Цистанхе для лечения воспалений и заболеваний почек: какова причина патогенной роли воспаления в поражении почек при цистинопатии?
Mar 13, 2022
Контакт:joanna.jia@wecistanche.com
Взаимодействие между галектином-3 и цистинозином раскрывает патогенную роль воспаления в поражении почек цистинозом.
Татьяна Лобрый1,2 и другие
Воспалениеучаствует в патогенезе многих заболеваний. Однако основные механизмы часто неизвестны. Здесь мы проверяем,цистиноз, белок, участвующий вцистиноз, является критическим регулятором галектина-3, член семейства белков, связывающих b-галактозидазу, во времявоспаление. Цистинозявляется лизосомной болезнью накопления и, несмотря на повсеместное проявление цистиноза,почкаявляется основным органом, пораженным болезнью.Цистинозбыло обнаружено, что он усиливает лизосомальную локализацию и деградацию галектина -3. в ктнс–/–мыши, модель мышицистиноз, галектин-3 сверхэкспрессирован впочка. Отсутствие галектина -3 у цистинозных мышей улучшает патологическую функцию и структуру почек и снижает инфильтрацию макрофагами/моноцитами в почках Ctns.–/–Гал3–/–мыши по сравнению с Ctns–/– мышей. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что галектин -3 опосредуетвоспалениеучаствует впочкапрогрессирование заболевания при цистинозе. Кроме того, было обнаружено, что галектин-3 взаимодействует с провоспалительным цитокином MonocyteChemoattractant Protein-1, который стимулирует рекрутирование моноцитов/макрофагов, и было доказано, что его уровень значительно увеличивается в сыворотке мышей Ctns–/–. а также больные сцистиноз. Таким образом, наши результаты подчеркивают новую роль взаимодействия цистиноза и галектина-3 в воспалении и дают дополнительное механистическое объяснениепочказаболевание цистиноз. Это может привести к выявлению новых мишеней для наркотиков, чтобы отсрочитьцистинозпрогресс.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА:хроническое заболевание почек; цистиноз; галектин-3;воспаление; хемоаттрактантный белок моноцитов–1
цистанхе может лечить хроническую болезнь почек и цистиноз
Основная причина воспаления заключается в том, что оксид азота может привести к образованию воспалительных клеток.Цистанхеявляется ценным китайским травяным лекарством. Его активные ингредиенты могут ингибировать секрецию оксида азота и играть роль в профилактике и лечении воспалений и заболеваний почек.
Заявление о переводе
Несмотря на лечение, у пациентов по-прежнему развивается терминальная стадия почечной недостаточности. В данном исследовании мы показали, что отсутствиецистинозприводит к нарушению лизосомальной деградации галектина-3 (Gal-3), что приводит квоспалениеи развитиехроническое заболевание почеквцистиноз. Эти результаты открывают новые перспективы в отношении потенциальных терапевтических мишеней, которые могли бы ограничить или отсрочить дегенерацию почек у пациентов сцистиноз. Таким образом, противовоспалительные препараты и ингибиторы Gal-3, такие как нестероидные противовоспалительные препараты или индометацин, могут улучшать почечный патогенез при цистинозе.
Воспалениенормальная острая реакция организма на травму или инфекцию,1но хроническийвоспалениесвязано с повреждением тканей. В случае хронических заболеваний, таких как диабет, поврежденные ткани активируют иммунную систему, что приводит к постоянной воспалительной реакции и, в конечном итоге, к дегенерации тканей.2 Цитокины являются ключевыми модуляторамивоспалениеи способны активировать или разрешатьвоспалениепроцесса.3 У пациентов схроническое заболевание почек(ХБП), повышенная концентрация цитокинов в плазме (интерлейкин [IL] -6 и фактор некроза опухоли-а) ивоспалениемаркеры (С-реактивный белок, ИЛ-6, гиалуронан и неоптерин) связаны с прогрессированием до терминальной стадии почечной недостаточности.4 Понимание специфических медиаторов, запускающих воспалительные реакции, облегчает обнаружение соответствующих мишеней для лекарственных средств для предотвращения дегенеративных повреждений. .
