Часть 1 Актеозид подавляет RANKL-опосредованный остеокластогенез, ингибируя индукцию C-Fos и путь NF-kB, а также ослабляя продукцию АФК

Часть 1 Как актеозиды способствуют росту костей?

Для получения дополнительной информации:ali.ma@wecistanche.com

Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook2, Jeong-Chae Lee2,3* 1 Научно-исследовательский институт клинической медицины Национального университета Чонбук, Институт биомедицинских исследований Национального университета Чонбук Больница, Чонджу, Чонбук, Южная Корея, 2 Отделение ортодонтии, Институт биологических наук полости рта и Школа стоматологии, Национальный университет Чонбук, Чонджу, Чонбук, Южная Корея, 3 Отделение биоактивных материаловедения, Исследовательский центр биоактивных материалов, Национальный университет Чонбук, Чонджу, Чонбук, Южная Корея

Абстрактный

Многочисленные исследования показали, что воспалительные цитокины являются важными медиаторами остеокластогенеза, тем самым вызывая чрезмерную резорбцию кости и остеопороз.актеозид, основное активное соединение Rehmannia glutinosa, широко используемое в традиционной восточной медицине, обладает противовоспалительным и антиоксидантным потенциалом. В этом исследовании мы обнаружили, что сторона CTE заметно ингибировала дифференцировку и образование остеокластов из макрофагов костного мозга (BMM) и макрофагов RAW264.7, стимулированных активатором рецептора лиганда ядерного фактора каппаВ (NF-kB) (RANKL). Предварительная обработка актеозидом также предотвращала резорбцию кости зрелыми остеокластами дозозависимым образом. Актеозид (10 мМ) ослаблял RANKL-стимулируемую активацию киназы p38, киназ, регулируемых внеклеточными сигналами, и N-концевой киназы c-Jun, а также подавлял активацию NF-kB путем ингибирования фосфорилирования субъединицы p65 и ингибитора kBa. Кроме того, RANKL-опосредованное увеличение экспрессии c-Fos и ядерного фактора активированных Т-клеток, цитоплазматического 1 (NFATc1), и продукции фактора некроза опухоли-а, интерлейкина (IL)-1b и IL-6, по-видимому, ингибировались предварительной обработкой актеозидом. Кроме того, пероральный прием актеозида снижал вызванную овариэктомией потерю костной массы и выработку воспалительных цитокинов до контрольных уровней. Наши данные говорят о том, чтоактеозидингибирует дифференцировку и созревание остеокластов из предшественников остеокластов путем подавления RANKL-индуцированной активации митоген-активируемых протеинкиназ и факторов транскрипции, таких как NF-kB, c-Fos и NFATc1. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, чтоактеозидможет действовать как антирезорбтивное средство для уменьшения потери костной массы за счет блокирования активации остеокластов.

