Передние ядра таламуса: критический субстрат непространственной парно-ассоциированной памяти у крыс. Часть 2

2|МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1|Животные и условия содержания

Крыс-самцов Лонг-Эванса (12 месяцев; средний вес 630 г) содержали группами по три или четыре человека в клетках Макролона (48–28–22 см) с обратным 12--часовым циклом света и темноты (свет включается в 20:00). ).

Поведенческое тестирование проводилось в темную фазу светового цикла, пять сеансов в неделю; наблюдения подтвердили, что крысы были относительно более активными во время темной фазы. Крыс содержали на уровне 85% массы тела при свободном кормлении с водой вволю; корм давали вволю до и после операции для послеоперационного восстановления.

Хирургия – это процесс лечения болезней и улучшения физического здоровья. Процесс восстановления после операции требует особого внимания. Помимо физического восстановления, хорошее самочувствие также требует сосредоточения внимания на восстановлении памяти. Существует тесная связь между послеоперационным восстановлением и памятью.

Во время операции такие факторы, как реакция организма на неблагоприятные воздействия и действие анестезирующих препаратов, часто влияют на функцию памяти мозга. После того, как организм восстановится, обратите внимание на правильное питание, умеренные физические нагрузки и достаточный сон. В период восстановления вне стационара необходимо продолжать избегать чрезмерных физических нагрузок и поддерживать комфортное состояние организма.

В дополнение к образу жизни, разумная психологическая адаптация также помогает восстановлению здоровья и памяти. Расслабьтесь, сохраняйте спокойствие и помогите себе приспособиться к восстановлению памяти. В то же время вам следует активно участвовать в развлекательных мероприятиях и общаться с родственниками и друзьями, чтобы поддерживать активность мозга и улучшать когнитивные способности и способности памяти. Эту активность можно постепенно увеличивать и выполнять ее практически раз в неделю.

Одним словом, процесс восстановления после операции требует всестороннего внимания. Поддержание хороших жизненных привычек и психологической адаптации играет очень важную роль в содействии физическому восстановлению и восстановлению памяти. Давайте посмотрим на это позитивно, с полной уверенностью и надеждой. Нам необходимо улучшить память, и Cistanche Deserticola может значительно улучшить память, поскольку Cistanche Deserticola также может регулировать баланс нейротрансмиттеров, например, повышая уровень ацетилхолина и факторов роста. Эти вещества очень важны для памяти и обучения. Кроме того, мясо также может улучшить кровоток и способствовать доставке кислорода, что может гарантировать, что мозг получает достаточное количество питательных веществ и энергии, тем самым повышая жизнеспособность и выносливость мозга.

Нажмите, чтобы узнать, как улучшить работу мозга

Все процедуры соответствовали утвержденным рекомендациям Комитета по этике животных Кентерберийского университета. Четыре группы крыс были созданы случайным образом после предоперационного ознакомления с радиальным лабиринтом (RAM) и взлетно-посадочной полосой. Четыре группы представляли собой двусторонние поражения ATN без следа между запахом и объектными раздражителями или без них при обучении в задании с парными ассоциатами и соответствующие две группы с ложными поражениями.

Окончательные размеры выборки были следующими: (1) «Имитация без следов»=7 (т. е. группа с имитацией поражения без интервала между запахом и объектными стимулами, используемыми в задании с парными ассоциатами); (2) Шам-След=7 (группе Шамлезиона дали след 10- с между представлением запаха и объектными стимулами); (3) ATN-без трассировки=8; и (4) ATN-трассировка=9. Еще одна крыса с поражением ATN была исключена из-за несоответствия критериям поражения (см. ниже).

2.2|Операция

Крыс анестезировали изофлураном (индукция 4%; поддержание 2,5%) и помещали в стереотаксический аппарат с атравматическими ушными планками (Kopf, Tujunga, CA). Резцовая планка была установлена ​​на 7,5 мм ниже межушной линии, чтобы свести к минимуму повреждение свода.