ЦистинозЭто аутосомно-рецессивное метаболическое заболевание, относящееся к семейству лизосомных болезней накопления и характеризующееся накоплением цистина во всех органах.5 Ген с дефектом вцистиноз, CTNS, кодирует лизосомальный котранспортер цистина/протона, цистиноз.6,7 Хотя CTNS экспрессируется повсеместно,почкаявляется первым органом, поражаемым у лиц сцистиноз. Обычно в первый год жизни у пациентов развивается синдром Фанкони, характеризующийся тяжелыми водно-электролитными нарушениями, плохим ростом и рахитом.8Впоследствии развивается ХБП, которая прогрессирует до терминальной стадии почечной недостаточности и требуетпочкатрансплантация. Накопление цистина во всех тканях в конечном итоге приводит к полиорганной дисфункции; у больных отмечаются светобоязнь и слепота, гипотиреоз, гипогонадизм, диабет, миопатия, поражение центральной нервной системы.9 На фоне C57BL/6 нокаутная модель мыши (Ctns–/–) 10 повторяет почечный фенотип пациентов с цистинозом,11 а также отложение кристаллов цистина в роговице12и нарушение функции щитовидной железы.13
В настоящем исследовании мы раскрываем новую рольцистинозввоспалениеблагодаря его взаимодействию с Гал-3. Gal-3 является членом семейства лектинов и b-галактозид-связывающих белков. 21 и участвует во многих биологических функциях, в том числевоспаление.22В контекстепочказаболеваний, было показано, что ингибирование Gal-3 снижает экспрессию провоспалительных маркеров и почечный фиброз и предотвращает снижение скорости клубочковой фильтрации в моделях гиперальдостеронизма, гипертензии или ожирения.23–26Здесь мы приводим доказательства того, что вцистиноз, отсутствиецистинозприводит к гиперэкспрессии Gal-3 впочки, усиливая инфильтрацию макрофагов и прогрессирование ХБП. Кроме того, мы идентифицируем моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (MCP-1) в качестве потенциального медиатора, открывая новые гены-мишени для лекарственной терапии. РЕЗУЛЬТАТЫ Gal-3 взаимодействует с цистинозом через свой домен распознавания углеводов. партнеры, использующие количественную масс-спектрометрию, собаку Madin-Darbyпочка(MDCK) трансдуцировали лентивирусной конструкцией для стабильной экспрессии слитого белка цистиноз-зеленый флуоресцентный белок FL (GFP). В дополнение к 9 субъединицам аденозинтрифосфатазы H+ вакуолярного типа, опубликованным ранее,19Gal-3 был идентифицирован как один из белков, взаимодействующих сцистиноз(Рисунок 1а). Это взаимодействие было дополнительно подтверждено коиммунопреципитацией с последующим вестерн-блоттингом (рис. 1b и c). Кроме того, мы показали, что взаимодействие между Gal-3 ицистинозбыл опосредован доменом распознавания углеводов Gal-3 (CRD), локализованным в С-концевом хвосте белка. Взаимодействие ингибировалось тиодигалактозидом, мощным ингибитором взаимодействия галектин-углевод (рис. 1d). Подобно всем галектинам, Gal-3 обладает сродством к гликозилированным белкам, 21 поэтому вполне вероятно, что взаимодействие с Gal-3 происходит через гликозилированную часть цистиноза, расположенную во внутрилизосомальном N-концевом хвосте белка.27
Цистинозин усиливает лизосомальную локализацию и деградацию Gal-3
Для проверки потенциальной лизосомной локализации Gal-3 при взаимодействии сцистиноз, мы показали, что Gal-3, как и катепсин D (внутрилизосомальная протеаза), был защищен от переваривания протеиназой K, тогда как оба белка переваривались, когда лизосомы были пермеабилизированы Тритоном X- 100 (рис. 2a и дополнительные Рисунок S1). Аналогичные данные были получены в лизосомах, выделенных из печени мыши, что подтверждает лизосомальную локализацию Gal-3 in vivo (рис. 2b и c). Из-за отсутствия надежного антитела для обнаруженияцистиноз, иммуноокрашивание проводили нацистиноз-GFP-экспрессирующие клеточные линии MDCK с антителом против Gal-3. Это подтвердило присутствие Gal-3 в просвете лизосом, тогда как цистиноз-GFP и Lamp-2 (лизосомальный трансмембранный белок) были обнаружены только на мембране везикул (рис. 2d).
Расследовать, еслицистинозинбыл вовлечен в торговлю Gal-3, мы проанализировали динамику какцистинози Gal-3-положительные везикулы с использованием двухцветной флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения живых клеток FL в эмбриональных фибробластах мыши (MEF) из дикого типа (WT) и Ctns–/–мыши, экспрессирующие как CTNS-DsRed, так и Gal-3-GFP. Наш анализ подтвердил, чтоцистинози Gal-3 претерпевают истинную колокализацию в Ctns–/– MEF, что подтверждается сходным пространственно-временным распределением этих молекул в зоне флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения FL (рис. 2e). Данные по MEF WT были аналогичными (данные не показаны). Более того, при анализе МЭФ, трансфицированных только Gal- 3-GFP, в цитоплазме был обнаружен Gal-3-GFP, и не наблюдалось отчетливой везикулярной структуры, в отличие от котрансфекции с CTNS-DsRed ( данные не показаны).
Эти данные были подтверждены на клетках 293Т, в которых сильный сигнал GFP в цитоплазме наблюдался в клетках, экспрессирующих только Gal-3-GFP, тогда как в клетках, экспрессирующих как Gal-3-GFP, так ицистинозин-DsRed, Gal-3-GFP был в основном локализован в лизосомах, экспрессирующих цистиноз-DsRed (рис. 3а). Более того, количественная оценка экспрессии белка Gal-3 в клетках, трансфицированных только Gal-3-GFP или Gal- 3-GFP и CTNS-DsRed, а также Gal-3-GFP и DsRed в качестве контроля было обнаружено значительно меньше белков Gal-3-GFP в клетках, котрансфицированных CTNS-DsRed, по сравнению с клетками, трансфицированными только Gal-3-GFP или котрансфицированными DsRed (рис. 3b). В целом эти результаты свидетельствуют о том, чтоцистинозинусиливает лизосомальную локализацию и деградацию Gal-3. Было показано, что цистинозин участвует в CMA.28 Белок теплового шока 70 кДа (Hsc70) участвует в CMA, способствуя разворачиванию и перемещению белков-субстратов через мембрану в просвет лизосом LAMP2A-зависимым образом.29,30 Поскольку Gal{ {8}} было предложено расщеплять с помощью CMA, 31 мы исследовали локализацию Gal-3 относительно Hsc70 в цистинотических MEF. Анализ конфокальной микроскопии подтвердил колокализацию Gal-3-GFP в Hsc70- положительных структурах как в WT (данные не показаны), так и в Ctns.–/–клеток (рис. 3c), подтверждая совместный транспорт Gal-3 с Hsc70 и предполагая, что лизосомальная интернализация, но не распознавание Gal-3 шапероном, дефектна вцистиноз.