Для получения дополнительной информации обращайтесь:ali.ma@wecistanche.com

Нажмите, чтобы перейти к продуктам с эффектами Cistanche

Введение

Кость постоянно ремоделируется за счет сбалансированной активности остеокластов и остеобластов [1]. Остеокласты возникают из гемопоэтических клеток-предшественников моноцитарной/макрофагальной линии, в то время как остеобласты относятся к мезенхимальной линии [2]. Аномальная активация остеокластов или снижение остеобластогенеза может нарушить гомеостаз кости, в конечном итоге вызывая такие заболевания, как остеопороз, артрит и рак костей [3,4]. Остеопороз является распространенным заболеванием костей, которое приводит к повышенному риску переломов. Наиболее распространенная форма остеопороза вызвана дефицитом эстрогена у женщин в период менопаузы. Лекарства, такие как кортикостероиды и противоэпилептические средства, также могут вызывать дисбаланс между резорбцией и формированием кости, что может привести к остеопорозу [5]. Многие антирезорбтивные ингибиторы, включая бисфосфонаты, кальцитонин, эстроген и селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов, используются для лечения остеопороза. Эти ингибиторы поддерживают костную массу, ингибируя функцию остеокластов [6]. Заместительная терапия эстрогенами является наиболее популярным методом профилактики и лечения постменопаузального остеопороза. Однако длительная заместительная терапия эстрогенами может увеличить риск развития рака эндометрия и молочной железы. Поэтому многие исследователи сосредоточили свои усилия на разработке нового антирезорбтивного средства, не обладающего побочными эффектами [7–10]. Поскольку остеокласты участвуют в резорбции костей, специфическое ингибирование остеокластов считалось основной целью многочисленных исследований. Остеокласты представляют собой многоядерные гигантские клетки, образованные мононуклеарными предшественниками семейства моноцитов/макрофагов путем последовательной пролиферации, дифференцировки и слияния гемопоэтических клеток-предшественников [11]. Макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF) и лиганд-активатор рецептора ядерного фактора (NF)-kB (RANK) (RANKL) являются важными факторами дифференцировки остеокластов [12]. Кроме того, несколько воспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли (TNF) и интерлейкин (IL)-1b, способствуют остеокластогенезу, модулируя индукцию RANKL, остеопротегерина и M-CSF [7,13]. Связывание RANKL с рецептором RANK на клеточной поверхности приводит к образованию комплексов факторов, ассоциированных с RANKL/RANK/TNFR (TRAF), которые последовательно активируют NF-kB и митоген-активируемые протеинкиназы (MAPK), включая N-концевую киназу c-Jun (JNK), p38 киназа и киназа, связанная с внеклеточным сигналом (ERK) [14]. Эта активация играет ключевую роль в обеспечении дифференцировки, активации и выживания остеокластов. RANKL также активирует экспрессию факторов транскрипции, таких как ядерный фактор активированных Т-клеток, цитоплазматический 1 (NFATc1) и -Fos, которые необходимы для развития остеокластов. 7,9]. Следовательно, передача сигналов RANKL считается основной мишенью антирезорбтивных агентов, которые подавляют активацию остеокластов и потерю костной массы.

актеозидявляется основным активным соединением Rehmannia glutinosa, широко используемым в традиционной восточной медицине [15,16]. Актеозид является сильным антиоксидантом и обладает антигепатотоксическим, противовоспалительным и антиноцицептивным действием [17–20]. Ранее мы обнаружили, чтоактеозидснижает активность тирозиназы и биосинтез меланина, регулируя передачу сигналов ERK [21], защищает от повреждения десен, опосредованного активными формами кислорода (АФК) [22], и подавляет повреждение клеток, опосредованное микотоксинами [23]. Эти эффекты тесно связаны сактеозидыспособность удалять АФК и регулировать передачу сигналов, опосредованную МАРК. В частности, предполагается, что АФК являются посредниками в RANKL-индуцированных сигнальных путях и клеточных событиях в остеокластах. Предварительная обработка антиоксидантами ингибировала RANKL-индуцированную активацию NF-kB, ERK и IkBa, тем самым подавляя остеокластогенез [24]. Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что, помимо противовоспалительной активности, антиоксидантная активность имеет решающее значение для антирезорбтивного агента, таким образом.актеозидможет подавлять RANKL-индуцированный остеокластогенез.

В настоящем исследовании мы изучили, могут лиактеозидоказывает терапевтическое воздействие на потерю костной массы. Мы исследовали влияниеактеозидна дифференцировку остеокластов и резорбцию костей и связанные с ними клеточные механизмы с использованием экспериментальных систем in vitro и in vivo.

Материалы и методы

Заявление об этике

Правила ухода за животными и их использования были одобрены Комитетом по этике содержания и использования лабораторных животных Чонбукского национального университета (разрешение № CBU 2010-0007). Все эксперименты в этом исследовании проводились в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу и использованию животных Университета.