В каждом полушарии две инфузии были направлены на антеровентральное ядро ​​(АВ; верхнее и нижнее) и одна инфузия была направлена ​​на антеромедиальное ядро ​​(АМ). В каждой операции использовалась одна или пять передне-задних (AP) координат относительно расстояния Брегма-лямбда отдельной крысы (все значения в мм). Для АВ-поражений координаты AP составили: 2,20 для B–L 6,9–7,2; 2,25 для Б–Л от 7,3 до 7,6; 2,30 для B–L Больше или равно 7,7. АВ-инфузии проводились на 5,68 и 5,73 ниже твердой мозговой оболочки и на 1,52 латеральнее средней линии.

Инфузия АМ была проведена {{0}} на 0,1 мм кпереди от АВ-координаты, на 5,76 ниже твердой мозговой оболочки и на 1,16 латеральнее; первое повреждение АМ было выполнено после завершения всех АВ-инфузий и начиналось контралатерально по отношению к последнему месту АВ-поражения. 0.15 М N-метил-d-аспартат (NMDA; Sigma, CastleHill, Новый Южный Уэльс) в 0.1 М фосфатный буфер (рН 7,20) вводили в каждый участок со скоростью 0,04 мкл в минуту через 2.5-Шприц UlHamilton (Рено, Невада, США) с использованием микроинфузионного насоса (Stoelting, Вуд Дейл, Иллинойс).

AV-сайты каждого полушария получали {{0}}.12 и 0.10 мкл для дорса и вентральных сайтов соответственно; Для каждого сайта AM использовали 0,06 мкл. Игла шприца оставалась на месте в течение 3 минут после инфузии.
При операциях с имитацией поражения использовали ту же процедуру, но иглу опускали на 1 мм выше верхнего АВ и участка поражения AM без проведения инфузии.

2.3|Поведенческие задачи

RAM с восемью руками подтвердил нарушение пространственной памяти у крыс с поражением ATN после операции. Для обучения крыс всем непространственным задачам, то есть простому запаху и простому различению объектов, а также парным ассоциированным задачам запах-объект и запах-след-объект, использовали бегущее устройство.

Перед операцией крыс с ограниченным питанием приучали к восьмилапному RAM, описанному ниже, для извлечения кусочков шоколада 0,1 г (Foodfirst LTD, Окленд, Новая Зеландия) и адаптации к открытию и закрытию дверей. На красной взлетно-посадочной полосе из плексигласа (рис. 1) крысам также придавали форму, чтобы они ткнули носом в круглую белую пластиковую шапочку размером 2- см, которая находилась на высоте 10 см над уровнем пола, а в центре - тонкую губку на прозрачной вставке из плексигласа, которая была прикреплена к торцевая стена.

Они также были приспособлены для того, чтобы толкать (носом или лапой) предмет, шарнирно закрепленный в задней части основания, к верху пищевого колодца, утопленного в центре деревянного бруска размером 5–8,5–3 см. Еда содержала кусочки шоколада (а под углублением находились недоступные продукты). Объект, использованный для предварительного обучения, больше не использовался. После операции выздоравливающим крысам повторно знакомили как с RAM, так и с взлетно-посадочной полосой.

2,4|Пространственная рабочая память в оперативной памяти

Послеоперационную пространственную рабочую память проверяли с использованием оперативной памяти, расположенной в центре комнаты без окон (3,3 м). Лабиринт имел выкрашенную в серый цвет деревянную центральную часть шириной 35 см с восемью алюминиевыми ветвями (длиной 65 см и шириной 8,6 см, с краями высотой 4,5 см), приподнятыми на 67,5 см над полом комнаты. Прозрачные стенки из плексигласа (длиной 19 см и высотой 25 см) простирались вдоль одной стороны каждого рукава от втулки, чтобы предотвратить прыжки крыс между рукавами.

В конце каждого рукава помещали черный деревянный пищевой лоток (5 х 8,5 3 см) с недоступными пищевыми продуктами. пробный. Прозрачные гильотинные двери из плексигласа, которые можно было поднять из-под ступицы с помощью системы шкивов, контролировали доступ к ступице и рычагам.

Десять последовательных дней формального обучения в оперативной памяти использовались для проверки пространственной рабочей памяти. Крысу помещали в центральный узел, и через 10 секунд все восемь рычагов открывали, и крысе давали возможность сделать выбор, определяемый как выход обеих задних лап за порог рычага. Как только крыса попадала в рукав, все двери закрывались, и она удерживалась в рукаве в течение 15 с независимо от того, сделала ли она правильный выбор.