Gal-3 участвует в воспалении почек в Ctns–/–мышей
Чтобы изучить роль Гал-3 вцистинозin vivo мы создали модель мыши с двойным нокаутом, дефицитную по обоимцистинозини Гал -3 (Ctns–/–Гал-3–/–мышей). вес, ктнс–/–, и Гал-3–/–мышей использовали в качестве контрольных субъектов. В C57BL/6 Ctns–/–мышей почечные аномалии появляются в возрасте около 10 месяцев.11 Поэтому исследования проводились в возрасте от 8 до 9 месяцев, когдапочкааномалии начинают выявляться и в 12–15 месяцев, когда аномалии почек прогрессируют. Поскольку было обнаружено, что содержание цистина различается у мужчин и женщин Ctns–/– почки, они анализировались отдельно. Если содержание цистина увеличивается с возрастом у обоих генотипов, в почках самцов и самок между мышами Ctns–/– Gal-3–/– и Ctns не наблюдалось существенной разницы.–/– мышей в возрасте от 8 до 9 месяцев и от 12 до 15 месяцев (рис. 4а).
Почечную функцию оценивали в сыворотке и моче, и не наблюдалось существенной разницы между WT и Ctns.–/–мышей в возрасте от 8 до 9 месяцев (данные не показаны), но в возрасте от 12 до 15 месяцев Ctns–/–мыши показали значительно более высокие уровни креатинина и мочевины в сыворотке по сравнению с мышами дикого типа. Интересно, ктнс–/–Гал-3–/–у мышей наблюдалась улучшенная функция почек по сравнению с Ctns–/–мыши в возрасте от 12 до 15 месяцев с более низким уровнем креатинина в сыворотке (P <{2}}.05) и мочевины (P <0,05; таблица 1).
Гистологические исследования мышей в возрасте от 8- до 9-месяца и от 12- до 15-месяцапочкаразрезы выявили наличие тяжелых аномалий в Ctns–/– почкиатрофия канальцев, ретракция клубочков и мононуклеарные инфильтраты. Слепой анализ срезов почек ранжировал степень повреждения коры от 1 (сохраненная структура ткани) до 6. Средний балл Ctns–/–мышам было 2,64 - 0,36 в возрасте 9 месяцев (n=7) и 4,12 0,37 в возрасте от 12 до 15 месяцев (n=16). В почках Ctns–/–Гал-3–/–мышей того же возраста эти аномалии были значительно менее обширными: 1.62 - 0.11 в 9 месяцев (n=21; P < 0.05,="" манн-уитни="" t-="" тест)="" и="" 3.04="" -="" 0.22="" в="" возрасте="" от="" 12="" до="" 15="" месяцев="" (n="33;" p=""><0,05, t-критерий="" манна-уитни)="" (рисунок="" 4b="" и="" дополнительный="" рисунок="" s2).="" кроме="" того,="" каждой="" ткани="" был="" присвоен="" процент="" канальцевой="" атрофии,="" а="" среднее="" значение="" для="">–/–мыши и Ctns–/–Гал-3–/–мыши были 66 процентов и 42 процента, соответственно, в возрасте от 12 до 15 месяцев (P=0,01). Кроме того, поразительная разница между Ctns–/–и ктнс–/– Гал-3–/– почкасрезах было наличие нескольких мононуклеарных инфильтратов в Ctns–/–Гал-3–/–срезах, в то время как тяжелые инфильтраты постоянно наблюдались в Ctns–/– почка(Рисунок 4б).
Мы охарактеризовали мононуклеарные инфильтраты, наблюдаемые при гистологическом исследовании у Ctns в возрасте от 8- до 9-месяцев.–/– почкикак макрофаги/моноциты путем совместного иммунного окрашивания с CD68 и CD45, а также с CD68 и основным классом гистосовместимости II (дополнительный рисунок S3), но не с CD68 и CD163, что позволяет предположить, что эти макрофаги имеют M1- подобный провоспалительный профиль.32 ,33 Количественная оценка CD68- положительных клеток выявила значительно меньшее количество макрофагов/моноцитов у WT, Gal-3–/–, и ктнс–/–Гал-3–/– почкипо сравнению с Ctns–/– почки(Рисунок 4c), подтверждая гистологические данные (Рисунок 4b).
В целом эти данные позволяют предположить, что Gal-3 участвует в рекрутировании макрофагов/моноцитов при цистинозе.почкии что его отсутствие улучшает течение болезни почек у Ctns.–/–мышей. Следовательно, это предполагает, чтовоспалениеответственен, по крайней мере частично, за ухудшение состояния почек при Ctns–/– мышей.
Ctns-дефицитные почки демонстрируют сверхэкспрессию Gal-3
С помощью вестерн-блоттинга мы обнаружили, что экспрессия Gal-3 значительно увеличилась впочкииз 12-месячного Ctns–/–мышей по сравнению с мышами дикого типа (рис. 5а и б). Чтобы выяснить, является ли эта повышенная экспрессия Gal-3 специфичной для Ctns–/– почки, мы количественно оценили экспрессию Gal-3 на уровне транскрипта и белка впочкиу мышей с ХБП, индуцированной стандартной субтотальной 2-ступенчатой нефрэктомией, и у животных, перенесших фиктивную операцию. WT и Ctns–/–мышей использовали в качестве контрольных субъектов. Количество транскриптов Gal-3 было значительно увеличено в Ctns–/– и фиктивных почках, но значительно увеличилось при ХБПпочкипо сравнению с мышами дикого типа (рис. 5c). Напротив, на уровне белка Gal-3 был обнаружен только в Ctns.–/–почек, убедительно предполагая, что только Ctns–/–почки не смогли расщепить белок Gal-3 (рис. 5d). Иммунофлуоресцентное окрашивание Gal-3 у мышейпочкав возрасте от 8 до 9 месяцев также продемонстрирована сверхэкспрессия Gal-3 в Ctns.–/– почкипо сравнению с ВТпочки(Рисунок 5e). Более того, Gal-3 экспрессировался макрофагами CD68+, а также почечными клетками в Ctns.–/– почкив возрасте от 8 до 9 месяцев (дополнительный рисунок S4). В целом, эти данные согласуются с уменьшением деградации Gal-3 в отсутствиецистинозкак показано in vitro (рис. 3а и б), что приводит к накоплению белка Gal-3 в Ctns–/– почки.