Мыши, химикаты и лабораторное оборудование

Четырехнедельных самок мышей ICR приобретали у OrientBio Inc. (Сеул, Корея) и содержали при температуре 2261 °C и влажности 55–65% при 12-часовом цикле свет/темнота со свободным доступом к пище и воде. Актеозид (3,4-дигидрокси-b-фенетил-Oa-рамнопиранозо-сил-(1R3)-4-O-кофеоил-bD-глюкопиранозид; C29H36O15) (рис. S1) был выделен из листьев Реманния глютиноза. Перед применением актеозид растворяли в фосфатно-солевом буфере (PBS). RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 и M-CSF были приобретены в R&D systems (Миннеаполис, Миннесота, США). Антитела, специфичные к c-Fos,p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa и b-актину, были получены от Santa Cruz Biotechnology (Санта-Круз, Калифорния, США). ). Антитела к p-p38 и p38 были приобретены у Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Наборы CalciumAssay и Osteocalcin (OC) EIA были приобретены у компаний BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) и Biomedical Technologies (Stoughton, MA, USA) соответственно для определения биохимических параметров сыворотки. Набор для анализа устойчивой к тартрату кислой фосфатазы (TRAP) мыши (Immunodiagnostic Systems, Скоттсдейл, Аризона, США) также использовали для измерения уровня TRAP5b в сыворотке. Если не указано иное, дополнительные химические вещества были получены от Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури, США), а лабораторное оборудование — от SPL Life Sciences (Почун, Южная Корея).

Клеточные культуры

Клетки костного мозга получали из голени и бедра 6-недельных самок мышей ICR по методике, описанной ранее [25]. Суспензию костного мозга инкубировали в чашке для культивирования размером а100-мм в присутствии 50 нг/мл M-CSF. Через 3 дня прилипшие клетки использовали в качестве макрофагов костного мозга (BMM) для индуцирования дифференцировки остеокластов. Некоторые клетки костного мозга также инкубировали в течение 48 ч без M-CSF, а прилипшие клетки культивировали в среде для дифференциации остеобластов, как описано в другом месте [25]. Клетки макрофагов RAW264.7 культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глютамина и антибиотиков. Эти клетки использовали в качестве клеточной линии-аналога для BMM для изучения влияния актеозида на остеокластогенез.

Остеокластическая дифференциация и окрашивание TRAP

BMM были предварительно обработаны различными концентрациями (0–50 мМ) актеозида в течение 2 часов перед стимуляцией 100 нг/мл RANKL. Культуральные среды заменяли свежими средами на 2 и 5 дни. Через 7 дней инкубации культуры фиксировали в 4% параформальдегиде, забуференном PBS, и окрашивали TRAP с использованием набора sigma Aldrich в соответствии с инструкциями производителя. TRAP-положительные клетки подсчитывали с помощью оптической микроскопии, и клетки, содержащие 3 или более ядер, считали остеокластами. Клетки RAW 264.7 также подвергали воздействию 100 нг/мл RANKL после предварительной обработки актеозидом в течение 2 часов и после 7 дней инкубации. клетки обрабатывали для окрашивания TRAP.

Измерение жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток определяли с использованием реагента водорастворимой соли тетразолия (WST)-8. Вкратце, клетки BMM или RAW264.7, культивированные в питательной среде, содержащей 10 процентов FBS и антибиотики, обрабатывали 10 мМ актеозида или фенольного соединения, такого как кверцетин, лютеолин, апигенин или эпигаллокатехин-3-галлат (EGCG). Реагент WST-8 добавляли в культуры через 48 ч инкубации. После инкубации в течение дополнительных 4 часов измеряли удельное поглощение WST-8-при 450 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA).

Анализ резорбции кости

BMM (16105 клеток/мл) суспендировали в a-MEM, содержащем 50 нг/мл M-CSF и 100 нг/мл RANKL, затем распределяли по 24-луночному планшету, покрытому нанокристаллами фосфата кальция (OAAS{{6} }; Субстрат для анализа активности остеокластов, Oscotec Inc., Чунгнам, Южная Корея) при плотности 26 104 клеток/см2 с актеозидом и без него. После инкубации в течение 7 дней клетки удаляли с планшетов с 5-процентным раствором гипохлорита натрия и наблюдали информацию под оптическим микроскопом. Площадь резорбции также измеряли с помощью анализатора изображений и выражали в процентах от контрольного значения.

Вестерн-блот-анализ

Цельнопротеиновые лизаты готовили в лизирующем буфере, как описано в другом месте [26]. Цитозольные и ядерные белки готовили, как описано ранее [25]. Равные количества белкового экстракта разделяли с помощью 12–15% SDS-PAGE и наносили на поливинилдифторидные мембраны. Блоты зондировали первичными антителами в течение ночи при 4 мкС перед инкубацией со вторичными антителами в блокирующем буфере в течение 1 часа. Блоты проявляли с помощью усиленной хемилюминесценции (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Бакингемшир, Великобритания) и подвергали воздействию рентгеновской пленки (Eastman-Kodak Co., Рочестер, Нью-Йорк, США).

