SNP Rs708727, связанный с болезнью Альцгеймера, в SLC41A1 может увеличить риск болезни Паркинсона: отчет расширенного словацкого исследования, часть 2

2.2. Генетический анализ

Генетический анализ проводился на A1 SNP rs11240569, rs708727 и rs823156 в когорте из 508 пациентов с БП (против 150 пациентов в пилотном исследовании) и в когорте из 472 контрольных пациентов (против 120 контрольных пациентов в пилотном исследовании) [37]. Таким образом, количество больных БП и контрольных пробандов в этом исследовании увеличилось в 3,4-раза и 3,9 раза соответственно по сравнению с пилотным исследованием.

У многих людей с возрастом наблюдается потеря памяти, но у людей с болезнью Паркинсона изменения памяти могут быть более выраженными. Однако мы не должны думать, что люди с болезнью Паркинсона обязательно страдают от ухудшения памяти, потому что мы можем кое-что сделать, чтобы помочь им сохранить память.

Во-первых, регулярные занятия по тренировке мозга могут помочь людям с болезнью Паркинсона улучшить память. Эти занятия могут включать в себя: решение судоку, настольные игры, решение головоломок и многое другое. Благодаря этим занятиям они могут тренировать свою память, улучшать работу мозга и поддерживать свое психическое состояние.

Во-вторых, диета также оказывает очень важное влияние на память пациентов с болезнью Паркинсона. В рацион мы можем добавить некоторые продукты, богатые белком и питательными веществами, например, рыбу, фасоль, орехи и т. д. Эти продукты могут помочь нам оставаться здоровыми и улучшить память.

Наконец, регулярные физические упражнения также могут помочь людям с болезнью Паркинсона улучшить память. Физические упражнения не только помогают нам оставаться физически здоровыми, но, что более важно, улучшают работу нашего мозга. Благодаря регулярным физическим упражнениям они могут улучшить сердечно-легочную функцию, повысить эластичность мышц и костей и улучшить память.

В целом, наблюдается ли ухудшение памяти у людей с болезнью Паркинсона, зависит от их образа жизни и привычек в еде, а также от того, уделяют ли они внимание таким вещам, как тренировка мозга и физические упражнения. Я считаю, что если мы уделяем внимание этим аспектам, память пациентов с болезнью Паркинсона можно эффективно улучшить. Видно, что нам необходимо улучшить нашу память. Cistanche Deserticola может значительно улучшить память, поскольку Cistanche Deserticola — это традиционное китайское лекарственное средство, обладающее множеством уникальных эффектов, одним из которых является улучшение памяти. Эффективность мясного фарша обусловлена ​​множеством содержащихся в нем активных ингредиентов, включая карбоновую кислоту, полисахариды, флавоноиды и т. д. Эти ингредиенты могут способствовать здоровью мозга различными способами.

Нажмите, чтобы узнать, как улучшить работу мозга

In the sub-cohort of 96 PD patients and 100 controls, we also examined A1 SNPs rs9438393, rs56152218, and rs61822602 (first identified in the PD sub-cohort by the Sanger sequencing and afterward by RFLP analysis of the sub-cohort of controls). They were not analyzed in the pilot study (37]. The allele and genotype count and frequencies (fq) for each particular A1 SNP in the PD and the control cohorts are summarized in Table 3. The minor allele fa was, for rs11240569 (C>A) в нашей общей когорте (случаи БП + контрольные пробанды), примерно сопоставимой с диапазоном fq общей популяции минорных аллелей (MATPFR), указанным в базах данных gnomAD и ExAC, следующим образом: fqo (наблюдаемое) по сравнению с (сообщаемым) {{1 }}% ​​против 29-30%.

Минорный аллель fq для rs708727 (G > A) в нашей общей когорте был выше, чем MATPFR в базах данных gnomAD и ExAC (fq, против=40% против 29-30%), но был сопоставим с минорный аллель rs708727 fq, указанный для европейского населения в базе данных ALFA (41%). Минорный аллель rs823156 (A > G) fq в нашей общей когорте составлял 17% и, таким образом, был ниже, чем MATPFR в базах данных gnomAD и ExAC (23–30%), но был сопоставим с минорным аллелем rs823156 fq, зарегистрированным для европейской популяции в база данных АЛЬФА (18%).

Частота минорного аллеля rs9438393 (A > G) в общей когорте составила 40% и, следовательно, была заметно выше, чем MATPFR 26–29%, зарегистрированный в базах данных gnomAD и TOPMED, но была сопоставима с минорным аллелем rs9438393. Частота аллелей указана в базе данных ALFA для европейского населения (41%). Минорный аллель rs56152218 (T > C) в общей когорте присутствовал с fq 38%, что находится в пределах MATPFR 32–46%, согласно данным баз данных ALSPAC, TOPMED и ALFA (европейское население).

Интересно, что во вьетнамской, корейской и катарской популяциях минорным аллелем является T, а не C, как это наблюдается в европейской популяции [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term{{0} }rs56152218, по состоянию на 2 августа 2021 г.)]. Было обнаружено, что fq минорного аллеля rs61822602 (G > T) составляет 12%. Это сопоставимо с частотами аллеля T, указанными в базах данных ALSPAC и TWINSUK (12% и 13% соответственно), но намного выше, чем fq аллеля T, зарегистрированная в европейской популяции в базе данных ALFA (6%).

