Абстрактный
Цель: это исследование было проведено, чтобы подтвердить применимость смешанного растительного экстракта (MHE) в качествеантивозрастная косметикаингредиент, исследуя егокожа против старенияактивности in vitro и in vivo. Методы: в этом исследовании мы подготовили MHE, используя ультразвуковую экстракцию, содержащую Forsythiae fructus, Tribuli fructus, тюлень Соломона, сибирский женьшень, Ponciri Fructus и женьшень. Мы исследовалиомолаживающий эффект MHE для кожи в дермальных фибробластах.омолаживающая активностьопределяли по уровню синтеза коллагена I типа. Уровни мРНК матриксной металлопротеиназы -1 (MMP1) и тканевого ингибитора металлопротеиназы 1 (TIMP1) измеряли с помощью qRT-PCR. Уровни белка MMP1 оценивали с помощью блоттинга. Клинические тесты влажности кожи, эластичности, текстуры и морщин проводились с использованием косметических средств, содержащих 1% МГЭ. Результаты: MHE индуцировал активацию синтеза проколлагена I типа и экспрессии мРНК TIMP1. MHE привел к снижению уровней мРНК MMP1 и белков. Кроме того, после нанесения на кожу косметических средств, содержащих 1 процент МГЭ, увлажнение, эластичность, текстура кожи и «гусиные лапки» улучшились через 4 недели после лечения. Вывод: MHE оказывает омолаживающее действие, стимулируя синтез коллагена и подавляя экспрессию гена MMP1 in vitro, а также оказывает эффект улучшения состояния кожи in vivo. Таким образом, было показано, что МГЭ имеет ценность в качестве функционального косметического ингредиента.
Ключевые слова:Уход за кожей, Против старения, Против морщин, Натуральная косметика, Фитотерапия
Травяные добавки Cistanche против старения
Введение
Кожа — это орган, который вступает в контакт с внешней средой и жизненно важен для нашего выживания, выступая в качестве основного барьера.против внешних атактакие как инфекционные агенты и телесные повреждения; кроме того, он выполняет несколько важных физиологических функций (Slominski et al., 2004; Vollmer et al., 2018). Когда мы стареем,функция кожипостепенно ухудшается с атрофическими изменениями, вызванными ультрафиолетовыми (УФ) лучами, загрязнением и стрессом, а также старением кожи, которое происходит по мере уменьшения количества клеток кожи и толщины кожи (Farage et al., 2013).
Старение кожиможно разделить на эндогенное старение и экзогенное старение. Эндогенное старение кожи происходит естественным образом с течением времени независимо от внешних воздействий. Дермально-эпидермальныйсоединения (DEJ) слипчивость ослабевает, а с дифференцировкойкератиноцитов, снижается образование липидов (Makrantonakiи другие., 2007). С другой стороны, экзогенное старение вызывается внешнимифакторов, таких как УФ-лучи, инфракрасные лучи (ИК), курение, мелкиепыль и образ жизни. Среди них фотостарение вызвано УФ-излучением.лучи проникают в кожу и повреждают коллаген и эластинв дерме. При этом эластические волокна и коллагенволокна кожи деформируются, в результате чего снижается эластичностьи провисание. Коллаген является основным компонентом внеклеточнойматрицы и играет важную роль в определении функции ткани.
Среди различных типов коллагена коллаген типа 1 составляет около 75-80 процентов от общего количества коллагена (Landau, 2007; Lovell et al., 1987; Mays et al., 1988). Когда кожа подвергается воздействиюУФ-лучи в течение длительного времени, свободные радикалы производятся. Эти бесплатныерадикалы стимулируют экспрессию матриксной металлопротеиназы-1(MMP1), который способствует деградации коллагена и ингибирует коллагенсинтез, который снижает эластичность кожи и приводит к появлению морщин.Таким образом, для предотвращения и улучшения морщин кожи, вызванныхстарения, необходимо разработать ингредиент, который способствуетвыработку коллагена и ингибирует экспрессию и активностьMMP1 (Влашеки другие., 2001).
Старение кожитесно связана с качеством жизни. Поскольку кожа является наиболее видимым органом, она дает нам представление о процессе старения (Binic et al., 2013). В настоящее время предпринимаются различные усилия в области медицины, фармацевтики и косметики, чтобыпредотвратить и улучшить старение кожи.разработка антивозрастных ингредиентовявляется одной из наиболее важных антивозрастных стратегий.
