Контрольных мышей KL-/- и KLflox/flox вырезали, замораживали в жидком азоте и хранили при -80°С. После гомогенизации поджелудочной железы готовили тотальную РНК с использованием набора для выделения РНК (Sigma) и подвергали обратной транскрипции с использованием JScript cDNA SuperMix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, USA). кДНК амплифицировали на клото и -актин (в качестве контроля загрузки) с использованием реакционной смеси REDTaq ReadyMix для ПЦР (Sigma). ПЦР оптимизировали при 94° в течение 5 мин, затем следовали циклы 30 с при 94°, 90 с при 52,5° и 20 с при 72° (45 циклов для клото, 25 циклов для -актина) и 10 мин при 72 степени для удлинения с использованием праймеров клото 12,5 пмоль (F,5-ACGTTCAAGTGGACACTACTCT-3'и R,5'-TTCTTIGGCTACAACCCCGTC-3') и праймеров 5 пмоль -актина (F,5' -TGTTACCAACTGGGACGACA-3'и R,5'-GGGGTGTTGA AGGTCTCAAA-3). Продукты подвергали электрофорезу на 1,5% агарозных гелях, окрашенных бромистым этидием. Количественную оценку проводили с использованием программного обеспечения ImageJ, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA.

2.11.Статистический анализ

Результаты представлены как среднее ± SD или SEM, как уже упоминалось. Непрерывные переменные сравнивались с использованием t-критерия, если не указано иное. Все тесты значимости были двусторонними, и значение p Меньше или равное 0,05 считалось статистически значимым. Корреляцию оценивали с помощью коэффициента корреляции Пирсона (r). Анализ выживаемости проводили с использованием логарифмического рангового теста.

3. Результаты

3.1. Уровни экспрессии Klotho и метилирования ДНК в опухолях поджелудочной железы коррелируют с выживаемостью больных раком

Когорта рака поджелудочной железы (PAAD) с помощью браузера генома рака (TCGA) была исследована с использованием браузера Xena Калифорнийского университета в Санта-Круз (UCSC) [35]. Анализ экспрессии генов выявил снижение общей выживаемости (ОВ) и интервала без прогрессирования (PFI) для пациентов с раком поджелудочной железы с опухолями с низким уровнем экспрессии klotho по сравнению с высоким (n=89 для каждой группы; рис. 1A, B). Изучение данных о метилировании показало совместимую тенденцию к затрудненной ОС и PFI у пациентов с опухолями с высоким уровнем метилирования ДНК KLOTHO по сравнению с низким (n=45 и n =46 соответственно; рис. 2A, B) .

Further analyses of gene expression and methylation data (Table S2) revealed three specific sites, evaluated by probes cg23282559, cg02441765, and cg25650964, which were hypermethylated(IDelta βI>0.15)and negatively correlated to klotho expression(Irl>0.3) при раке поджелудочной железы человека (рис. 2C-E).

3.2. Поколение мышей KLOTHO с нокдауном поджелудочной железы

Мыши с неусловным нокаутом KLOTHO умирают в возрасте около 8-9 недель [7], следовательно, они не могут служить моделями развития рака. Поэтому мы стремились нацелить KLOTHO на поджелудочную железу мышей. С этой целью мышей Pdx1-Cre скрестили с мышами, несущими аллели floxed KLOTHO, KLlox/lox [38], получив таким образом Pdx1-Cre; Мыши KL-/- (рис. 3A, B). Уровни РНК и белка подтвердили нокдаун панкреатической ткани (рис. 3C-E). Pdx1-Кре; У мышей KL-77 с течением времени наблюдалось небольшое увеличение веса по сравнению с контрольной группой (рис. 3F), но не было различий в уровне глюкозы в сыворотке или инсулине и толерантности к глюкозе (рис. S1).