Затем крысу пустили обратно в центральный узел и удерживали там в течение 10 секунд, прежде чем все двери снова открылись, чтобы дать возможность выбрать другую руку. Испытание завершилось, когда ратхад посетил все восемь рук, было сделано 20 выборов рук или прошло 10 минут.

2,5|Непространственные задачи: простая дискриминация и парное дистанционное обучение.

И в задачах на простое различение, и в задачах на парное сопоставление использовалась одна и та же полоса из красного плексигласа (93×26×26 см), расположенная на столе высотой 75-см (рис. 1). Взлетно-посадочная полоса могла быть разделена тремя вертикально съемными дверями (redPerspex, 26 х 26 см), которые подбирались исходя из конкретной поведенческой задачи. Что касается ознакомления, то тонкая губка размером 6,5×6×8 мм с колпачком в центре содержала шоколадную награду (рис. 1).

Губку прикрепляли к съемной двери на взлетно-посадочной полосе (для задач с парными партнерами) или к торцевой стенке взлетно-посадочной полосы (для простой задачи на распознавание). Для каждого аромата использовалась отдельная губка Doorplus, в которую рядом с емкостью добавляли 5 мл подсолнечного масла, смешанного с 20 мкл вещества «Эфирные масла Новой Зеландии».

Запахи были лимоном и гвоздикой для парных задач, корицей и лаймом для простых задач на распознавание или наоборот в уравновешенных группах. Легкие и визуально различимые предметы (рис. 1) прикреплялись шарниром в задней части основания к верхней части лунки с едой, чтобы крыса могла легко отодвинуть предмет назад (носом или лапой) и поискать в лунке пищевое вознаграждение.

Деревянный каркас (высотой 1,8 м от пола и шириной 1,3 м), задрапированный черными шторами, окружал все стороны испытательной зоны, чтобы уменьшить влияние пространственных сигналов во время тестирования.

В простых различениях (только запах; только объект) и в парных заданиях использовалась процедура «годен/не годен».

Первое испытание каждого сеанса начиналось с удержания крысы в ​​стартовой зоне на 120 с для повторной акклиматизации к лабиринту; в последующих испытаниях в этой стартовой зоне использовалось 20 с. Allrats получали 12 массированных испытаний за ежедневный сеанс, из них шесть испытаний (с вознаграждением) и шесть испытаний без вознаграждения (без вознаграждения) в псевдорандомизированном порядке. За сеанс проводилось не более трех «годен» или трех «непройденных» испытаний.

Ни одна из четырех различных пар стимулов запах-предмет не повторялась в последовательных испытаниях. Правильные предметы в простых задачах на различение и правильные пары стимулов в задачах с парами-ассоциатами были уравновешены у крыс.

Для простого распознавания запаха реакция определялась как тыкание носом в колпачок в центре одурманенной губки; нюхать только губку считалось запретным ответом. Пища всегда присутствовала в колпачке в центре губки для задач, связанных с запахом и парой объектов; Аспект «годен/не пройден» здесь относится к тому, был ли объект сдвинут, чтобы показать, находится ли под ним, в конце взлетно-посадочной полосы, продовольственное вознаграждение.

Для объектов ответ определялся как любой толчок носом или лапой, который наклонял объект назад. Задержка с момента поднятия последней двери и момента взаимодействия крысы с запахом (тыкание носом в кепку; для простого распознавания запаха) или с объектом (отодвинутая назад на петле для простого распознавания объектов и парных задач) составляла измеряется с помощью тихого секундомера (Дик Смит, Новая Зеландия).

Наблюдатель сидел за занавесками рядом с взлетно-посадочной полосой, чтобы управлять дверями и фиксировать поведение. Испытание считалось «правильным», если крыса реагировала менее чем за 8 с на стартовое испытание или не реагировала раньше 8 с на запретное испытание.

2,6|Простые различия

Половина крыс прошла обучение простому распознаванию запахов, за которым последовало простое распознавание объектов, а другая половина - наоборот. Была зафиксирована задержка между дверью X (рис. 1а) и взаимодействием с запахом или объектом в конце взлетно-посадочной полосы. Крыс обучали решению простых задач по различению запахов и простых объектов до тех пор, пока они не достигали критерия (80% правильных ответов в течение 2 дней подряд).