Мы подготовили растительные экстракты с использованием ультразвуковой экстракции для разработки новых антивозрастных ингредиентов, содержащих плоды Forsythiae fructus, Tribuli fructus, тюлень Соломона, сибирский женьшень, плоды Ponciri и женьшень.
Из растений с различным лечебным и кожным действием были отобраны шесть фитопрепаратов. Forsythiae fructus, сушеные плоды Forsythia suspense (семейство Oleaceae), известные как Лянь Цяо.в Китае, впервые был записан в Shennong Bencao Jing,престижная монография по традиционной китайской медицине (ТКМ)(Донги другие., 2017). Он использовался как средство для очистки от тепла идезинтоксикационная ТКМ для лечения инфекционных заболеваний, таких какострый нефрит, рожистое воспаление и язвы (Wangи другие., 2018). Этошироко используется в клиниках в качестве отдельного лекарства или составного рецепта.Современная фармакология показала, что он обладает разнообразными свойствами.биоактивность, в том числе противовоспалительное, антибактериальное,вирусное, антиоксидантное, противоопухолевое, антидиабетическое, антигиперлипидемическое,антиандрогенная алопеция, против рвоты, против старения и противактивность при ожирении и нейропротекторное, гепатопротекторное исосудорасширяющее действие (Dongи другие., 2017). Кроме того, былоСообщается, чтоForsythiae fructusимеет отбеливание кожи, анти-атопический дерматит и омолаживающий эффект. По данным Тайваняобщенациональная база рецептов,Форзиция Фруктусбылвходят в десятку лучших трав, наиболее часто используемых для лечения атопического дерматита.дерматит (15,9%), крапивница (11,49-13,4%) и акне (22,3%).(Донги другие., 2017). Forsythiae fructusсодержит сапонины,флавоноиды,и алкалоиды и олеаноловая кислота, которая имеет полезнуюфармакологическое действие. Кроме того, он содержит арктигенин иматаирезинол. Являясь физиологически активными ингредиентами кожи, ониявляются ингибиторами тирозиназы, влияющими на метаболизм меланина.путь, индуцированный -меланоцитостимулирующий гормон ( -МСХ)и привлекают внимание как косметические отбеливающие материалы(Янг и Чоу, 2011).Трибули фруктус, который является сушеным плодомТрибулус террестрисL, как сообщается, имеет фармакологическийдеятельность по улучшению половой функции, профилактике и лечениюсердечно-сосудистые заболевания, а также улучшение нейропротекции иПамять. Он также обладает антидиабетическим, противовоспалительным иантиоксидантное действие (Chhatreи другие., 2014). Трибули фруктусэкстракт содержит большое количество диосгенина, тигогеина, различныхсапонины и др. Эти сапонины являются важнейшими биоактивнымикомпоненты, ответственные за различные биологические эффекты, такие какэффект афродизиака, антигипертензивный эффект и защитное действиедействие против ишемически-реперфузионного повреждения и противораковое,антибактериальное и противогрибковое действие (Chhatreи другие., 2014).
Другие ингредиенты включают фуростаноловые и спиростаноловые сапонины, полисахариды, флавоноидные гликозиды, алкалоиды и амиды. Кроме того, он эффективен против атопического дерматита у крыс и обладает противовоспалительным действием (Chhatre et al., 2014). Сообщалось, что омолаживающий эффект экстракта Tribuli fructus увеличивает выработку проколлагена I типа и эластина в клетках HS68, способствует накоплению липидов в адипоцитах и, в конечном итоге, уменьшает морщины и эластичность кожи (Kim et al., 2016). ). Сибирский женьшень (Acanthopanax senticosus) — листопадный кустарник, принадлежащий к семейству Ога вместе с женьшенем и диким женьшенем. Сибирский женьшень имеет много общего с женьшенем и используется в качестве растительного лекарственного средства при инсульте, высоком кровяном давлении и диабете. Экстракт сибирского женьшеня уже давно используется в восточной медицине, и до недавнего времени в различных исследованиях сообщалось о фармакологических и физиологических результатах. Компоненты сибирского женьшеня, которые были идентифицированы до сих пор, включают элеутерозиды A, B, C, D, E, I, K, L и M, а также сезамин, хизанозид, кофейную кислоту, хлорогеновую кислоту, кампестерол, витамины и минералы (Park и др., 2010).