Анализ активности МАПК

Клетки предварительно обрабатывали актеозидом в течение 2 ч, а затем стимулировали RANKL в течение дополнительных -30 мин. Активность MAPK определяли с использованием наборов для иммунометрического анализа, таких как набор для анализа p-p38kinase (Assay Designs, Inc., MI, USA), набор для анализа фермента p-ERK (Assay Designs) и набор для сэндвич-ELISA p-SAPK/JNK ( Cell Signaling Technology, Массачусетс, США). Все процедуры следовали инструкциям производителя, и абсорбцию измеряли с помощью ридера микропланшетов.

Электрофоретический анализ сдвига подвижности (EMSA)

Реакции связывания ДНК с белком проводили в течение 30 мин при комнатной температуре с 10–15 мг белка в 20 мл буфера, содержащего 1 мг/мл БСА, 0,5 мг/мл поли(ди-дЦ), 5% глицерина. , 1 мМ DTT, 1 мМ PMSF, 10 мМ Tris-Cl (pH 7,5), 50 мМ NaCl, 30, 000 CPM [a-32P] dCTP-меченых олигонуклеотидов и фрагмент Кленова ДНК-полимеразы. Образцы разделяли на 6-процентных полиакриламидных гелях, которые высушивали и экспонировали на рентгеновскую пленку (Eastman Kodak Co.) в течение 12–24 ч при 270 °С. Последовательности олигонуклеотидных праймеров, специфичных для NF-, были 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 и 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 }}.

Анализ люциферазы NF-kB

Макрофаги RAW264.7 в 24-луночных планшетах трансфицировали 0.8 мг репортерного вектора kB-люциферазы с использованием 2 мл Lipofectamine2000 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) в соответствии с инструкциями производителя. Через 24 часа после трансфекции клетки стимулировали RANKL в присутствии и в отсутствие актеозида в течение 24 часов. Клетки ресуспендировали в 100 мл репортерного буфера для лизиса (Promega, Мэдисон, Висконсин, США). Равные количества образцов белка помещали в микропланшеты с 96-лунками и смешивали с субстратом люциферазы. Люминесценцию измеряли с помощью люминометра для микропланшетов (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Бад-Вильдбад, Германия). В этом эксперименте в качестве положительного ингибитора kB использовали проницаемый пептид-ингибитор NF-B (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA).

Измерение цитокинов

Клетки BMM или RAW264.7 стимулировали с помощью RANKL в присутствииактеозидв 24-луночных культуральных планшетах. После 48 ч инкубации культуральные супернатанты собирали и оценивали с помощью ELISA с использованием наборов OptEIA™, специфичных для TNF-a, IL-1b- и IL-6-, в соответствии с инструкциями производителя.

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в реальном времени (ОТ-ПЦР)

Экспрессию мРНК маркеров остеокластов, таких как c-Fos, NFATc1 и TNF-a, определяли с помощью RT-PCR в реальном времени. Вкратце, тотальную РНК экстрагировали из макрофагов тризолреагентом в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen). кДНК синтезировали из 1 мг тотальной РНК с использованием SuperScriptReverse Transcripatase II и праймеров (Invitrogen). Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) использовали для обнаружения накопления продукта ПЦР во время циклирования с помощью системы обнаружения последовательности ABI 7500 (применяется с использованием сорока 3-этапных циклов денатурации при 95 мкС). в течение 15 с, отжиг при 60 мкС в течение 1 с и удлинение при 72 мкС в течение 30 с. Все реакции ПЦР были выполнены по крайней мере в трех повторах, и уровни экспрессии были нормализованы по гену домашнего хозяйства HPRT в той же реакции. В этом исследовании использовались те же последовательности праймеров, которые описаны в другом месте [7].