Все протестированные SNP A1 в нашей когорте PD и контрольной когорте находились в равновесии Харди-Вайнберга (HWE; Таблица 4).

Затем мы рассчитали отношение шансов (OR) минорного аллеля и генотипов, содержащих минорный аллель, для каждого тестируемого SNP. Эти результаты суммированы в таблице 5. Генотип GA в rs708727 был связан с БП (OR=1.42 (1,08–1,87), p=0.01) в нашей популяции. Кроме того, мы проверили связь конкретных генотипических комбинаций для каждого тестируемого SNP с БП в рецессивных, доминантных и полностью сверхдоминантных генетических моделях (таблица 6). В соответствии с предыдущими данными мы определили ассоциацию минорного аллеля rs708727 (A) с БП в доминантных (GG против GA + AA) и полностью сверхдоминантных (GG + AA против GA) генетических моделях (ORD {{16}) }.36 (1,05–1,77), p=0.02 и ORCOD=1.34 (1,04–1,72), p=0.02 соответственно). Остальные SNP не выявили ассоциации с БП в протестированных генетических моделях (табл. 6).

Мы также проверили равенство популяционных пропорций любой генотипической комбинации, состоящей из дуплетов, триплетов, четверок, пятерняков или секступлетов тестируемых SNP в когорте PD (N {{0}}) и контрольной группе ( N=100), чтобы изучить величину влияния взаимодействий между протестированными SNP A1 на предрасположенность к развитию БП в нашей популяции. Всего выявлено 12 генотипических комбинаций (два дуплета, семь триплетов и три четверни, таблица 7) со значимостью (p < 0.05, 10 генотипов; p < 0,06, два генотипа. ) были выявлены разные количества в когортах PD и контрольной группе (Таблица 7). Следуя критериям Коэна [39], которые описывают различия в пропорциях, только триплет GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) из ​​12 генотипов показал «среднюю» разницу в размерах, определяемую коэффициентом Коэна h(2arcsin√ prp1). –2arcsin√ prp2) Больше или равно 0,5.

Значение h для остальных 11 генотипов варьировалось от 0.32 до 0.46 и, таким образом, находилось в интервале h от 0.2 до 0.5, что определяет небольшие различия в пропорциях (табл. 7) [39]. Следовательно, триплет GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) может быть клинически значимым, и необходимо провести будущие исследования этого генотипа на предмет восприимчивости к БП. Для rs11240569, rs708727 и rs823156 мы провели тот же тип анализа с исходными данными из когорты из 508 пациентов с БП и когорты из 472 контрольных больных. Четыре генотипа, два дуплета (GG(rs11240569) + AG(rs708727), GG(rs708727) + AG(rs823156)) и два триплета (GG(rs11240569) + GG(rs708727) + AA(rs823156), (GG(rs11240569) + GG(rs708727) + AG(rs823156)), со значимо (p < 0,05) разными показателями в когортах PD и контрольной группе. h Коэна, рассчитанный для каждого из четырех генотипов, был ниже порога 0,2 [39], и, таким образом, разница между долями населения между тестируемыми группами была во всех четырех случаях незначительной.

Старение, за которым следует мужской пол, считается наиболее значимым фактором риска возникновения идиопатической болезни Паркинсона [37]. В нашем пилотном исследовании возраст начала идиопатической БП в группе из 150 пациентов с БП не коррелировал с наличием какой-либо генотипической комбинации SNP rs11240569, rs708727 и rs823156 [37]. Здесь мы коррелировали возраст начала БП с (1) наличием каждой генотипической комбинации SNP rs11240569, rs708727 и rs823156 в группе из 508 пациентов с БП (рис. 2) и (2) с наличием каждого генотипическая комбинация SNP rs11240569, rs708727, rs823156, rs9438393, rs56152218 и rs61822602 в подгруппе пациентов с БП, случайно выбранных из группы БП для секвенирования промотора А1 (рис. 3). Что касается возраста начала, однофакторный анализ ANOVA показал, что не было значительной (p <0,05) разницы между генотипическими субпопуляциями для каждого из тестируемых SNP как в большой когорте БП, так и в подгруппе БП. пациенты. Таким образом, какой-либо конкретный генотип в тестируемых SNP не влияет на возраст начала идиопатической формы БП. Это полностью соответствует выводу нашего пилотного исследования [37].

Мы также провели тот же тип анализа для каждого из протестированных SNP в субпопуляциях женщин и мужчин, которые были получены из большой когорты (N=508) и подгруппы (N=96 ) пациентов с БП. Как показано на дополнительных рисунках S1–S3, нет значимой (p < 0,05) связи между возрастом начала заболевания и наличием какой-либо конкретной комбинации генотипов в тестируемых SNP rs11240569, rs708727, rs823156, rs9438393, rs56152218, и rs61822602 в подгруппах с разделением по полу был получен либо из большой когорты PD (NM=306, NF=202), либо из подгруппы PD, выбранной для секвенирования промотора A1 (NM {{20} }, НФ=42).