Отсутствие цистинозина приводит к увеличению содержания MCP-1 в сыворотке посредством активации Gal-3.
Гал-3 регулируетвоспалениес помощью различных механизмов.34 Таким образом, чтобы получить более глубокое представление о механизмецистиноз, мы исследовали экспрессию различных провоспалительных или противовоспалительных цитокинов в сыворотке от 12- до 15-месячных WT, Ctns–/–, Гал-3–/–, и ктнс–/–Гал- 3–/–мышей. Уровни шести цитокинов были измерены с помощью массива цитометрических шариков мыши, MCP-1, интерферона-g, фактора некроза опухоли и IL-10, IL-6 и IL-12p70. Только экспрессия MCP-1 была значительно увеличена в сыворотке мышей Ctns-/- по сравнению с мышами WT и Gal-3-/-, а также с Ctns–/–Гал-3–/–мышей, у которых уровни MCP-1 в сыворотке были сопоставимы с мышами дикого типа (рис. 6а). MCP-1 продуцируется различными типами клеток, при этом основным источником MCP-1 являются макрофаги и моноциты,35 и он действует как хемоаттрактант для моноцитов и макрофагов, регулирующий их миграцию и инфильтрацию. Напротив, в том же возрасте экспрессия Gal-3 оказалась сходной в сыворотке мышей Ctns-/- (44,33 ± 9,81 нг/мл; n=5) и мышей дикого типа (40,{{12}). },41 нг/мл, n=7).
Взаимосвязь между Gal-3 и MCP-1 была дополнительно исследована с помощью коиммунопреципитации с использованием Gal-3-GFP и MCP-1-DsRed- или Gal-3- GFP и CTNS-DsRed– (в качестве положительного контроля), экспрессирующие клетки 293T. Наблюдалось взаимодействие между Gal-3 и MCP-1 (рис. 6b), что свидетельствует о прямой индукции MCP-1 с помощью Gal-3. Инкубация с N-ацетил-D-лактозамином (LacNAc), ингибитором Gal-3 CRD, показала, что, в отличие отцистинозинвзаимодействие, CRD не участвует во взаимодействии между Gal-3 и MCP-1 (рис. 6c).
Чтобы оценить, относится ли это открытие к людям, мы измерили уровни Gal-3 и MCP-1 у пациентов сцистинозкоторые не проходили иммуносупрессивную терапию или принимали противовоспалительные препараты. Хотя было обнаружено, что уровень Gal-3 в сыворотке пациентов с цистинозом немного повышен по сравнению со здоровыми донорами, разница не была значимой (рис. 6д), подтверждая наши результаты, полученные в Ctns.–/–мышей. Только у 2 пациентов был высокий уровень Gal-3 (25,34 и 39,54 нг/мл); они считались выбросами и поэтому не были включены в рисунок 6e. Напротив, с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, направленного против MCP-1 человека (рис. 6d), было обнаружено, что уровни MCP-1 в сыворотке значительно повышены у пациентов сцистиноз(252,1 - 18,4 пг/мл; n=19; возрастной диапазон от 1 до 23 лет), несмотря на лечение цистеамином, по сравнению со здоровыми субъектами контрольной группы (166,9 -13,5 пг/мл, n=1). 0; возрастной диапазон 8–63 года) (P <0,001). корреляции="" между="" возрастом="" и="" уровнем="" mcp-="" 1="" у="" обоих="" пациентов="">цистинози здоровые доноры (данные не показаны).
Цистанхеимеетпротивовоспалительное средствохарактеристики
ОБСУЖДЕНИЕ
Несмотря на то, что цистин накапливается во всех тканях у больных сцистиноз, почки являются органами, наиболее уязвимыми к повреждениям. Таким образом, мы считаем, что накопление цистина не является единственной причиной дегенерации почек. Здесь мы описываем новую роль дляцистинозинв регулированиивоспалениеучастие в развитии хронической почечной недостаточностицистиноз. Это исследование может объяснить, почему у пациентов развивается терминальная стадия почечной недостаточности, несмотря на терапию цистеамином.
Изучение молекулярных партнеров цистиноза выявило прямое взаимодействие с Gal-3, которое может ингибироваться ингибиторами Gal-3 CRD. Недавние исследования показали, что Gal-3 может взаимодействовать с гликанами, расположенными в просвете лизосом, после лизосомального повреждения, такого как накопление кристаллов.36 В нашем исследовании взаимодействие между Gal-3 ицистинозинизучали на здоровых клетках, экспрессирующихцистинозини, следовательно, не накапливает цистеин или кристаллы цистина. Кроме того, сверхэкспрессия как Gal-3, так и цистинозина в здоровых клетках модифицировала субклеточную локализацию Gal-3, которая затем была локализована в лизосомах, по сравнению со сверхэкспрессией только Gal-3, которая находился в цитоплазме. Эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что взаимодействие между Gal-3 и цистинозином происходит независимо от лизосомального повреждения и что цистинозин активно отвечает за лизосомальную локализацию Gal-3. Ранее было показано, что Gal-3 расщепляется посредством лизосомально-зависимого протеолиза в отсутствие Abl и Arg, 2 тирозинкиназ.31
Кроме того, мы показали, чтоцистинози Gal-3 совместно локализуются в динамических везикулярных структурах и вместе мобилизуются пространственно-временным образом.Цистинозинранее был связан с механизмами переноса лизосомального LAMP2A, единственного известного рецептора CMA, который неправильно локализован вцистиноз.28Ранее было показано, что деградация Gal-3 опосредована CMA.31Анализ конфокальной микроскопии подтвердил колокализацию Gal-3 в Hsc70-положительных структурах в обоих Ctns.–/– и клетки WT, поддерживающие совместный транспорт Gal-3 с Hsc70 для презентации в лизосомах и деградации с помощью CMA, поскольку Hsc70 помогает транслокации белков-субстратов через мембрану в просвет лизосом.29,30Возможная интерпретация наших результатов состоит в том, чтоцистинозинрегулирует транспортировку и доставку Gal-3 в CMA-активные лизосомы для деградации.