Измерение внутриклеточных АФК

Исходный раствор 29,79-дихлордигидрофлуоресцеин-диацетата (DCFH-DA) (50 мМ; Calbiochem, Дармштадт, Германия) готовили в ДМСО и хранили при 220 uC в темноте. Вкратце, BMM (106 клеток/мл в 6-луночных планшетах) культивировали с 50 нг/MLM-CSF в течение 24 часов, а затем обрабатывали различными концентрациями (0–10 мМ) актеозида за 2 часа до стимуляции 100 нг/мл RANKL. После 1 ч совместной инкубации эти клетки затем инкубировали с 25 мМ DCFH-DA в течение 30 мин. Зеленую флуоресценцию 29,79-дихлорфлуоресцеина (DCF) регистрировали при 515 нм (FL 1) с использованием системы FACS VantageH (Becton-Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния, США) и 10,000 событий. были подсчитаны на образец

Индукция остеопороза, вызванного овариэктомией

Для этого исследования использовали самок мышей ICR (6-недельного возраста). Мышам проводили фиктивную операцию (Sham, n=10) или хирургическую овариэктомию (OVX, n=20) под анестезией. Через неделю после операции мышей OVX случайным образом разделили на 2 группы по 10 мышей в каждой: билатеральные OVX и билатеральные OVX, получавшие перорально 200 мл PBS, содержащего 1 мМ актеозида (группа AC). Оральныйактеозидвводили один раз каждые 3 дня в течение 8 недель после операции, и такое же количество PBS вводили в группах симуляции и OVX. Через 1 день после последнего введения мышей умерщвляли, а затем анализировали биохимические параметры в сыворотке и 3-размерную структуру кости.

Определение биохимических показателей сыворотки

Образцы крови собирали путем пункции сердца, а сыворотку собирали центрифугированием. Образцы сыворотки хранили при 280 uC для анализа биохимических параметров. Уровни IL-1b и IL-6 в сыворотке оценивали с использованием набора ELISA, как описано выше, а активность щелочной фосфатазы (ALP) определяли с помощью биохимического колориметрического анализа, который измеряет количество p -нитрофенол, полученный из п-нитрофенолфосфатного субстрата, как описано в другом месте [27]. Для оценки биомаркеров костеобразования и резорбции также определяли сывороточные уровни OC, кальция и TRAP5b в соответствии с инструкциями производителя.

Анализ костной структуры и морфометрических параметров

Бедра мышей (группы Sham, OVX и AC) рассекали и заполняли физиологическим раствором для механических испытаний. Механическую прочность бедренной кости измеряли, как описано в другом месте [28]. Нагрузку при переломе регистрировали как пиковую силу в ньютонах в точке перелома средней части диафиза правой бедренной кости. Кроме того, светлую бедренную кость каждого животного подвергали гистоморфометрическому анализу с использованием системы микрокомпьютерной томографии (микро-КТ) (микрофокусная рентгеновская система SkyScan 1076, Kontich, Бельгия). Вкратце, кости, хранящиеся в 4-процентном формальдегиде, сушили поверхностно на бумажной салфетке, а затем заворачивали в пластиковую «липкую пленку» или в парапленку, чтобы предотвратить высыхание во время сканирования. Каждую обернутую пластиком кость помещали в пробирки из пенополистирола/пластика, которые устанавливали вертикально горизонтально в камере образца сканера 1076 для микро-КТ-визуализации. Сканирование проводилось при напряжении источника 100 кВ и токе источника 140 мА с разрешением 35 мм. Трехмерные модели трабекулярных костей бедренной кости реконструировали с помощью SkyScan CT Analyzer версии 1.11. Структурные параметры, такие как минеральная плотность трабекулярной кости (МПКТ, г/см3), объем кости в процентах (объем кости (ОБ)/объем ткани (ОБ), проценты), толщина (Тб.Th, мм), сепарация (Тб.Sp , мм) и число (Tb.N, 1/мм) затем были измерены.