2.3. Машинное обучение RandomForest (RF-ML)

Все SNP A1 были протестированы на их способность различать пациентов с БП и контрольную группу с помощью RF-ML. Алгоритм RF-ML был обучен с использованием наших данных и оценена дискриминационная важность отдельных SNP с помощью технической конструкции, известной как глубина графа [37,40]. Как и в нашем пилотном исследовании [37], прогностическая способность протестированных SNP была визуализирована и количественно оценена с помощью кривых ROC (рабочая характеристика приемника) и AUC (площадь под кривой ROC) соответственно. Дискриминационная способность предикторов дана в интервале AUC от 100% (максимальная дискриминационная способность) до 50% (минимальная дискриминационная способность); AUC < 50% соответствует отсутствию различительной способности.

RF-алгоритм обучался в следующих режимах: (1) с тремя или шестью (табл. 8) конкретными SNP A1 (каждый SNP, три генотипа (AMAM/AMAm/AmAm, где AM – основной аллель, Am – минорный аллель); в качестве предиктора (три или шесть моделей RF, по одной на каждый SNP), (2) с генотипическими дуплетами парных SNP в качестве предикторов (три модели RF (три SNP) или 15 моделей RF (шесть SNP), по одной на каждую пару SNP. SNP; Таблица 8), (3) с генотипическими тройками трех SNP в качестве предикторов (одна RF-модель (три SNP) или 20 RF-моделей (шесть SNP), по одной на каждый триплет SNP; Таблица 8), (4) с генотипические четверки шести SNP в качестве предикторов (15 RF-моделей, по одной на каждый четверку; Таблица 8), (5) с генотипическими квинтуплетами шести SNP в качестве предикторов (шесть RF-моделей, по одной на каждый квинтуплет; Таблица 8) и ( 6) с генотипическим секступлетом (одна модель РФ, табл. 8).

Таким образом, когда в качестве предикторов использовались одиночные, дуплеты, тройки, четверки, пятерки и шестерки A1 SNP, они не обладали способностью различать пациентов с БП и контрольную группу (таблица 8). Следовательно, согласно анализу RF-ML и в соответствии с пилотным исследованием [37], SNP A1 не имеют потенциала служить дискриминатором между контрольной группой и пациентами с болезнью Паркинсона и, что касается болезни Паркинсона, не несут никакой прогностической или диагностической ценности в словацкой популяции. .

3. Обсуждение

Локус PARK16 привлек внимание научного сообщества из-за его связи с БП и обсуждаемой роли в определении восприимчивости к этому сложному заболеванию. В 2019 году мы сообщили о пилотном исследовании, в котором проанализировали связь трех SNP A1, а именно rs11240569, rs708727 и rs823156, с идиопатической формой БП у словацкой (западной славянской) популяции. Сообщаемая связь rs11240569 и rs823156 с предрасположенностью к БП преимущественно в азиатских/восточных популяциях в нашем исследовании не была обнаружена [37]. Никакую связь не удалось подтвердить с помощью частотной статистики (консервативный генетический анализ) или анализа RF-ML [37].

Однако основным ограничением нашего пилотного исследования было относительно небольшое количество пациентов/пробандов в группах ПД и контрольной когорте (150 и 120 соответственно). Мы подчеркнули, что со статистической точки зрения данные следует интерпретировать осторожно из-за небольшого размера выборки в обеих когортах и ​​из-за низкой статистической мощности проведенного анализа [37]. Тем не менее, используя подход ML, который требует значительно меньших размеров выборки, чем обычная частотная статистика или приближенные байесовские вычисления, мы смогли с уверенностью изучить способность определенных SNP A1 различать пациентов с БП и контрольную группу. Во всех случаях подход ML выявил практически нулевую диагностическую и прогностическую значимость SNP rs11240569, rs708727 и rs823156 в словацкой популяции [37].

В этом исследовании мы исследовали не только три вышеупомянутых SNP, но и три SNP (rs9438393, rs56152218 и rs61822602), локализованные в промоторной области A1. Эти SNP были идентифицированы путем секвенирования 96 образцов ПД с последующим ПДРФ-анализом контрольных образцов и верификацией ПДРФ секвенированных образцов ПД. Наш генетический анализ практически не выявил ассоциации ни одного из трех недавно изученных SNP с БП. То же самое верно для rs11240569 и rs823156, которые были проанализированы в подгруппах с БП и контрольной группе (96/100), а также в когортах из 508 пациентов с БП и 472 контрольных групп. Эти результаты полностью согласуются с результатами пилотного исследования [37]. Однако в больших когортах rs708727 связан с повышенным риском БП среди словацкой популяции.