Этот новый путьцистинозин-зависимая лизосомальная локализация и деградация Gal-3 поддерживается in vivo, поскольку Ctns-дефицитные мыши демонстрируют сверхэкспрессию Gal-3 впочка. Более того, в то время как увеличение мРНК Gal-3 было ограничено в Ctns–/–почках по сравнению с другой моделью ХБП большое количество белка Gal-3 было обнаружено только в Ctns–/– почки. Эти данные убедительно подтверждают вывод о том, чтоцистинозинучаствует в деградации белка Gal-3, который может контролировать сверхэкспрессию мРНК Gal-3 в условиях стресса, таких как ХБП.
Gal-3 играет несколько биологических ролей, в том числе при острых и хроническихвоспалениепривлекая моноциты и макрофаги.37,38в ктнс–/– мышей, мы наблюдали тяжелые мононуклеарные инфильтраты преимущественно впочкакак описано ранее,11,39которые были охарактеризованы как моноциты/макрофаги. Напротив, почки из Ctns с двойным нокаутом–/–Гал-3–/–у мышей было обнаружено очень мало инфильтратов моноцитов/макрофагов, что убедительно свидетельствует о том, что Gal-3 участвует ввоспалениев почках Ctns–/–мышей. В контексте повторяющихся повреждений тканей Gal-3 может вызвать переход в хроническую форму.воспалениеи фиброз.34В соответствии с этими выводами наши данные демонстрируют участие Gal-3 в прогрессировании ХБП уцистиноз. Действительно, двойной нокаут Ctns–/– Гал-3–/–мыши показали себя лучшепочкафункция и структура по сравнению с Ctns–/–мышей. Точно так же у мышей с дефицитом Gal-3 наблюдается меньший почечный фиброз впочкапо сравнению с мышами WT после односторонней обструкции мочеточника,40 и мыши с нокаутом Gal-3, подвергшиеся ишемически-реперфузионному повреждению, имели лучшую функцию почек по сравнению с мышами WT, подвергшимися ишемически-реперфузионному повреждению.41
Хотя была обнаружена корреляция между уровнями Gal-3 в плазме и развитием ХБП,42 не наблюдалось различий в экспрессии Gal-3 в сыворотке мышей и людей, пораженныхцистинози здоровые контрольные субъекты. Измеряя различные уровни цитокинов в сыворотке, мы обнаружили значительное увеличение MCP-1 в Ctns.–/–мыши, тогда как Ctns–/–Гал-3–/–мыши имели уровни, сравнимые с таковыми у мышей WT. MCP-1 представляет собой цитокин, который может высвобождаться в сыворотке и формировать градиент для привлечения моноцитов и макрофагов к месту повреждения.35 Повышение MCP-1 в сыворотке Ctns–/–мыши по сравнению с Ctns–/–Гал-3–/–мышей не зависит от накопления цистина, посколькупочкасодержание цистина было одинаковым у обоих генотипов. Кроме того, несмотря на лечение цистеамином, которое позволило выйти цистину из лизосом, было обнаружено, что MCP-1 значительно повышен в сыворотке пациентов сцистинозпо сравнению со здоровыми донорами. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что отсутствиецистинозин, а не накопление цистина, отвечает за увеличение MCP-1 в сыворотке. Кроме того, мы показали прямое взаимодействие между Gal-3 и MCP-1, которое было недавно предложено Gordon-Alonso et al.43, но больше не изучалось. Механизм Gal-3-опосредованной активации MCP-1 здесь не изучался. Гипотезой является присутствие сигнального пептида в MCP-1 человека, который может быть расщеплен для усиления его секреции.44 Более того, плазмин может расщеплять С-конец MCP-1, что увеличивает его хемоаттрактант. 45 Кроме того, коррелируя с нашими данными, ингибирование MCP-1 в мышиной модели диабетической нефропатии предотвращало инфильтрацию почечных макрофагов и улучшало функцию почек. 46,47 Вцистинознаши данные убедительно свидетельствуют о том, что отсутствиецистинозинприводит к увеличению Gal-3, который активирует мобилизацию крови MCP-1, усиливая почечныйвоспалениеи развитиехроническое заболевание почек.
Эти результаты открывают новые перспективы в отношении потенциальных терапевтических мишеней, которые могли бы ограничить или отсрочить дегенерацию почек у пациентов сцистиноз. Действительно, было обнаружено, что нестероидные противовоспалительные препараты, такие как аспирин и индометацин, ингибируют экспрессию Gal-3 путем ингибирования его транскрипции.48 Индометацин фактически используется для регуляции полиурии и полидипсии прицистиноз,49 и недавнее исследование 307 европейских пациентов с цистинозом показало улучшение почечных исходов у пациентов, получавших индометацин.50 В свете нашего исследования использование индометацина или нестероидных противовоспалительных препаратов дляцистинозпациенты могут быть пересмотрены.
МЕТОДЫ
Эксперименты на животных
C57BL/6 Ctns–/–мышей предоставил Dr. Antignac (Inserm U1163, Париж, Франция). C57BL/6 галектин-3 ноль (Gal-3–/–) мышей предоставили доктор Фу-Тонг Лю (Калифорнийский университет, Дэвис) и доктор Джеррольд М. Олефски (Калифорнийский университет, Сан-Диего). Стратегия разведения для получения WT, Ctns–/–, Гал-3–/–, Ctns–/– и Gal- 3–/–мышей описано в дополнительных методах.