Рисунок 3. Поколение мышей KLOTHO с нокдауном поджелудочной железы. (A) Схематическая диаграмма аллеля KLflox: сайты LoxP фланкируют экзон 2 KLOTHO, что приводит к его целенаправленному нокдауну в поджелудочной железе Pdx1-Cre; KL-/-мыши. На верхней панели показан аллель floxed, на нижней панели показаны ожидаемые результаты рекомбинации Cre. (B) Репрезентативный гель, показывающий продукты ПЦР генотипирования мыши KLOTHO: KL plus/plus (WT; 370 п.н.), KL1/plus (470 и 370 п.н.) и KLflox/flox (470 п.н.). (C,D) РНК поджелудочной железы экстрагировали из Pdx1-Cre; KL-/- (n=7) и контрольные мыши (n=4). Уровни мРНК Klotho определяли с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР и определяли количественно. Показан репрезентативный гель (исходные необрезанные пятна доступны на рисунке S2). (E) Репрезентативное иммуногистохимическое окрашивание клото поджелудочной железы, вырезанной из Pdx1-Cre; KL-/- и контрольные мыши. Увеличение: х20. б/н, без. (F) Вес мышей в обеих группах (n =5 на группу). Проанализировано с использованием дисперсионного анализа с повторными измерениями.p=0.01. Данные представлены как среднее ± SEM. Контроль, мыши KLflox/flox. Мышей с нокдауном поджелудочной железы KLOTHO и мутантной экспрессией Kras получали путем скрещивания Pdx1-Cre с мышами LSL-KrasG12D/ plus [3] (мыши Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus) и дальнейшего скрещивания их с Мыши KLflox/lox (мыши Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/plus). Анализы проводились с использованием самцов мышей. Самки мышей были исключены из-за высокой частоты анальных поражений как у Pdx1-Cre; KrasG12D/plus и Pdx1-Cre; КЛ-/-; Мышей KrasG12D/plus, что согласуется с предыдущими сообщениями о кожно-слизистых папилломах у таких мышей [3].

3.3. Потеря панкреатического Клото способствует снижению выживаемости мышей

Не было никакой разницы в выживаемости Pdx1-Cre; KL-/- мышей по сравнению с контролем). Мы приступили к изучению влияния комбинированного нокдауна KLOTHO поджелудочной железы и мутации Kras на выживаемость, наблюдая за мышами в течение 65 недель. Смерть наступила либо спонтанно, либо в результате эвтаназии, когда появились признаки тяжелых страданий или опухолевого бремени, потребовавшего жертвоприношения. Выживание Pdx1-Cre; KL-/-; мышей KrasG12D/ plus (n =21) ​​было снижено по сравнению с контролем Pdx1-Cre; Мыши KrasG12D/ plus (n=18;p= 0.02; рис. 4А). Таким образом, к возрасту 22 недель 100 процентов (18/18) Pdx1-Cre; Мыши KrasGi2D/ plus были живы, по сравнению с 71 процентом (15/21) Pdx1-Cre; КЛ-/-; Мыши KrasG12D/plus. Значимых изменений в весе между группами отмечено не было (фиг. 4В).

Рисунок 4. Нокдаун KLOTHO поджелудочной железы способствует снижению выживаемости и вызывает PDAC in vivo. (A) Кривые Каплана-Мейера Pdx1-Cre; KL-/-;KrasGi2D/ plus (n=21) по сравнению с контрольной Pdx1-Cre;KrasGi2D/ plus (n=18)мышами.p=0.02.( B) Вес мышей в обеих группах (n=19 на группу). (CE) Поджелудочная железа вырезана из Pdx1-Cre; КЛ-/-; KrasG12D/ plus (n=7, средний возраст 36 недель) и контроль Pdx1-Cre; Мыши KrasGi2D/ plus (n=8, средний возраст 49 недель) после умерщвления. (C) Сравнение патологической оценки окрашенной H&E поджелудочной железы обеих групп. (D) Репрезентативное окрашивание H&E поджелудочной железы, полученной от 24-недельных мышей. Pdx1-Cre; КЛ-/-; KrasG12D/ plus (справа): полная потеря клеточной полярности, выраженная ядерная атипия и почкование скоплений клеток в просвете протоков, наряду с обильным фиброзом и кератином. Контроль Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus (слева): без поражений. Увеличение: ×10. (E) Репрезентативные поражения PanIN обеих групп. Увеличение: ×10.