Для простой задачи по различению запахов в каждом испытании предъявлялся один запах. Ратхад должен был определить, какой из двух запахов сочетался с пищевым вознаграждением, представленным в губке в конце отсека B (рис. 1а).

В задаче на простое различение объектов в каждом испытании в конце отсека B (не показано на рисунке 1) предъявлялся один объект. Терасу нужно было узнать, какой из двух объектов сочетался с пищевым вознаграждением, представленным под этим объектом.

2,7|Парно-ассоциированные задачи (отслеживание и отсутствие следов). В этих задачах использовалась новая компоновка вертикально съемных дверей (рис. 1). Крысы узнали, какая из двух пар запах-объект будет вознаграждена (например, Запах 1 + Объект A и Запах 2 + Объект B), а какие пары не будут вознаграждены (например, Запах 1 + Объект B и Запах 1 + Объект B и Запах 2 + Объект А).

Независимо от спаривания, крысы всегда получали вознаграждение за появление запаха, когда их пускали во второй отсек взлетно-посадочной полосы. Это был отсек C для условий «без следов», при которых отсек A не использовался, а отсек B был стартовым отсеком. Запах находился в конце отсека B для состояния «следов», для которого отсек A использовался в качестве стартового ящика.

Крысы в ​​условиях отсутствия следов подвергались задержке 10- с между предъявлением запаха и объектными стимулами, помещаясь в отсек C, тогда как крысы в ​​условиях отсутствия следов подвергались воздействию объекта сразу после их взаимодействия с запахом (после Как в условиях следа, так и в условиях отсутствия следов мы регистрировали задержку прохождения отсека D с момента поднятия двери Z до момента, когда крыса взаимодействовала с объектом или воздерживалась от взаимодействия с ним в течение 8 секунд.

Две группы крыс (симуляционное поражение и ATN-поражение) обучались выполнению парных задач «запах – объект» (группы «Без следов»), а две соответствующие группы обучались выполнению парных задач «запах – след – объект» (группы «След») до тех пор, пока они не критерий достижения (80% правильных испытаний в течение 3 дней) или максимум 50 дней.

2,8|Тест на удержание после приобретения

Сохранение парно-ассоциированной задачи для любой крысы проводили через 5 дней после достижения критерия или через 50 дней обучения. В этом сеансе использовалось 12 массированных испытаний с вознаграждением/без вознаграждения в один день таким же образом, как это применялось ранее для этой крысы.

2,9|Гистология

2.9.1|Перфузия и сбор тканей

За 3 дня до теста на удержание одиночных крыс знакомили с пустой чистой клеткой в ​​течение 90 минут в темной и тихой комнате. Сразу после последней попытки удержания крысу помещали в клетку в знакомой темной тихой комнате за 90 минут до перфузии.

Крыс подвергали глубокой анестезии пентобарбиталом натрия (125 мг/кг) и транскардиально перфузировали физиологическим раствором с последующим введением параформальдегида [4% PFA в 0,1 М фосфатном буфере (PB)] для фиксации мозга. Мозг подвергали последующей фиксации в 4% PFA с последующей минимум 48-часовой фиксацией в растворе длительного хранения (20% глицерина в 0,1 М PB). Корональные срезы размером 40- мкм собирали с помощью замораживающего микротома (Thermo Fisher, Великобритания) и хранили в криозащитном растворе (30% глицерина, 30% этиленгликоля в 0,1 М ПБ) при 20°С до обработки для иммуногистохимии.

Корональные срезы были собраны в две отдельные серии. В первой серии были получены последовательные срезы в пяти криопробирках для иммуногистохимии (т.е. в одном из пяти). Эта серия включала передний блок срезов от префронтальной коры до области перегородки (приблизительно от {{0}},7 до 0,6 мм от брегмы) и задний блок от медиодорсального таламуса (приблизительно 3,5 мм от брегмы) до каудального отдела. ретросплениальная кора.

Во второй серии были зафиксированы последовательные срезы для проверки повреждений. Эти срезы собирали в четыре криопробирки от передней части АТН до задней медиодорсальной части таламуса (приблизительно от 0,6 до 3,5 мм от Брегмы).

2.9.2|Окрашивание Neu-N и проверка поражения ATN

Свободно плавающие срезы по всей области ATN промывали (310 мин) в 0,1 М фосфатно-солевом буфере с тритоном-X (0,2%; PBSTx) перед инкубацией в буфере, блокирующем эндогенную пероксидазу, в течение 30 минут. мин [1% перекись водорода (H2O2), 50% метанол (CH3OH) в 2%PBSTx].