Сотовые линии
беспорядок был получен из биопсий кожи новорожденных WT и Ctns–/–мышей. Клеточные линии MEF, 293T и MDCK типа II (АТСС, Манассас, Вирджиния) выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки или эмбриональной бычьей сыворотки, 100 единиц/мл пенициллина, 0,1 мг/мл стрептомицина. и 2 мМ L-глутамина.
Коиммунопреципитация и масс-спектрометрический анализ
Для изучения белок-белковых взаимодействий клетки MDCK трансдуцировали с использованием лентивирусной основы вектора pRRL.SIN.cPPT.PGK/WPRE для стабильной экспрессиицистинозин-GFP.51Коиммунопреципитацию проводили, как описано в дополнительных методах. Ко-иммунопреципитированные белки разделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и анализировали с помощью масс-спектрометрии, LTQ Orbitrap, как уже описано.19
Клетки 293T, экспрессирующие Gal-3-GFP и MCP-1-DsRed или Gal-3-GFP и CTNS-DsRed, использовали для совместной иммунопреципитации, как описано в дополнительных методах. Ко-иммунопреципитированные белки разделяли с помощью SDS-PAGE, а Gal-3-связывающий MCP-1 определяли с использованием антитела против DsRed (Clontech Laboratories, Mountain View, CA).
Субклеточная фракция
Восемь печени были получены от мышей C57BL/6 и приготовлены, как описано ранее.52 Условия градиента были практически такими же, как описано в оригинальной публикации,52 за исключением того, что вместо метризамида использовали никоденз.
Лечение ингибитором Gal-3 и протеиназой K
Лизаты изцистинозинКлетки -GFP MDCK и 293T, экспрессирующие Gal-3-GFP и CTNS-DsRed или Gal-3-GFP и MCP-1-DsRed, инкубировали с или без 5 мМ тиодигалактозида или 5 мМ N -Ацетил-D-лактозамин, соответственно, 2 ингибитора Gal-3 CRD. После 30 минут инкубации при 4 -°С при постоянном встряхивании лизаты инкубировали с 50 мл микрошариков анти-GFP и проводили иммунопреципитацию, как указано ранее. Осажденные белки разделяли с помощью SDS-PAGE на 10% геле.
Лизаты изцистинозинКлетки -GFP MDCK и фракции, обогащенные лизосомами печени мыши, инкубировали с 2% Triton X-100 или без него в течение 10 минут при 4 - C, а затем инкубировали 30 минут с 2,5 мг/мл и 25 мг или без них. /мл протеиназы К соответственно. После инактивации фермента 1 мМ фенилметилсульфонилфторидом в течение 5 минут при 4 -°С белки разделяли с помощью SDS-PAGE на 10-процентном геле.
Иммунофлуоресцентный анализ
Фиксированные клетки MDCK инкубировали с антителами против Lamp-2 (OriGeneTechnologies, Rockville, MD) и антителами против Gal-3 (CedarlaneLaboratories, Burlington, Ontario, Canada) в течение 2 часов при комнатной температуре, а затем с Alexa Fluor. вторичное антитело 555 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) в течение 1 часа при комнатной температуре. Конфокальные изображения получали с помощью микроскопа Zeiss LSM 700 (Carl ZeissMicroscopy, Йена, Германия).
Клетки 293T, временно экспрессирующие только Gal-3-GFP, Gal-3-GFP и DsRed или Gal-3-GFP ицистинозин-DsRed культивировали на покровном стекле перед нанесением на предметное стекло. Клетки визуализировали с использованием прибора Keyence BZ-X700 (Keyence Corp., Осака, Япония).
Исправленопочкасрезы инкубировали в течение ночи при 4 - C с анти-CD68 (BioLegend, Сан-Диего, Калифорния) или анти-Gal-3 антителом (BioLegend), а затем с вторичным антителом Alexa Fluor 488 (Invitrogen), 1 час. при комнатной температуре. Изображения были получены с использованием прибора Keyence BZ-X700. Количественная оценка экспрессии CD68 описана в дополнительных методах.
MEF, экспрессирующие Gal-3-GFP, окрашивали с использованием антитела против Hsc70 (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) и визуализировали, как описано ранее.53
Флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения FL
WT и Ctns–/–MEF, экспрессирующий Gal-3-GFP, и CTNS-DsRed высевали на чашку с 4-камерным 35- мм боросиликатным дном (Cellvis, Mountain View, CA). После 2 дней культивирования MEF анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения FL, как описано ранее.54и в дополнительных методах. Изображения анализировали с помощью программного обеспечения ImageJ.
Анализ выражения Gal-3
Клетки 293T, экспрессирующие Gal-3-GFP, Gal-3-GFP и DsRed или Gal-3-GFP и CTNS-DsRed, и эксплантированныепочкилизировали в буфере для радиоиммунопреципитации, содержащем смесь ингибиторов протеиназ. Белки разделяли на 4–15-процентном геле и выявляли с использованием антител против Gal-3 (Abcam, Кембридж, Великобритания) или антител против глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). .
почкигомогенизировали в RLT-буфере, содержащем b-меркаптоэтанол, с использованием Precellys 24 (Bertin Instruments, Montigny-le-Bretonneux, France). РНК выделяли и проводили Gal-3-специфическую цифровую полимеразную цепную реакцию, как описано в дополнительных методах. Экспрессию транскрипта Gal-3 выражали как отношение по сравнению с эндогенным контролем 18S. Для определения уровня Gal-3 в сыворотке мышей и человека использовали твердофазный иммуноферментный анализ (Abcam) в соответствии с инструкциями производителя.
Функция почек
Уровни фосфатов в сыворотке и моче, креатинина в сыворотке и мочевины оценивали с использованием набора для анализа фосфата QuantiChrom, набора для анализа креатинина QuantiChrom и набора для анализа мочевины QuantiChrom (BioassaySystems, Hayward, CA). Уровни белка в моче измеряли с использованием набора для анализа белка Pierce BCA (Rockford, IL).