Насколько нам известно, ни одно исследование еще не выявило прямой связи A1 SNP rs708727 с измененным риском развития БП [19,37]. В нашем расширенном исследовании (по сравнению с пилотным исследованием [37]) минорный аллель А в rs708727 связан с повышенным риском возникновения БП при тестировании в доминантном [40] (ORD=1.36 (1,05– 1.77), p=0.02) или полностью сверхдоминантные [41] (ORCOD=1.34 (1.04–1.72), p=0.02) модели (табл. 5). Таким образом, наличие минорного аллеля (А) в rs708727 может быть связано с повышенным риском развития БП. Принимая во внимание, что Санчес-Мут и др. [27] и Ван и др. [42] четко показали, что присутствие минорного аллеля А в rs708727 изменяет метилирование промотора PM20D1 (и, следовательно, его экспрессию) дозозависимым (количественным) образом, что является наиболее подходящей генетической моделью в нашем исследовании. указывают на то, что присутствия одного аллеля rs708727 A достаточно, чтобы изменить предрасположенность к возникновению БП. Восприимчивость к PD (фенотип), то есть наличие одной или двух копий минорного аллеля в rs708727 (генотипе), еще предстоит детально выяснить.
Санчес-Мут и др. идентифицировали PM20D1 (локализованный в локусе PARK16 и кодирующий пептидазный домен M20-, содержащий белок, один фермент с гидролазной и пептидазной активностью; синтаза/гидролаза N-жирных ациламинокислот) как количественный признак метилирования и экспрессии локус (mQTL), связанный с гаплотипом, связанным с риском AD, который демонстрирует характеристики, подобные энхансеру, и связывается с промотором PM20D1 через гаплотип-зависимую, CTCF (CCCTC-связывание) опосредованную транскрипционным фактором хроматиновую петлю [27]. Сравнивая образцы здоровых людей и пациентов с поздней стадией AD, они обнаружили, что PM20D1 последовательно демонстрирует гиперметилирование промотора у пациентов с AD [27]. A1 SNP rs708727 коррелирует с уровнем метилирования ДНК PM20D1 в лобной коре и гиппокампе человека [27], как и SNP rs960603 [27]. Ван и его коллеги в своей работе по периферической крови получили данные, подтверждающие, что PM20D1 представляет собой mQTL, опосредованный главным образом ассоциированным с риском AD A1 SNP rs708727 [42].

Более того, их продольные данные показывают, что гипометилирование происходит до появления симптомов БА, предположительно, для облегчения увеличения экспрессии PM20D1 для активации его защитной функции [42]. Прогресс AD характеризуется увеличением уровня метилирования CpG-островков в DMR (дифференциально метилированной области) промотора PM20D1 у пациентов с AD, что в конечном итоге приводит к ингибированию транскрипции и экспрессии генов [27,42,43]. PM20D1 также ассоциирован с диабетом [44], ожирением [45] и рассеянным склерозом [46], а поскольку он локализован в локусе PARK16, предполагается его возможное участие/ассоциация с БП [47].

Несмотря на отсутствие молекулярно-механистического анализа, мы предполагаем, в свете наших текущих данных, что БА и БП (и другие менее частые нейродегенеративные заболевания) имеют не только «хорошо известные» патофизиологические механизмы (например, нарушение митофагии, ретромера и протеасомы). функции), но также и эпигенетические механизмы, такие как A1 rs708727-зависимая регуляция экспрессии PM20D1 [27,42]. Наша работа косвенно усиливает необходимость детального выяснения роли эндогенных N-ациламинокислот (NAA), которые метаболизируются PM20D1, в патобиологии БП и других нейродегенеративных заболеваний. Сейчас известно, что NAA и N-ацильные конъюгаты нейротрансмиттеров (NAAN) играют важную роль в нейромодуляции [48,49]. Доказательства связи экспрессии PM20D1 с N-ацилдофамином (NADA) были предоставлены недавней работой Song et al. Эти авторы показали, что удаление kir6.2 (порообразующей субъединицы АТФ-чувствительных K+-каналов) приводит к уменьшению количества митохондрий и снижению продукции АТФ за счет увеличения уровней PM20D1 и агентов, разобщающих митохондриальное дыхание. , включая NADA, в среднем мозге мышей [49].

НАДА является мощным ингибитором 5-липоксигеназы (5-LOX) и имеет распространение, ограниченное мозгом, при этом уровни являются самыми высокими в полосатом теле и очень низкими в других местах [48,50,51]. 5-LOX катализирует синтез лейкотриена или 5-HpETE (5-гидропероксиэйкозатетраеновой кислоты) из арахидоновой кислоты и связан с нейродегенерацией (АД и БП) через его участие в нейровоспалении [51, 52]. Таким образом, мы предполагаем, что снижение экспрессии PM20D1, последующее снижение содержания NADA и повышение активности 5-LOX в значительной степени способствуют патологии БП (и других нейродегенеративных заболеваний).

Санчес-Мут и его коллеги продемонстрировали, что сверхэкспрессия PM20D1 в гиппокампе мышей с AD приводит к улучшению обучения, тогда как его нокдаун увеличивает нагрузку амилоидных бляшек [27]. Патологии как типа Леви, так и типа Альцгеймера важны при деменции, связанной с БП [53]. Значительная группа пациентов с БП страдает от ухудшения деменции во время болезни [54]. Принимая во внимание эти наблюдения, мы предполагаем, способствует ли rs708727-связанная активность, которая подавляет PM20D1, возникновению деменции БП и может ли мониторинг активности PM20D1 служить прогностическим параметром для начала деменции БП.