3.4. Клото участвует в разработке PDAC In Vioo

Основываясь на предыдущих исследованиях, показывающих развитие PDAC у мышей, несущих как мутацию Kras, так и утрату активности супрессора опухолей [4], мы исследовали Pdx1-Cre; КЛ-/-; KrasG12D/ плюс поджелудочная железа мыши при поражениях. Из-за быстрого переваривания ткани поджелудочной железы панкреатической жидкостью мы могли использовать только поджелудочную железу умерщвленных мышей. Образцы Pdx1-Cre; КЛ-7-; KrasGi2D/ plus (n =7) ​​и контроль Pdx1-Cre; Мыши KrasGi2D/ plus (n =8) подверглись патологической оценке (средний возраст смерти: 36 и 49 недель соответственно). PDAC был идентифицирован в двух Pdx1-Cre; КЛ-/-; Мыши KrasG12D/ plus, но ни у одной из мышей Pdx1-Cre; Мыши KrasG12D/ plus, в то время как PanN2 был отмечен у двух мышей Pdx1-Cre; КЛ-/-; Мышей KrasG12D/ plus и у четырех мышей Pdx1-Cre; Мыши KrasG12D/plus (рис. 4С). Показаны репрезентативные изображения (рис. 4D-E).

3.5. Лечение sKL ингибирует опухоли поджелудочной железы и продлевает выживаемость in vivo

The potential of SQL treatment as a therapeutic strategy for PDAC was studied using two mouse models, a xenograft model treated with a viral skin vector, and the transgenic KPCmodel treated with soluble, recombinant sKL. For the xenograft model, m-Cherry/luciferase-labeled MIA PaCa-2 cells were s.c.inoculated into nude mice. Ten days later, mice were injected with adeno-associated viruses(AAV)encoding sKL(AAV-L) at two doses. Tumor load in mice inoculated with AAV skin was significantly lower compared to the control, reflected by smaller size, weight, and luciferase signals (Figure 5A-E). Importantly, tumor weights negatively correlated with human klotho blood levels in mice (Ir| >0.729; Рисунок 5F-G).

Второй моделью, используемой для этой цели, была модель KPC. Мышей подбирали по полу, возрасту и весу и лечили инъекциями растворимого человеческого sKL или контрольного носителя на срок до 30 недель. Смерть наступила либо спонтанно, либо в результате эвтаназии, когда появились признаки тяжелых страданий или опухолевого бремени, потребовавшего жертвоприношения. Выживаемость мышей, получавших sKL, была выше по сравнению с контролем (p=0,005; рис. 5H).

Рисунок 5. Лечение sKL снижает локальный рост опухоли и продлевает выживаемость in vivo. (AG) Бестимусным голым мышам BALB/c подкожно инокулировали клетки MIA PaCa-2, стабильно экспрессирующие m-Cherry/люциферазу (1×10 градусных клеток на мышь). Десять дней спустя мышам вводили внутримышечно высокие дозы AAV-sKL (5×1011 GC/мл, n=7), низкие дозы AAV-sKL (5×1010 GC/мл, n{{13}). }) или контрольный AAV-null (5×1010 GC/мл, n= 8). (A) Объем опухоли измеряли in vivo с помощью цифрового штангенциркуля. (B) Репрезентативные изображения биовизуализации активности люциферазы местных опухолей. (C) Активность люциферазы опухолей измеряли количеством импульсов в минуту. (D) Репрезентативные изображения опухолей, собранных в день жертвоприношения. (E) Вес собранных опухолей. (F) Уровни клото в крови человека. *п<0.05, was="" calculated="" using="" the="" kruskal-wallis="" test.="" (g)="" correlation="" between="" tumor="" weights="" and="" human="" klotho="" blood=""><0.05.r, pearson's="" correlation="" coefficient.="" (h)kpc="" mice="" were="" matched="" according="" to="" sex,="" age,="" and="" weight,="" and="" randomly="" assigned="" to="" receive="" treatment="" with="" i.p.injections="" of="" soluble="" human="" skin="" (15="" mg/kg,="" twice="" weekly)or="" vehicle="" control(n="6" for="" the="" sky-treated="" group;n="7" for="" the="" control="" group)for="" up="" to="" 30="" weeks.="" kaplan-meier="" curves="" of="" skin-treated="" and="" control="" mice="" are="" presented.p=""><0.05;*><0.005;*** p=""><0.0005 compared="" to="" control.="" error="" bars,="" mean="" ±="">