Срезы инкубировали в течение ночи при 4 C первичных антителах против NeuN (1:5000; моноклональное MouseCat # MAB377; Millipore, Калифорния, США) в PBSTx с 1% нормальной козьей сывороткой (NGS; Life Technologies, Новая Зеландия).

Избыточный буфер антител удаляли с помощью PBSTx, а затем инкубировали с биотинилированными козьими вторичными антимышиными антителами (1:1000 Cat# BP-9200-50: VectorLaboratories, Калифорния, США) в течение ночи при 4°C в PBSTx и 1% NGS. Срезы помещали в ExtrAvidin (конъюгированный с пероксидазой; 1:1000; Sigma, Новый Южный Уэльс, Австралия), PBSTx и 1% NGS на 2 часа при комнатной температуре.

Для удаления избытка ExtrAvidin и Triton X{{0}} срезы промывали PBS, PB, а затем Трис-буфером (рН 7,4 в дистиллированной H20) для подготовки срезов к визуализации свежеприготовленным диаминобензидином ( ДАБ 0,05%, Сигма, в 0,01% H2O2 в Трис-буфере).

Реакцию DAB (приблизительно 5 минут) останавливали с использованием Трис-буфера (1-10-минутная промывка), и срезы помещали в PB при 4°C на ночь перед нанесением на желатинизированные предметные стекла и давали высохнуть. Слайды обезвоживали спиртом (70–100%), затем очищали ксилолом и монтировали с помощью DPX (06522; Sigma-Aldrich) и покровного стекла.

Количество Neu-N-позитивных клеток в ATN использовали для определения степени поражения. При этом использовались срезы как из левого, так и из правого полушарий для каждого среза в четыре 40- мкм по всему ATN, а площадь определялась количественно с помощью ImageJ (NIH, США). Окраску NeuN-позитивных клеток фотографировали с 5 объективов на прямом микроскопе LeicaDM6 B и камере DFC7000T (Leica Microsystems, Германия).

Автоматический подсчет клеток был получен с помощью ImageJ (программное обеспечение для анализа изображений, Национальный институт здравоохранения, НИЗ, США). Область, окружающая нейроны в области ATN, была выбрана вручную, изображения были преобразованы в {{0}}битовую шкалу серого, фон был вычтен (прокручивание=40), преобразован в маску и применена функция водораздела. и подсчитывали все нейрональные клетки выше порога (порог «MaxEntropy», округлость 0,5–1,0).

Порог обнаружения был одинаковым для всех срезов. Автоматически окрашенные NeuN ядра клеток подсчитывали у девяти имитационных крыс (пяти в группе с ложным следом и четырех в группе с имитацией без следов) для экспрессии количества клеток в ATN.

Автоматизированный подсчет ядер сохраненных клеток, окрашенных NeuN, у всех крыс с поражением ATN сравнивали со средним количеством клеток NeuN, наблюдаемым у ложных крыс. Приемлемые поражения определялись как достижение критерия 50% потери клеток в ATN, минимум 25% на полушарие. Это согласуется с критериями поражения ATN в предыдущих исследованиях (Mitchell & Dalrymple-Alford, 2005, 2006; Perryet al., 2018).

2.9.3|Иммуногистохимия Zif268

Свободно плавающие срезы обрабатывали аналогично NeuN, но инкубировали в кроличьих поликлональных первичных антителах Zif268 (Egr-1; 1:1000 Cat# sc-110; Santa CruzBiotechnology, США) в течение 72 ч при 4 C в PBSTx с 1% NGS, с последующей инкубацией в биотинилированных козьих антикроличьих вторичных антителах (1:1000: Vector LaboratoriesBA-1000) в течение ночи в PBSTx и 1% NGS.

После визуализации DAB (18 минут) Zif268-положительное окрашивание клеток в каждой интересующей области было сфотографировано с помощью объектива 10 с помощью светового микроскопа (Leica, Германия). Автоматический подсчет клеток был получен с помощью ImageJ ( NIH, США) так же, как и NeuN-положительные клетки, за исключением того, что округлость была установлена ​​на уровне 0,65–1,0.