Ранее опубликованные работы предположили участие переносчиков Mg2+ в патобиологии БП [18–22,55]. А1, являющийся ключевым игроком в гомеостазе магния соматических клеток, напрямую связан с БП [20–22]. Точечные мутации в A1, приводящие к заменам p.A350V, p.R244H и p.R285Q, предположительно связаны с БП, и предполагается, что как отсутствие функции, так и потеря функции мутации в A1 имеют пагубные последствия для нейронов, тем самым вклад в фенотип БП [20–22]. Эта работа косвенно указывает на возможность того, что не только нарушения основной функции А1 (обмен Na+/Mg2+), но и A1-связанная (rs708727) эпигенетическая регуляция экспрессии (и активности) PM20D1 способствуют патобиология БП.

В этом исследовании мы определили генотипический триплет GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) как потенциально клинически значимый (h больше или равен 0,5). Интересно, что в состав триплета входит rs708727 с генотипом GG. Однако в свете предыдущих исследований можно было бы ожидать, что генотип, содержащий минорный аллель А в rs708727, будет связан с потенциальным риском БП, связанным с этим триплетом. В настоящее время мы не можем комментировать какие-либо молекулярные/генетические/эпигенетические взаимодействия с участием SNP в триплете GG(rs708727) + AG(rs823156) + CC(rs61822602) и, таким образом, какой-либо предполагаемый вклад этого триплета в сумму риска возникновения ПД.

В нашем пилотном исследовании мы использовали RF-ML для оценки и интерпретации наших данных [37]. Основное преимущество анализа данных RF-ML двоякое: (1) он позволяет количественно оценить различительную способность SNP между пациентами с БП и контрольной группой [37] и (2) он требует меньших размеров выборки для оценки дискриминационная важность отдельных SNP или их комбинаций [37]. Более того, RF-ML обходит проблему p-значения, часто связанную с более крупными выборками, даже если они доступны [56]. Как и в нашем предыдущем отчете, ни один из протестированных SNP A1 не продемонстрировал способности различать пациентов с БП и пробандов без БП в нашей когорте (таблица 8). Таким образом, мы можем предположить, что ни один из протестированных SNP A1 не подходит для использования в качестве дискриминатора ПД/не-ПД в словацкой популяции.

Что касается связи A1 rs708727 с измененным риском БП, результаты нашего анализа RF-ML кажутся, на первый взгляд, противоречивыми (таблицы 5 и 6 по сравнению с таблицей 8). Якобсдоттир и др. в их логистической регрессии и анализе кривых ROC показали, что даже сильные генетические ассоциации не гарантируют автоматически эффективную дискриминацию между случаями и контролем [57]. Несмотря на то, что SNP со значительным ОШ являются плохими классификаторами, они могут быть очень ценными для установления этиологических гипотез [57]. В нашем случае A1 SNP rs708727 не имеет классификационной силы в отношении БП и, следовательно, не имеет клинического значения. Однако его слабая, но значимая связь с измененным риском БП позволила нам предположить об участии rs708727 в патобиологии БП аналогично или таким же образом, как он участвует при БА [27].

4. Материалы и методы.

4.1. Участники исследования (основные характеристики)

Всего в исследование было включено 980 пробандов (508 пациентов с БП и 472 человека из контрольной группы, отвечающих инклюзивным критериям). Идиопатическая форма БП была диагностирована неврологами в пяти диагностических центрах БП (в Мартине, Братиславе, Тренчине, Зволене и Кошице) согласно диагностическим критериям БП MDS (Общества двигательных расстройств). Все пациенты получали стандартную анти-ПД-терапию. Средний возраст больных БП составил 68,4±9,6 года. Средний возраст начала заболевания составил 61,7±10,7 года. Самый молодой случай был диагностирован в возрасте 34 лет, а самый старый - в 89 лет. В группу ПД вошли 202 пациента женского пола (Ж) и 306 пациентов мужского пола (М), таким образом, соотношение Ж:М составило 1:1,5.

Контрольную группу пробандов составили выезжающие и поступающие пациенты из Клиники профессиональной медицины и токсикологии (Университетская больница Мартина (UHM)) и Клиники неврологии (UHM). В контрольную группу исследования были включены только те пациенты, у которых ранее не было диагностировано какое-либо нейродегенеративное и нервно-психическое заболевание, такое как сахарный диабет или остеопороз (все заболевания, предположительно связанные с измененной экспрессией А1 и дерегуляцией функции А1). Средний возраст пробандов контрольной группы составил 68,3 ± 11,6 года. В контрольную группу вошли 208 особей женского пола и 264 особи мужского пола, таким образом, соотношение Ж:М в контрольной группе составило 1:1,3.

Подгруппа пациентов с БП, у которых была секвенирована область промотора А1, состояла из 96 случайно выбранных субъектов. Соотношение Ж:М составило 1:1,3 (42 женщины и 54 мужчины). Средний возраст пациентов в подгруппе БП составил 67,{{10}} ± 9,5 лет. В контрольную подгруппу вошли 41 женщина и 59 мужчин, при этом соотношение Ж:М составило 1:1,4. Средний возраст пробандов контрольной подгруппы составил 59,8 ± 5,0 года.

Это исследование было одобрено Этическим комитетом медицинского факультета Ессениуса Университета Коменского (JFM CU). Одобрение зарегистрировано под идентификатором: EK 66/2019. Все участники исследования подписали формы информированного согласия.