4. Дискуссия

Настоящее исследование устанавливает роль klotho как супрессора опухоли при PDAC. Анализ биоинформатики выявил корреляцию между выживаемостью пациентов с PDAC и уровнями экспрессии klotho и метилирования ДНК, а также продемонстрировал уникальный паттерн гиперметилирования KLOTHO в опухолях поджелудочной железы. Используя новую мышиную модель, мы показали, что нокдаун панкреатического klotho взаимодействует с мутацией Kras, снижая выживаемость и генерируя PDACin Vivo. Кроме того, L ингибировал рост опухолей, происходящих из клеток поджелудочной железы, в модели ксенотрансплантата и продлевал выживание мышей KPC.

Klotho эпигенетически замалчивается за счет гиперметилирования промотора в широком спектре злокачественных новообразований [16,23,25,26,28-31,33,39,40]. Об этом также сообщалось в небольших когортах пациентов с PDAC, а также о корреляции между выживаемостью пациентов с PDAC и уровнями экспрессии klotho и метилирования ДНК [17,34]. Соответственно, наша оценка OS, а также PFI с использованием данных, включающих 178 образцов PDAC, показала положительную связь с экспрессией klotho и соответствующую отрицательную связь с метилированием ДНК KLOTHO. Эти данные также указывают на то, что экспрессия klotho может регулироваться метилированием ДНК, и подтверждают мнение о том, что эти параметры могут служить для оценки прогноза пациентов с PDAC.

Предыдущие исследования метилирования ДНК KLOTHO при PDAC [17,34] были основаны на ограниченном подмножестве пациентов и экспериментах in vitro и не анализировали характер метилирования конкретных сайтов во всем гене KLOTHO. Текущий анализ, основанный на вышеупомянутом обширном наборе данных, показал, что три специфических сайта, два из которых расположены внутри CpGisland в последнем экзоне KLOTHO, действуют как негативные регуляторы экспрессии klotho посредством гиперметилирования. Ранее мы обнаружили, что один из этих сайтов, cg23282559, также гиперметилирован при колоректальном раке [25]. Еще предстоит определить, играют ли эти сайты роль в регуляции klotho и при других злокачественных новообразованиях.

Klotho, как известно, экспрессируется в поджелудочной железе; однако его роль в нормальном развитии и функционировании поджелудочной железы до сих пор неизвестна. В то время как у мышей с дефицитом klotho наблюдается снижение выработки инсулина наряду с резким увеличением чувствительности к инсулину [22], избыточная экспрессия klotho у мышей приводит к повышению уровня инсулина в крови натощак, что сопровождается резистентностью к инсулину [8]. Удивительно, но модель мыши, представленная в этом исследовании, с нокдауном панкреатической ткани, не показала явного фенотипа диабета или измененной чувствительности к инсулину. Кроме того, не было никакого влияния на морфологию поджелудочной железы, образование опухоли или выживаемость. Эти результаты позволяют предположить, что потеря панкреатической ткани может быть компенсирована периферическими эффектами системной ткани ткани или другими механизмами. Более того, развитие сахарного диабета — сложный процесс, который зависит не только от поджелудочной железы, но и от печени, мышц и жировых тканей. Поскольку в нашей модели klotho был нокдаун преимущественно в поджелудочной железе, это может объяснить отсутствие диабета в этой мышиной модели.