Содержит тритерпеноидные сапонины, лигнаны, кумарины ифлавоноиды, среди которых наиболее активными компонентами считаются фенольные соединения (Huang et al., 2011). Есть много сообщений об эффективности экстракта элеутерококка на коже.Эффект против морщин,антиоксидантный эффект,синтез коллагенаСообщалось о ингибиторной активности коллагеназы в отношении фотостарения (Park et al., 2010). Сообщалось, что экстракт элеутерококка регулирует синтез коллагена IV типа, влияя на пролиферативную способность эпидермальных стволовых клеток и утолщая эпидермис (Choi et al., 2016). Соломонова печать — корневище Polygonatum odoratum (синоним: P.officinale), обладающее тонизирующим действием и используемое в восточной медицине для лечения сердечной недостаточности и диабета. Печать Соломона оказывает противоциклическое и противокашлевое действие; снимает напряжение с сердца, является мочегонным, тонизирующим, гипогликемическим, успокаивающим и тонизирующим средством; он используется для лечения заболеваний легких, в том числе туберкулеза и желудочно-кишечных расстройств (Haroon et al., 2012). Кроме того, он широко используется при лечении заболеваний крови; он благотворно влияет на почечные протоки и предотвращает появление седины, проблем со зрением, головокружения и стригущего лишая. Это тоник для нервов, который используется при лечении диабета (Haroon et al., 2012). Тюлень Соломона обладает высоким содержанием фенола и антиоксидантной активностью. Гомоизофлаваноны тюленя Соломона ингибируют образование конечных продуктов усиленного гликозилирования. Тюлень Соломона продемонстрировал сильную регулирующую активность иммунной системы кишечника и способность индуцировать дифференцировку остеокластов и апоптоз, индуцированный лектинами. В случае экстракта листьев P. odoratum в качестве примера приводится функция заживления ран (Fathi et al., 2014). Ponciri fructus immatures — незрелый плод Poncirus trifoliata Rafinesque, принадлежащий к семейству Rutaceae (Jung et al., 2016). Недавно сообщалось о противовоспалительных и антигиперчувствительных эффектах, а также о том, что экстракт жирного ила вызывает апоптоз раковых клеток (Lee et al., 2008). Известно, что фрукты Пончири эффективны при лечении атопического дерматита. При нанесении на кожу экстракта плодов Пончири сообщалось о его воздействии на атопические дерматиты, такие как эпидермальный гиперкератоз, отек дермы и цитокины. В частности, сообщалось о значительном снижении зуда, количества тучных клеток, продукции IgE и экспрессии фактора роста нервов. Экстракты плодов пончири показали эффективное противовоспалительное действие против атопического дерматита и противозудную эффективность за счет регулирования иммунных механизмов. Кроме того, известно, что пероральное введение экстракта плодов Пончири полезно для лечения и профилактики аллергических заболеваний (Hwang et al., 1997). Женьшень — широко используемое традиционное лекарственное средство на травах с многофункциональным действием. Женьшень используется из-за его противовоспалительного, антиоксидантного, противоопухолевого и омолаживающего действия (Choi, 2008; Kim & Ko, 2020). Было проведено множество исследований эффективности женьшеня на коже (He et al., 2018). Среди них есть много сообщений о сапонинах и гинзенозидах, которые являются репрезентативными ингредиентами женьшеня. Сапонины представляют собой соединения, которые широко распространены в большинстве растений и существуют в различных формах. Сапонины могут ускорять различные биологические активности, такие как гемолиз, а также антибактериальные, противовирусные и антиоксидантные функции. Кроме того, сапонины обладают противовоспалительными свойствами, которые могут уменьшить отек и воспаление кожи. Гинзенозиды повышают уровень интерлейкина (IL)-1, одного из воспалительных цитокинов, который, как известно, способствует ангиогенезу и индуцирует фактор роста и накопление сосудистого эндотелия.в местах ожогов кожи у мышей. Также сообщалось об их эффекте удаления макрофагов из кожных ран и стимуляции заживления ран (Kim et al., 2011).
Целью этого исследования было выяснить омолаживающий эффект смешанного растительного экстракта (MHE) на кожу in vitro и in vivo.
Методы
1. Оценка эффективности in vitro
1) Подготовка МВО
Сушеные плоды Forsythia suspense, сушеные плоды Tribulus Terrestris L., элеутерококк колючий (корень Acanthopanax senticosus (Eleuthero)), тюлень Соломона (корневище и корень Polygonatum Officinale), плоды Poncirus Trifoliata Rafinesque и женьшень (Panax) купили на местном рынке. Основываясь на теории «Инь-Ян» и «Пяти элементов» традиционной китайской медицины (ТКМ), Forsythia suspensa, Tribulus terrestris L. и Poncirus trifoliata Rafinesque, соответствующие «Ян», и сибирский женьшень, женьшень и печать Соломона, соответствующие Был выбран «Инь». Шесть лекарственных трав снова были разделены по характеристикам, соответствующим пяти элементам (дереву, огню, воде, металлу или золоту и земле или почве). Эти лекарственные травы были смешаны в одинаковом соотношении для баланса каждого элемента, а Poncirus trifoliata и женьшень, соответствующие Земле, были объединены с другими элементами, чтобы соответствовать пропорциям (таблица 1). Шесть лекарственных растений экстрагировали 30-процентным этанолом с помощью ультразвука (20 кГц, 2 часа). После концентрирования с помощью роторного испарителя добавляли 30% (об./об.) бутиленгликоля и раствор разбавляли для приготовления экстракта, содержащего 1% твердого вещества.