4.2. Образец обработки

Образцы крови собирали в обработанные ЭДТА пробирки BD Vacutainer® (Becton, Dickinson and Company, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США). Геномную ДНК выделяли из свежих (UHM) или замороженных образцов крови (другие центры ПД) с использованием набора для очистки геномной ДНК Wizard® (Promega Corporation, Мэддисон, Висконсин, США) в соответствии с протоколом производителя. Изолированные образцы ДНК хранили при -80 ◦С.

4.3. Генотипирование

Генотипирование было проведено на 358 образцах ПД и 352 контрольных образцах. Результаты этих экспериментов были проанализированы вместе с результатами, ранее сообщенными Cibulka et al. [37]. SNP rs11240569, rs708727 и rs823156 анализировали с использованием зондов генотипирования TaqMan® C_34251_20/rs11240569, C_375742_10/rs823156 и C_9238453_10/rs708727 (все Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA) так же, как сообщалось ранее [37].

4.4. Секвенирование по Сэнгеру

Область промотора была разделена на четыре перекрывающихся фрагмента/ампликона, поскольку она была слишком длинной для одного сеанса секвенирования. Перед секвенированием целевые области амплифицировали. Праймеры были разработаны с помощью онлайн-инструмента Primer3Plus [https://primer3plus.com/cgi--bin/dev/primer3plus.cgi (по состоянию на 3 мая 2018 г.)]. Каждую пару праймеров проверяли на наличие нескольких продуктов амплификации с помощью онлайн-инструмента ПЦР UCSC [http://www.genome.ucsc.edu/cgi--bin/hgPcr (по состоянию на 3 мая 2018 г.)].

Праймеры и программы ПЦР, использованные для амплификации четырех фрагментов, суммированы в дополнительных таблицах S1 и S2. Составы мастер-миксов для каждого фрагмента суммированы в SA3. Фрагменты 3 и 4 имеют высокое содержание нуклеотидов G и C (67,4% и 71,9% соответственно). Выход реакции увеличивали добавлением 10× GC Rich Enhancer (Solis Biodyne, Тарту, Эстония). Продукт ПЦР очищали с использованием геля NucleoSpinTM и набора для очистки ПЦР (Macherey-Nagel GmbH&Co. KG, Дюрен, Германия). На следующем этапе очищенный продукт ПЦР разбавляли до концентрации, подходящей для предварительного секвенирования ПЦР (SA4, SA5). В ПЦР предварительного секвенирования использовались только прямые (fw) праймеры. Реакционная смесь также включала BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Уолтем, Массачусетс, США) и дидезоксинуклеотиды.

В результате мы получили смесь продуктов разного размера, оканчивающихся флуоресцентно-меченными дидезоксинуклеотидами. Продукты впоследствии очищали с использованием набора SigmaSpin Sequencing Reaction Clean-Up (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в соответствии с протоколом производителя. Объем 3 мкл очищенного продукта переносили в планшет с лунками 96- вместе с 12 мкл высококачественного деионизированного формамида (Applied Biosystems, Уолтем, Массачусетс, США). Смесь денатурировали в течение 5 мин при 95 ◦С в термоциклере. Фрагменты разделяли на 8-микрокапиллярном устройстве ABI 3500 (Applied Biosystems, Уолтем, Массачусетс, США). Последовательности экспортировали и визуализировали с помощью программного обеспечения Chromas (Technelysium Pty Ltd., Южный Брисбен, Австралия). Файлы FASTA были загружены в BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) и сопоставлены с эталонным геномом человека (версия GRCh38.p12).

Прогнозирование сайтов связывания транскрипционных факторов и их изменений осуществлялось с помощью онлайн-инструмента ConSite [доступно по адресу: http://consite.genereg.net/ (по состоянию на 3 сентября 2020 г.)] [38]. Были загружены последовательности с основным аллелем и минорным аллелем и созданы спектры факторов транскрипции (TF). Анализ проводился без предварительной установки минимальной специфичности. Изменения в профилях связывания ТФ в зависимости от наличия вариантов суммированы в таблице 2.

4.5. RFLP (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) анализ

Компоненты реакционной смеси и условия ПЦР амплифицированной ПЦР суммированы в SA6 и SA7. Для разработки ограничений ампликонов использовался онлайн-инструмент in silico NEBCutter 2.0 [http://nc2.neb.com/NEBcutter2/ (по состоянию на 14 февраля 2020 г.)]. Для анализа ПДРФ были выбраны следующие ферменты рестрикции: Hpy166II (детекция rs9438393), NIaIII (детекция rs56152218) и BmrI (детекция rs61822602). Все ферменты были приобретены в New England Biolabs. Для варианта rs144056491 мы не смогли разработать эксперимент RFLP, поскольку не было подходящего фермента. После ограничения мы ожидали, что фрагменты, суммированные в SA8, сформируют урожай. После рестрикции продукты разделяли электрофорезом в агарозном геле (гель NIaIII и Hpy166II 1%; гель BmrI 2%) и затем визуализировали на приборе PharosFX (Bio-Rad Laboratories). Были определены генотипы для каждого SNV.