В соответствии с представленными клиническими результатами Pdx1-Cre; КЛ-/-; Мыши KrasG12D/ plus имели более короткую продолжительность жизни по сравнению с контрольной Pdx1-Cre; Мыши KrasGi2D/plus (48 и 60 недель соответственно). Хотя мы не смогли провести патологоанатомическое исследование всей поджелудочной железы мышей, у Pdx1-Cre наблюдалась более высокая частота выраженного PDAC; КЛ-7-; Мыши KrasG12D/ plus по сравнению с контрольной Pdx1-Cre; КрасГ2Д/ плюс мыши. Эти результаты демонстрируют значение klotho в развитии злокачественных новообразований поджелудочной железы и выживаемости in vivo. Фенотип Pdx1-Cre; KL-/-:KrasGl2D/plus мышей менее выражен по сравнению с моделями, сочетающими потерю других опухолевых супрессоров с мутациями Kras. Например, средняя выживаемость мышей KPC составляет всего 5 месяцев [5]. Возможно, это связано с частичной компенсацией потери местного клото за счет циркулирующего клото. Альтернативно остаточная экспрессия klotho в поджелудочной железе могла повлиять на фенотип. Достижение полного целенаправленного молчания klotho в будущих исследованиях позволит лучше понять его роль в различных тканях, а также уравновесить местные и системные эффекты klotho.

Мы представили две модели, демонстрирующие терапевтический потенциал klotho. В мышиной модели с ксенотрансплантатом инъекции кожного вирусного вектора при раке поджелудочной железы оказались высокоэффективными не только в подавлении роста опухоли, но и в уменьшении размера опухолей. Лечение начинали, когда опухоли уже были видны и устанавливались, что напоминало время начала лечения у большинства пациентов. Результаты показывают, что ее можно использовать для генной терапии, таким образом преодолевая основные препятствия на пути к стабильности и эффективной доставке лекарств на основе белков и пептидов. Кроме того, отмечена отрицательная корреляция между массой опухоли и уровнем клото в крови человека. Дальнейшее исследование уровней klotho в крови с точки зрения его влияния может помочь в прогнозировании того, кому будет полезно лечение klotho или SQL, а также в поддержании уровней в пределах терапевтического окна.

Разработка терапии на основе клото является целью многих исследовательских групп, а также фармацевтических компаний. В отношении лечения рака исследуются несколько направлений. Можно увеличить эндогенные уровни klotho, используя эпигенетические механизмы, влияющие на экспрессию klotho. Сообщалось, что промотор klotho сильно метилирован при многих видах рака, а также является функцией возраста. Таким образом, соединения, ингибирующие ДНК-метилтрансферазы, могут стать терапевтической мишенью для увеличения экспрессии klotho. С другой стороны, можно увеличить уровни, добавляя klotho экзогенно, например, применяя генную терапию или доставку рекомбинантного белка klotho. Здесь мы сообщили о введении активной области klotho (L) с использованием системы экспрессии AAV, что привело к терапевтическому эффекту на модели рака поджелудочной железы.

Затем мы показали, что лечение растворимым небом продлевает выживание мышей KPC, модели, которая, как известно, повторяет человеческий PDAC. Это продемонстрировало влияние неба на иммунокомпетентного хозяина и нативную опухолевую среду, что еще раз подтвердило возможное использование SSL в клинических условиях.

5. Выводы

В заключение, это исследование идентифицировало klotho как мощный супрессор опухоли при PDAC. Существующие схемы лечения PDAC недостаточны, и введение экзогенных sKL может служить новой стратегией лечения PDAC.

Эта статья взята из журнала Cancers 2021, 13, 6297. https://doi.org/10.3390/cancers13246297 https://www.mdpi.com/journal/cancers