гистология
Когда мышей убивали,почкисобирали, фиксировали в формалине и заливали в парафин. Срезы, окрашенные гематоксилином и эозином, были проанализированы доктором Мари Клэр Гублер вслепую, как описано в дополнительных методах.
Измерение содержания цистина
Измерение цистина в тканях выполняли с помощью масс-спектрометрии (LC-ESI-MS/MS), как описано ранее.39
Стандартная нефрэктомия и ложная операция
У мышей ХБП индуцировали стандартной промежуточной 2-стадийной нефрэктомией, как описано ранее.55,56Группа ложных мышей подверглась той же процедуре, но без надрезов.почкасалфетка.
Уровень цитокинов в сыворотке
Для измерения уровня цитокинов в сыворотке мышейвоспалениенабор цитометрических шариков (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) выполняли в соответствии с инструкциями производителя. Концентрацию МСР-1 в сыворотке человека определяли с помощью иммуноферментного анализа, направленного против МСР-1 (Abcam, Кембридж, Великобритания) в соответствии с инструкциями производителя.
статистический анализ
Значения выражены как среднее - SEM. Значимость результата оценивали с помощью непарного 2-хвостого t-теста или непарного 2-хвостого t-критерия с поправкой Уэлча. Групповые сравнения 3 или более условий были сделаны с помощью параметрического дисперсионного анализа с последующим тестом множественных сравнений Тьюки для попарных сравнений. Гистологические оценки сравнивали с использованием теста Манна-Уитни. Анализы проводились с использованием программного обеспечения Prism 6 (GraphPad, Сан-Диего, Калифорния). Значение P менее 0,05 считалось значимым.
Утверждение исследования
Эксперименты на мышах проводились в соответствии с протоколами Институционального комитета по использованию животных. Использование человеческих тканей в этом исследовании было одобрено Калифорнийским университетом в Сан-Диего, Программа защиты человеческих исследований.
РАСКРЫТИЕ
НК является членом Научного совета и членом Попечительского советацистинозИсследовательский фонд. SC является соучредителем, акционером и членом как научного совета, так и совета директоров GenStem TherapeuticsInc. Условия этого соглашения были рассмотрены и одобрены Калифорнийским университетом в Сан-Диего в соответствии с его политикой в отношении конфликта интересов. Все остальные авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.
предоставление Гал-3–/–мышей. Мы благодарим Lou Devanneaux и NicholeFlerchinger за их техническую помощь и Элизабет Souter за рецензирование рукописи. Мы благодарим Кристофера Альфонсо из BDBioscience за предоставление мыши.воспалениецитометрический массив шариков и за помощь в интерпретации результатов. Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения RO1-DK090058 и R01-DK110162,ЦистинозИсследовательский фонд и Калифорнийский институт регенеративной медицины (CIRM, CLIN-09230). TL поддерживается стипендией для выпускников Vaincre Les MaladiesLysosomales. AB и JZ поддерживаются стипендией отцистинозИсследовательский фонд. UCSD Neuroscience MicroscopyShared Facility финансировался грантом Национального института неврологических расстройств и инсульта (NINDS) P30-NS047101.
ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Меджитов Р. Происхождение и физиологическая рольвоспаление. Природа. 2008; 454:428–435.
2. Донат МОЙ. Таргетингвоспалениепри лечении сахарного диабета 2 типа. Сахарный диабет Ожирение Metab. 2013; 15 (прил. 3): 193–196.
3. Jaffer U, Wade RG, Gourlay T. Цитокины при синдроме системной воспалительной реакции: обзор. HSR Proc Интенсивная терапия Кардиоваскулярная анестезия. 2010;2:161–175.
4. Pecoits-Filho R, Heimburger O, Barany P, et al. Связь между циркулирующими воспалительными маркерами и остаточной функцией почек у пациентов с ХПН. Ам ДжПочкаДис. 2003;41:1212–1218.
5.Гал В.А., Тоне Дж.Г., Шнайдер Дж.А.Цистиноз. N Engl J Med. 2002; 347: 111–121.
6. Черки С., Калацис В., Труньян Г., Антиньяк С. Преследованиецистинозинк лизосомальной мембране требуется сигнал на основе тирозина и новый мотив сортировки. Дж. Биол. Хим. 2001; 276:13314–13321.
7. Калацис В., Шерки С., Антиньяк С., Гаснье Б.Цистинозин, белок дефектен вцистиноз, является переносчиком лизосомального цистина, управляемым H( ). EMBO J. 2001; 20: 5940–5949.
8. Черки С., Куртуа П.Дж. Почечный синдром Фанкони уцистиноз: патогенные идеи и терапевтические перспективы. Нат Рев Нефрол. 2017;13:115–131.
9. Нестерова Г., Галь В. Нефропатическаяцистиноз: поздние осложнения полисистемного заболевания. Педиатр Нефрол. 2008; 23: 863–878.
10. Черки С., Севин С., Хамард Г. и др. Интрализосомальное накопление цистина у мышей, лишенныхцистинозин, белок дефектен вцистиноз. Мол Селл Биол. 2002; 22:7622–7632.
11. Нево Н., Чол М., Байе А. и соавт. Почечный фенотипцистинозмышиная модель зависит от генетического фона. Трансплантация нефролового циферблата. 2010;25:1059–1066.
12. Калацис В., Серратрис Н., Хипперт С. и др. Глазные аномалии вцистинозживотная модель имитирует патогенез заболевания. Педиатр Рез. 2007; 62: 156–162.
13. Руководство Chevronnay HP, Janssens V, Van Der Smissen P, et al. Модель на мышах предполагает два механизма изменений щитовидной железы у младенцев.цистиноз: снижение синтеза тиреоглобулина из-за стресса эндоплазматического ретикулума/реакции развернутого белка и нарушения лизосомального процессинга. Эндокринология. 2015; 156: 2349–2362.