4.6. Анализ данных

Данные были изучены и проанализированы с использованием R [R Core Team (2021); R: язык и среда для статистических вычислений. Фонд статистических вычислений R, Вена, Австрия. URL https://www.R-project.org/, версия. 4.0.5 (2021-03-31)]. Исследование генетических ассоциаций (GAS) и анализ мощности проводились с использованием R-библиотек HardyWeinberg [Jan Graffelman (2015); Изучение диаллельных генетических маркеров: пакет HardyWeinberg. Журнал статистического программного обеспечения, 64 (3), 1-23. URL https://www.jstatsoft.org/v64/i03/], DescTools [Андри Синьорелли и др. (2021); DescTools: инструменты для описательной статистики. Версия пакета R 0.99.41.], epitools [Томас Дж. Арагон (2020); epitools: Эпидемиологические инструменты. Пакет R версии 0.5-10.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=epitools], pwr [Стефан Шампели (2020); pwr: базовые функции для анализа мощности. Пакет R версии 1.3-0. URL https://CRAN.R-project.org/package=pwr] и код собственной разработки. Прогнозное моделирование RandomForest выполнялось с использованием библиотеки R randomForestSRC [Ishwaran H. and Kogalur UB (2021); Fast Unified RandomForests для выживания, регрессии и классификации (RF-SRC), версия пакета R 2.11.0.]. Данные были визуализированы с помощью библиотеки R beeswarm [Aron Eklund (2021); пчелиный рой: график пчелиного роя, альтернатива ленточной диаграмме. Пакет R версии 0.3.1. URL https://CRAN.R-project.org/package=beeswarm]. Однофакторный дисперсионный анализ использовался для проверки нулевой гипотезы равенства среднего возраста начала заболевания для трех субпопуляций генотипов для каждого SNP. Результаты со значением p ниже 0,05 считались статистически значимыми.

5. Выводы

Таким образом, наши данные свидетельствуют о слабой, но значимой ассоциации A1 SNP rs708727 с БП в доминантных и сверхдоминантных генетических моделях в словацкой популяции. Ни один из других протестированных SNP A1 (rs11240569, rs823156, rs9438393, rs56152218 и rs61822602) не был связан с заболеванием ни в одной из протестированных генетических моделей. Анализ RF-ML выявил, что все протестированные SNP A1 являются плохими классификаторами/предикторами БП, поэтому их использование в клинической практике в качестве диагностических или прогностических маркеров остается незначительным. Однако ассоциация rs708727 с БП позволила нам предположить, что ассоциированный с риском БП минорный аллель (G > A) в rs708727 способствует возникновению и прогрессированию заболевания посредством нарушения эпигенетической регуляции экспрессии PM20D1, механизма, который, как известно, играет роль в патобиологии АД. Эту гипотезу следует дополнительно изучить, чтобы сделать окончательное заявление. Кроме того, необходимо выяснить возможную связь между деменцией, связанной с БП, и rs708727.

Вклад автора:

Концептуализация, МК; методология, МК, МК, МГ (Мариан Грендар) и МБ; программное обеспечение, MG (Мариан Грендар); валидация, MC, MB и MK; формальный анализ, МК, МГ (Мариан Грендар), MC, AS, ZL, ZP, TS, SS и MG (Милан Грофик); расследование, МК и МБ; курирование данных, MC, MB, MG (Мариан Грендар), MG (Милан Грофик), JN, VN и EK; письмо — подготовка оригинального проекта, МК; написание — рецензирование и редактирование, MC, MG (Мариан Грендар) и ZP; визуализация, МК, МК и МГ (Мариан Грендар); надзор, МК; администрирование проекта, MC, MK, MG (Милан Грофик), JN, JB, VH, VN, EK, MS и BV; финансирование приобретения, МК. Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование:

Работа выполнена при поддержке Словацкого агентства исследований и разработок, номер гранта APVV-19-0222, и Агентства научных грантов Министерства образования, науки, исследований и спорта Словацкой Республики и Словацкой академии наук, номер гранта VEGA. 0554.01.19, оба к МК

Заявление Институционального наблюдательного совета:

Исследование было одобрено Этическим комитетом медицинского факультета Ессениуса Университета Коменского (JFM CU). Одобрение зарегистрировано под идентификатором: EK 66/2019.

Заявление об информированном согласии:

Информированное согласие было получено от всех субъектов, участвовавших в исследовании.

Заявление о доступности данных:

Полный набор данных содержится в статье. Характер и объем включенных данных позволяют провести дальнейший метаанализ. Любая информация об исследовании доступна по запросу у соответствующего автора.

Благодарности:

Мы благодарим всех участников исследования и членов их семей. Мы также выражаем благодарность Мартину Мараку (JFM CU) за его компетентную техническую поддержку проекта, Яну Радвански и Растиславу Хекелю (оба GENETON sro) за полезные советы по анализу промотора А1, а также Терезе Джонс за языковое редактирование рукопись.

Конфликт интересов:

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.