Анализ остеогенной дифференциации и минерализации

Клетки костного мозга, культивированные в 6-луночных культуральных планшетах, обрабатывали DAG (10 нМ дексаметазона, 50 мМ аскорбиновой кислоты и 20 мМ b-глицерофосфата) в присутствии 10 мМактеозид. Через 2 недели дифференцировки клетки фиксировали ледяным 70 % (об./об.) этанолом в течение 1 ч и окрашивали 0,2 % дистиллированной водой ализаринового красного Сина в течение 30 мин при комнатной температуре. температура. После обесцвечивания клеток и высушивания на воздухе планшеты с клеточными культурами оценивали с помощью световой микроскопии с использованием инвертированного микроскопа (Nikon TS100, Япония). Для количественного определения количества красного красителя пятно элюировали 10-процентным ацетилпиридинийхлоридом путем встряхивания в течение 20 минут и измеряли оптическую плотность при 560 нм. Количество кальция, отложившегося в слоях клеток, также измеряли с использованием набора для определения кальция (Wako Chemical Inc., Осака, Япония) в соответствии с инструкциями производителя. Кроме того, с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени определяли экспрессию костно-специфических маркеров мРНК, таких как связанный с рантом фактор транскрипции-2(Runx2), osterix, костный сиалопротеин (BSP) и OC. Олигонуклеотидные праймеры этих маркеров были разработаны с размером продукта менее 200 п.н. с использованием программного обеспечения PrimerExpress 3.0 (Applied Biosystems), как описано в другом месте [27].

Статистический анализ

Если не указано иное, все данные выражены как среднее стандартное отклонение (SD) 3 или более независимых экспериментов. Для множественных сравнений использовали однофакторный дисперсионный анализ с использованием программного обеспечения SPSS версии 12.0. Значение p0.05 считалось статистически значимым.

Полученные результаты

Актеозид ингибирует образование остеокластов макрофагами дозозависимым образом

Для проверки влияния актеозида на дифференцировку МММ в остеокласты клетки культивировали с различными концентрациями (0–20 мМ) актеозида в течение 7 сут в присутствии 50 нг/мл М-КСФ и 100 нг/мл РАНКЛ. Актеозид уменьшал количество остеокластов дозозависимым образом. Когда клетки были предварительно обработаны 10 мМ актеозида в течение 2 часов, количество остеокластов уменьшилось на 43 процента по сравнению с клетками, дополненными M-CSF и RANKL (рис. 1А). На рис. 1В показана RANKL-опосредованная дифференцировка остеокластов и ее ингибирование при комбинированном лечении актеозидом. В соответствии с этим результатом предварительная обработка актеозидом снижала стимулированную RANKL дифференцировку клеток RAW264.7 и образование остеокластов (рис. 1C и D). Когда антиостеокластический потенциал актеозида на BMM сравнивали с антиостеокластным потенциалом нескольких фенольных соединений в той же концентрации (10 мМ), лютеолин показал самую высокую активность (рис. 2А). Однако сами лютеолин, кверцетин или апигенин снижали жизнеспособность клеток (рис. 2Б). Все соединения ингибировали дифференцировку остеокластов макрофагами RAW264.7 со следующими относительными активностями: лютеолин. кверцетин=апигенин .EGCG=актеозид (рис. 2C). Лютеолин, кверцетин или сам апигенин также показали снижение жизнеспособности клеток (рис. 2D). Напротив, обработка кверцетином вызывала только значительное снижение жизнеспособности клеток BMM и RAW264.7, когда эти клетки подвергались воздействию 10 мМ каждого соединения в течение 2 дней с 50 нг/мл M-CSF, 100 нг/мл RANKL, или оба (данные не показаны). Когда концентрация этих соединений требуется для ингибирования 50 процентов

образование остеокластов в BMM (IC50) рассчитывали с использованием кривых концентрация-активность, IC50актеозид, кверцетин, лютеолин, апигенин и EGCG составляли 5,1, 2,3, 2,6, 4,8 и 6,6 мМ соответственно (рис. 2Е). Этот результат был аналогичен случаю исследования макрофагов RAW264.7. Эти данные свидетельствуют о том, что лютеолин и кверцетин обладают более высокой антикластогенной активностью, чем актеозид. Напротив, кверцетин при IC50 также оказывал слабое токсическое действие на клетки (данные не представлены).