14. Бродин-Сарториус А., Тете М.Дж., Ниаудет П. и соавт. Терапия цистеамином задерживает прогрессирование нефропатии.цистинозу поздних подростков и взрослых.ПочкаМеждунар. 2012; 81: 179–189.
15. Черки С. Терапия цистеамином: лечениецистиноз, а не лекарство.ПочкаМеждунар. 2012; 81: 127–129.
16. Галь В.А., Балог Дж.З., Клета Р. Нефропатическаяцистинозу взрослых: естественное течение и эффекты пероральной терапии цистеамином. Энн Интерн Мед. 2007; 147: 242–250.
17. Черки С., Куртуа П.Дж. Почечный синдром Фанкони уцистиноз: патогенные идеи и терапевтические перспективы. Нат Рев Нефрол. 2017;13:115–131.
18. Наполитано Г., Джонсон Дж.Л., Хе Дж. и др. Нарушение шаперон-опосредованной аутофагии приводит к дефектам селективной лизосомной деградации при лизосомной болезни накопления.цистиноз. EMBO Мол Мед. 2015;7:158–174.
19. Анджеевская З., Нево Н., Томас Л. и соавт.Цистинозинявляется компонентом вакуолярного комплекса H-АТФаза-регулятор-rag, контролирующего мишень передачи сигналов рапамицинового комплекса 1 у млекопитающих. J Am Soc Нефрол. 2016; 27: 1678–1688.
20. Рега Л.Р., Полищук Е., Монтефуско С. и соавт. Активация транскрипционного фактора EB устраняет лизосомальные аномалии при цистинозе.почкаклетки.ПочкаМеждунар. 2016;89:862–873.
21. Dumic J, Dabelic S, Flogel M. Galectin-3: история с открытым концом. Биохим Биофиз Акта. 2006; 1760: 616–635.
22. Шаккитано С., Лавра Л., Морганте А. и др. Галектин -3: одна молекула для алфавита болезней от А до Я. Int J Mol Sci. 2018;19(2).
23. Кальвье Л., Мартинес-Мартинес Э., Миана М. и др. Влияние ингибирования галектина -3 на альдостерон-индуцированные повреждения сердца и почек. Сердечная недостаточность JACC. 2015;3:59–67.
24. Френей А.Р., Ю.Л., ван дер Вельде А.Р. и соавт. Фармакологическое ингибирование галектина-3 защищает от гипертонической нефропатии. Am J Physiol Renal Physiol. 2015; 308:F500–F509.
25. Колаци-Жоанну М., Прайс К.Л., Виньярд П.Дж., Лонг Д.А. Модифицированный цитрусовый пектин снижает экспрессию галектина -3 и тяжесть заболевания при экспериментальном остром заболевании.почкарана. PloS Один. 2011;6:e18683.
26. Мартинес-Мартинес Э., Ибаррола Дж., Клавьер Л. и др. Блокада галектина -3 уменьшает почечный фиброз в двух экспериментальных нормотензивных моделях почечного повреждения. PloS Один. 2016;11:e0166272.
27. Нево Н., Томас Л., Чуон С. и др. Влияниецистинозгликозилирование на стабильность белка с помощью дифференциального динамического мечения стабильных изотопов аминокислотами в клеточной культуре (SILAC). Мол клеточная протеомика. 2017; 16: 457–468.
28. Наполитано Г., Джонсон Дж.Л., Хе Дж. и др. Нарушение шаперон-опосредованной аутофагии приводит к дефектам селективной лизосомной деградации при лизосомной болезни накопления.цистиноз. EMBO Мол Мед. 2015;7:158–174.
29. Маески А.Е., Дайс Дж.Ф. Механизмы шаперон-опосредованной аутофагии. Int J Biochem Cell Biol. 2004; 36: 2435–2444.
30. Се В., Чжан Л., Цзяо Х. и др. шаперон-опосредованная аутофагия предотвращает апоптоз путем деградации BBC3/PUMA. Аутофагия. 2015;11:1623–1635.
31. Li X, Ma Q, Wang J, et al. Тирозинкиназы c-Abl и Arg регулируют лизосомальную деградацию онкопротеина галектина-3. Смерть клеток 2010;17:1277–1287.
32. Такеучи Х., Танака М., Танака А. и др. Преобладание М2-поляризованных макрофагов при раке мочевого пузыря влияет на ангиогенез, степень опухоли и инвазивность. Онкол Летт. 2016; 11:3403–3408.
33. Чавес-Галан Л., Оллерос М.Л., Весин Д., Гарсия И. Гораздо больше, чем макрофагов М1 и М2, есть также макрофаги CD169( ) и TCR( ). Фронт Иммунол. 2015;6:263.
34. Хендерсон Н.К., Сети Т. Регулированиевоспалениеот галектина-3. Immunologic Rev. 2009; 230:160–171.
35. Дешмане С.Л., Кремлев С., Амини С., Савайя Б.Е. Хемоаттрактантный белок моноцитов-1 (MCP-1): обзор. J Интерферон Цитокин Res. 2009; 29: 313–326.
36.Сковыра М.Л., Шлезингер П.Х., Нейсмит Т.В., Хэнсон П.И. Активация механизма ESCRT способствует эндолизосомной репарации. Наука. 2018;360(6384).
37. Маккиннон А.С., Фарнворт С.Л., Ходкинсон П.С. и соавт. Регуляция альтернативной активации макрофагов галектином-3. Дж Иммунол. 2008; 180: 2650–2658.
38. Сано Х., Хсу Д.К., Ю Л. и др. Галектин человека -3 представляет собой новый хемоаттрактант для моноцитов и макрофагов. Дж Иммунол. 2000;165:2156–2164.