Таблица 1. Состав смеси трав
2) Культуры клеток и реагенты
Клетки первичных фибробластов человека (HDFn) были получены от PromoCell (нормальные дермальные фибробласты ювенильной крайней плоти человека, C-12300; PromoCell, Германия). Культуры клеток с болезнью Дульбеккомодифицированная среда Игла с высоким содержанием глюкозы (DMEM с высоким содержанием глюкозы, SH30243.01, Hyclone, Cytiva), содержащая 10% (об./об.) эмбриональной бычьей сыворотки (FBS, SH30084.03, Hyclone) и 1% антибиотикаантимикотические агенты (Анти-анти, 15240-062, Gibco, США) культивировали при 37°С в инкубаторе с 5% СО2.
3) Анализ жизнеспособности клеток (анализ МТТ)
Анализ MTT измерял жизнеспособность клеток и определял цитотоксичность MHE. Клетки высевали из расчета 5×103 клеток/лунку на 96-луночный планшет и культивировали в течение 24 ч в условиях клеточной культуры.условия. Затем среду удаляли, клетки промывали раствором фосфатно-солевого буфера (PBS, 21-040-CV; Corning, США), помещали клетки в новую бессывороточную среду иобрабатывали клетки концентрациями {{0}}.01, 0.025, {{10}}.05. 0,10, 0,25, 0,50, 0,75 и 1,00 процента образцов и инкубировали клетки в течение 24 и 48 часов. Затем добавили 100 мкл раствора МТТ.(0,5%, 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2H тетразолия бромид) к каждому хорошо и инкубировали клетки еще 2 часа. После удаления культуральной среды мы добавили 100 мкл 100-процентного диметилсульфоксида (ДМСО), встряхивали клетки в течение 10 минут и измеряли оптическую плотность при 590 нм с помощью считывателя микропланшетов (считыватель микропланшетов Epoch 2, BioTek, США).
4) Измерение проколлагена I поколения.
Концентрацию проколлагена I типа в культуральной среде измеряли с использованием имеющегося в продаже набора ELISA (Procollagen type I C-peptide EIA Kit, MK101, TaKaRa).Bio, Япония) согласно инструкции производителя. Каждый образец анализировали в трех повторностях.
5) Измерение уровней экспрессии мРНК с использованием количественного
Полимеразная цепная реакция в реальном времени (qRT PCR) Клетки высевали в количестве 1×105 клеток/лунку на 6-луночные планшеты. Клетки HDFn культивировали в течение 24 ч; затем клетки синхронизировали с DMEM с высоким содержанием глюкозы без FBS в течение 24 часов. Среду заменяли средой без сыворотки и обрабатывали концентрациями 0.05, 0.10, 0,25, 0,5 и 0,75 процента образцов. на 24 и 48 часов. Экстракцию РНК проводили из клеток HDFn с использованием набора для выделения РНК (TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit, 9767A, Takara Bio, США), а образцы очищали в соответствии с протоколами производителя. Выделенную РНК (1 мкг) синтезировали в кДНК с использованием набора реагентов TR (набор реагентов PrimeScriptTM RT с gDNA Eraser, RR047A, Takara Bio, USA). Используя мастер-микс ПЦР в реальном времени SYRB Green (Power SYBRTM Green PCR Master Mix, 4367659, Applied BiosystemsTM, США) и QuantStudioTM 3 (инструмент ПЦР в реальном времени QuanStudioTM 3, A28132, Thermo Fisher Scientific, США) для ПЦР в реальном времени, Уровни экспрессии генов были стандартизированы по гену домашнего хозяйства глицеральдегид 3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH). Праймеры, использованные в данном исследовании, представлены в табл. 2. Эксперименты проводили в двух повторностях для трех независимых повторов. Анализ кривой плавленияпроводили для каждого набора праймеров.