Для подсчета Zif268-положительных клеток во всех регионах использовался один и тот же пороговый алгоритм, при этом количественно определялось от двух до шести срезов на интересующую область у каждой крысы. Использовалось среднее количество Zif268-положительных клеток на мм2 по срезам (из обоих полушарий) в интересующей области.

2.10|Анализ данных

ANOVA с использованием Statistica (v13; Dell Inc.) проводился для проверки средних различий между четырьмя группами крыс (Sham-No Trace, Sham-Trace, ATN-No Trace и ATNTrace). Факторы повторных измерений были добавлены для дней (ОЗУ и простая дискриминация), блоков испытаний (парно-ассоциированных задач) и подсчета Zif268 в связанных регионах или субрегионах, представляющих интерес.

ANOVA для задач RAM и простой дискриминации сравнил четыре группы, чтобы подтвердить, что две группы с ложным поражением и две группы с поражением ATN согласуются друг с другом, но следует отметить, что в RAM или простых задачах дискриминации не было следов компонента. Как для простой дискриминации, так и для парных задач на взлетно-посадочной полосе, взаимное преобразование данных о задержке в отдельных испытаниях использовалось для обеспечения однородности дисперсии.

В любой день тестирования преобразованные задержки генерировали среднее значение задержки для каждого из шести испытаний без вознаграждения и шести испытаний с вознаграждением. Для простых задач на различение мы анализировали среднюю разницу в задержке (среднее значение испытаний с вознаграждением минус среднее значение испытаний без вознаграждения), но не анализировали испытания с вознаграждением и без вознаграждения отдельно из-за сбоя хранения данных.

Все три показателя задержки были доступны для парно-ассоциированных задач на память (испытания без вознаграждения, испытания с вознаграждением и разница в задержке). Чтобы учесть множественные сравнения и сбалансировать ошибки типа I и типа II, мы использовали уровень значимости p < 0,02 для поведенческого анализа, поскольку в задаче с парными ассоциатами было три связанных показателя (испытания без вознаграждения, испытания с вознаграждением). и средняя разница в задержке).

Было проведено шесть первичных анализов областей, представляющих интерес для экспрессии Zif268, поэтому значимость в этих анализах была установлена ​​на уровне p < 0,01. Апостериорные тесты Ньюмана-Кейлса (NK) оценивали парные групповые различия. Простой анализ основных эффектов использовался в тех случаях, когда имелись значительные взаимодействия с участием повторяющихся факторов.

3|ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1|Проверка поражения

Все кроме одной из 18 крыс с поражениями ATN соответствовали априорному критерию 50% двустороннего повреждения ATN и минимум 25% на полушарие. Среднее двустороннее повреждение составило 76% в обеих группах с поражением ATN (диапазон: ATN-No Trace, 61–93%; ATN-Trace, 63–93%; рисунок 2). Исключенная крыса имела удовлетворительное поражение только в одном полушарии (48% всего, 75% левого и 20% правого).

На рисунке 2d показано, что количество NeuN для нейронов ATN у крыс с поражением ATN (M=3388, SD=2024) было значительно ниже значений, обнаруженных у крыс с ложным поражением (M=15, 339, SD=1065; этот подсчет был аналогичен подсчету Frost et al., 2020). Восемь из 17 крыс с поражением (четыре в группе со следами и четыре в группе без следов) не имели повреждений ни медиодорсального таламуса (MD), ни реюнит-ромбовидных (Re/Rh) ядер, а повреждения были относительно небольшими. эти структуры у остальных девяти крыс с поражениями.

Когда произошло повреждение MD, оно произошло в передних аспектах, прилегающих к ATN. Так, повреждение МД оценивалось примерно от {{0}},72 до +2,10 мм от Брегмы, где оно колебалось от 0% до 41% потери клеток по всей длине. группа (медиана=21%). Когда возникало Re/Rh-повреждение, оно также примыкало к области ATN, поэтому оно оценивалось примерно на расстоянии от 1,08 до 2,04 мм от Брегмы, где оно колебалось от 0% до 33% (медиана=6%). Обратите внимание, что эти значения процента повреждений не отражают всю область MD и Re/Rh, поскольку задние области обоих ядер были интактными у всех крыс с поражением ATN.

For more information:1950477648nn@gmail.com