Актеозид ингибирует резорбцию кости макрофагами

Актеозид также предотвращал RANKL-опосредованную резорбцию кости дозозависимым образом, как было измерено модельной системой in vitro (рис. 3А). Резорбция кости значительно подавлялась, когда BMM инкубировали с 1 мМ актеозида (фиг. 3B). А 10 мМактеозидлечение почти полностью ослабило RANKL-индуцированную информацию BMM. Точно так же актеозид уменьшал резорбцию кости в RANKL-стимулированных клетках RAW264.7 (рис. S2A и B). Способность актеозида ингибировать резорбцию кости зависела от сроков лечения относительно стимуляции RANKL. Актеозид (10 мМ), добавленный через 4 дня после стимуляции RANKL, не уменьшал информацию в BMM, тогда как он подавлял количество образовавшихся остеокластов (рис. 3C). Этот другой результат был частично из-за области ямки, уже сформированной после 4 дней формирования стимуляции RANKL (рис. 3D).

Актеозид подавляет ранние сигнальные пути RANKL

RANKL индуцирует активацию 3 хорошо известных MAPK и NF-kB в предшественниках остеокластов, и эта активация необходима для ранней дифференцировки остеокластов. Чтобы понять возможные механизмы, с помощью которых актеозид ингибирует остеокластогенез, мы исследовали влияниеактеозидна МАРК и активацию NF-B в макрофагах. Клетки BMM и RAW264.7 предварительно обрабатывали 10 мМ актеозида в течение 2 часов, а затем стимулировали 100 нг/мл RANKL в течение 30 минут. Фосфорилирование MAPK исследовали вестерн-блоттингом и иммунометрическим анализом. RANKL индуцировал фосфорилирование p38, ERK и JNK в клетках BMM (фиг. 4A) и RAW264.7 (фиг. 4B). Актеозид предотвращал это RANKL-индуцированное увеличение p-p38, p-ERK и p-JNK. Этот результат был подтвержден иммунометрическим анализом, который показал, что предварительная обработка 10 мМактеозидзначительно ингибировали уровни фосфорилированных МАРК в этих макрофагах (фиг. 4С). Обработка RANKL увеличивала связывание NF-kB с ДНК, тогда как актеозид ингибировал RANKL-индуцированную активацию связывания NF-kB-ДНК (фиг. 5A). Это ингибирование было более заметным в BMM, чем в клетках RAW264.7. Актеозид также уменьшал стимулированное RANKL фосфорилирование p65 и IkBa в клетках BMM и RAW264.7 (рис. 5B и C). Добавление 10 мМактеозида почти полностью ингибировало как деградацию, так и активацию IkBa в BMM (рис. 5B). Для дальнейшего подтверждения того, что активация NF kB участвует в действии актеозида, конструкции промотор kB-люциферазы временно трансфицировали в клетки RAW264.7. Клетки, инкубированные со 100 нг/мл RANKL, имели 3-кратно более высокую активность промотора kB, которая была значительно ослаблена 10 мМ актеозидом (фиг. 5D).

Актеозид подавляет продукцию воспалительных цитокинов и экспрессию TNF-α, c-Fos и NFATc1 в RANKL-стимулированных макрофагах.

TNF-a, IL-1b и IL-6 играют важную роль в формировании и функционировании остеокластов, что опосредовано передачей сигналов NF-kB в RANKL-стимулированных макрофагах. RANKL стимулировал выработку этих цитокинов, и эта продукция была заметно снижена на 10 мМ.актеозидпредварительная обработка в BMM (рис. 6A). Точно так же актеозид ослаблял RANKL-индуцированную продукцию цитокинов, за исключением IL -6, в макрофагах RAW264.7 (рис. S3). Чтобы понять молекулярные механизмы действия актеозида в остеокластогенезе, мы дополнительно изучили влияние актеозида на экспрессию TNF-a, c-Fos и NFATc1. RANKL повышал экспрессию мРНК этих факторов в клетках BMM и RAW264.7 (рис. 6B и C). Предварительная обработка 10 мМ актеозида значительно ингибировала RANKL-индуцированную экспрессию этих факторов как у

BMM и ячейки RAW264.7. Предварительная обработка актеозидом также сильно снижала уровни белка c-Fos и NFATc1 в BMM, стимулированных RANKL (рис. 6D). Эти результаты свидетельствуют о том, что актеозид подавляет RANKL-индуцирующие медиаторы образования остеокластов на генном и белковом уровнях.