Рекомендации

1. Татаркова З.; де Баай, JHF; Грендар, М.; Ашенбах, младший; Ракай, П.; Бос, К.; Спондер, Г.; Хендероп, JGJ; Рентген, М.; Турканова Копрусакова М.; и другие. Потребление магния с пищей и обменник Na+/Mg2+ SLC41A1 влияют на компоненты митохондриальной энергетики в кардиомиоцитах мышей. Межд. Дж. Мол. наук. 2020, 21, 8221. [CrossRef] [PubMed]

2. Яманака, Р.; Табата, С.; Шиндо, Ю.; Хотта, К.; Сузуки, К.; Сога, Т.; Ока, К. Митохондриальный гомеостаз Mg2+ определяет клеточный энергетический метаболизм и уязвимость к стрессу. наук. Отчет 2016, 6, 30027. [CrossRef] [PubMed]

3. Дудев Т.; Грауфель, К.; Лим, К. Как катионы собственных и чужеродных металлов связывают АТФ: значение лития как терапевтического агента. наук. Отчет 2017, 7, 42377. [CrossRef] [PubMed]

4. Колисек, М.; Зсурка, Г.; Самадж, Дж.; Вегубер, Дж.; Швайен, Р.Дж.; Швайгель, М. Mrs2p является важным компонентом основной электрофоретической системы притока Mg2+ в митохондрии. ЭМБО Дж. 2003, 22, 1235–1244. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

5. Шиндл Р.; Вегубер, Дж.; Романин, К.; Швайен, Р. Дж. Mrs2p образует в митохондриях селективный канал Mg2+ с высокой проводимостью. Биофиз. Дж. 2007, 93, 3872–3883. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

6. Колисек, М.; Спондер, Г.; Пильчова И.; Цибулька, М.; Татаркова З.; Вернер, Т.; Ракай, П. Магниевая феерия: критический сборник текущих исследований клеточных переносчиков Mg2+, отличных от TRPM6/7. Преподобный физиол. Биохим. Фармакол. 2019, 176, 65–105. [Перекрестная ссылка]

7. Кубота Т.; Шиндо, Ю.; Токуно, К.; Комацу, Х.; Огава, Х.; Кудо, С.; Китамура, Ю.; Сузуки, К.; Ока, К. Митохондрии — внутриклеточные хранилища магния: исследование с помощью одновременной флуоресцентной визуализации в клетках PC12. Биохим. Биофиз. Acta 2005, 1744, 19–28. [Перекрестная ссылка]

8. Спондер, Г.; Абдулханан, Н.; Фрелих, Н.; Мастрототаро, Л.; Ашенбах, младший; Рентген, М.; Пильчова И.; Цибулька, М.; Ракай, П.; Колисек, М. Сверхэкспрессия обменника Na+/Mg2+ SLC41A1 ослабляет передачу сигналов, способствующих выживанию. Онкотаргет 2017, 9, 5084–5104. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

9. Ямагучи, Х.; Ван, Х.Г. Протеинкиназа PKB/Akt регулирует выживаемость клеток и апоптоз, ингибируя конформационные изменения Bax. Онкоген 2001, 20, 7779–7786. [Перекрестная ссылка]

10. Возур, Д.; Вафейаду, К.; Райс-Эванс, К.; Уильямс, Р.Дж.; Спенсер, Дж. П. Активация сигнальных путей Akt и ERK1/2, способствующих выживанию, лежит в основе антиапоптотических эффектов флаванонов в кортикальных нейронах. Дж. Нейрохим. 2007, 103, 1355–1367. [Перекрестная ссылка]

11. Муддапу, В.Р.; Дхаршини, SAP; Чакраварти, В.С.; Громиха М. М. Нейродегенеративные заболевания — метаболическая недостаточность — первопричина? Передний. Неврология. 2020, 14, 213. [CrossRef] [PubMed]

12. Патак, Д.; Берте, А.; Накамура, К. Энергетический сбой: способствует ли он нейродегенерации? Анна. Нейрол. 2013, 74, 506–516. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

13. Дхаршини, САП; Тагучи, Ю.Х.; Громиха М.М. Исследование энергетического кризиса при болезни Альцгеймера с помощью транскриптомного исследования. наук. Отчет 2019, 9, 18509. [CrossRef] [PubMed]

14. Твиг, Г.; Ширихай О.С. Взаимодействие митохондриальной динамики и митофагии. Антиоксид. Редокс-сигнал. 2011, 14, 1939–1951. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

15. Чжао, В.; Чжан, В.; Ма, Х.; Ян, М. NIPA2 регулирует функцию остеобластов путем модуляции митофагии при диабетическом остеопорозе 2 типа. наук. Отчет 2020, 10, 3078. [CrossRef]
16. Надлер, М.Ю.; Эрмосура, MC; Инабе, К.; Перро, Алабама; Чжу, К.; Стоукс, Эй Джей; Куросаки, Т.; Кинет, JP; Пеннер, Р.; Шаренберг, AM; и другие. LTRPC7 представляет собой Mg. АТФ-регулируемый двухвалентный катионный канал, необходимый для жизнеспособности клеток. Природа 2001, 411, 590–595. [Перекрестная ссылка]

17. Колисек, М.; Нестлер, А.; Форманн, Дж.; Швайгель-Рентген, М. Ген человека SLC41A1 кодирует обменник Na+/Mg2+. Являюсь. Дж. Физиол. Клеточная Физиол. 2012, 302, С318–С326. [Перекрестная ссылка]

For more information:1950477648nn@gmail.com