6) Вестерн-блоттинг
Белковые лизаты из клеток фибробластов экстрагировали лизисным буфером (EzRIPA Lysis Kit, WSE-7420; ATTO Corporation, Япония). Для количественного определения белков использовали метод Бредфорда.Равные количества белков смешивали с 5X буфером для образцов (TLP-102-01, TransLab, Корея) и денатурировали при 99°С в течение 10 минут. Белки разделяли с помощью 10% SDS-PAGE при 150 В в течение 150 мин и переносили на мембраны PVDF (Clear Blot Membrane, 3322546, ATTO Corporation, Japan). Мембраны блокировали 0,5% бычьим сывороточным альбумином (BSA, A4503-10G; Sigma) в течение 1 часа и промывали трис-буферным солевым раствором, содержащим Tween-20 (10X TBS с Tween 30, TR{ {17}}; Biosesang, Корея) 3 раза; Затем мембраны инкубировали с первичными антителами против MMP-1 (рекомбинантное антитело против MMP1 [EP1249Y], ab134184, Abcam, США), -актином (анти- -актином (N-tern) и PA0207 (Abfrontier , Корея) при 4 градусах в течение ночи. После промывки мембраны обрабатывали анти-кроличьим IgG-пероксидазой хрена (HRP) (Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody, #7074; Cell Signaling Technology, США) в качестве вторичного антитела. в течение 1 ч. Детекцию хемилюминесценции проводили с использованием реагента для детекции вестерн-блоттинга ECL Prime (GE Healthcare, США) и ATTO WSE-6100 LuminoGraph (ATTO Corporation, Япония).Для количественного анализа полученные изображения анализировали с помощью Image программное обеспечение (CS Analyzer 4, корпорация ATTO, Япония).
7) Статистический анализ
Статистический анализ проводили с помощью GraphPad Prism версии 3.03 для Windows (GraphPad Software, США). Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение для 3 экспериментов. непарныйИспользовался t-критерий Стьюдента, а значения p<0.05 were considered statistically significant.
2. Оценка эффективности in vivo
1) Реагенты и косметические продукты
Тестируемыми продуктами были лосьон для кожи, крем-эссенция и крем для глаз; эти кремы содержали 1 процент MHE в качестве активного ингредиента, показанного в таблице 3.
2) Участники-люди
Все добровольцы согласились с целью и содержанием теста и перед началом теста подписали письменные формы информированного согласия. Им не разрешалось использовать какие-либо другие средства по уходу за кожей, и тестируемые продукты наносились на лицо в следующем порядке: кожа-крем для глаз (только на гусиные лапки)-крем-эссенция-крем-лосьон. Исследование было проведено в соответствии с рекомендациями Хельсинкской декларации и одобрено Институциональным наблюдательным советом Корейского национального института политики в области биоэтики (#P01-202108-13-001).
3) Проверка эффективности
В этом исследовании участвовала 21 женщина в возрасте от 45 до 55 лет (среднее значение ± стандартное отклонение 50,81 ± 2,86) с нормальной кожей. Тестируемые продукты применялись два раза в день (утром и вечером) в течение 4 недель. Участники посещали исследовательский центр каждые 2 недели, а места испытаний измерялись в лаборатории, где температура окружающей среды и относительная влажность поддерживались на уровне 22±2 градуса и 50±5 процентов соответственно. Участники акклиматизировались в течение 20 минут в лаборатории после мытья лица и оценивались на предмет увлажнения кожи, ее эластичности, текстуры и наличия «гусиных лапок». Увлажнение кожи измеряли с помощью Corneometer® CM825 (C plus K electronic GmbH, Кельн, Германия); Эластичность измеряли с помощью Cutometer® MPA 580 (C plus K electronic GmbH, Кельн, Германия), а текстуру и «гусиные лапки» измеряли с помощью DermaTOP 3D-HE (EOTECH SAS, Франция).
4) Оценка побочных реакций кожи
Побочные реакции проверялись при каждом посещении с помощью опросника и наблюдения. При оценке субъективные параметры классифицировались как зуд, покалывание, щекотание, жжение, покалывание,жесткость и уплотнение, а объективные параметры классифицировали как эритему, отек, чешуйки и папулы.
5) Статистический анализ
Данные анализировали с использованием программного обеспечения SPSS®. Статистическую значимость различий между временными точками определяли с помощью анализа повторных измерений; р-значение<0.05 считалось статистически значимым. Скорость изменения (в процентах) от базового значения рассчитывалась следующим образом:
Скорость изменения=((после лечения - исходный уровень)/исходный уровень) × 100 процентов