Актеозид снижает внутриклеточную выработку АФК в BMM дозозависимым образом. Поскольку известно, что внутриклеточная продукция АФК коррелирует с RANKL-стимулированным остеокластогенезом, мы исследовали, ингибирует ли актеозид продукцию АФК во время RANKL-опосредованной дифференцировки остеокластов с использованием проницаемого для клеток, чувствительного к окислению красителя. , DCFH-DA. Анализ проточной цитометрии показал, что средний сигнал флуоресценции, специфичный для DCF в BMM, был явно сдвинут вправо после стимуляции с помощью RANKL по сравнению с необработанными контрольными клетками (фиг. 7A). Этот сдвиг был аналогичен случаю, когда макрофаги RAW264.7 наблюдались после стимуляции RANKL (данные не показаны). Лечение BMM актеозидом снижало интенсивность сигнала DCF дозозависимым образом. Предварительная обработка 10 мМ актеозида почти полностью снижала уровни внутриклеточных АФК, продуцируемых во время дифференцировки остеокластов, до необработанных контрольных уровней (фиг. 7В).

Пероральное введение актеозида ингибирует изменение биохимических маркеров остеопороза и потерю костной массы у мышей после овариэктомии

Чтобы изучить влияние актеозида на потерю костной массы, мы подготовили модель животного с остеопорозом путем овариэктомии. В течение экспериментального периода наблюдалась значительная разница в массе тела между OVX и Shammice (данные не показаны). В группе были значительно более высокие уровни IL-1b и IL-6 в сыворотке, чем в группе имитации (рис. 8). Индуцированное овариэктомией увеличение этих воспалительных цитокинов было ослаблено пероральным введением актеозида (группа АС). Сывороточные уровни маркеров метаболизма костной ткани, таких как ALP, кальций, TRAP5b и OC, были значительно повышены в группе OVX. Из этих маркеров остеопороза повышенные уровни кальция, TRAP5b и OC у мышей OVX, по-видимому, ингибировались лечением актеозидом, тогда как уровень ALP в сыворотке не изменялся при лечении. Средняя максимальная нагрузка при переломе середины диафиза правой бедренной кости была значительно ниже в группе OVX, чем в группе имитации (рис. 9А). Лечение актеозидом увеличило максимальный резерв перелома до такового в группе имитации. Когда кортикальный слой бедренной кости был рассечен и изучен с помощью оптической микроскопии, признаки остеопороза, показанные в группе OVX, почти полностью исчезли у мышей AC (фиг. 9B). Чтобы проверить влияние актеозида на модель остеопороза, вызванного OVX, с помощью микро-КТ анализировали МПК и морфологические параметры кости в трабекулярной части легкого проксимального отдела бедренной кости. Как показано на фиг. 9C, у мышей OVX было обнаружено изменение трабекулярной архитектуры бедренной кости, тогда как это изменение уменьшалось при лечении актеозидом. Результаты анализа микро-КТ показали, что МПК, мера прочности костей, была резко снижена у мышей OVX (рис. 9D). По сравнению с группой Sham, у мышей OVX также наблюдались значительные изменения BV/TV, Tb. Сп и Тб. N, но не в Tb.Th. Пероральное введение актеозидов мышам OVX значительно предотвращало изменение BMD, а также BV/TV и Tb.N.

Актеозид не влияет на остеобластогенез в клетках костного мозга

Роль актеозида в дифференцировке остеобластов была дополнительно исследована с использованием клеток костного мозга. Как показано на фиг. 10А, обработка DAG увеличивала количество клеток, окрашенных ализариновым красным, и это не изменялось при предварительной обработке 10 мМ актеозида. Количество присутствующего красителя указывало на то, что комбинированная обработка актеозидом и ДАГ не изменила минерализацию (рис. 10В). Точно так же на DAG-индуцированное увеличение внутриклеточного содержания кальция (рис. 10C) и уровней мРНК (рис. 10D) костно-специфических маркеров, таких как Runx2, osterix, BSP и OC, не влияло предварительное лечение с помощьюактеозид.