Антивозрастные эффекты антоцианов Ribes Meyeri на нервные стволовые клетки и стареющих мышей. Часть 2

Пожалуйста свяжитесьoscar.xiao@wecistanche.comЧтобы получить больше информации

Nar спасает стареющие фенотипы 23M-NSC

Антоцианы R. Meyer богаты многими видами флавоноидов и биоактивных компонентов [1, 3-5]. Чтобы определить, какой компонент антоцианов R. Meyer играет важную роль в омоложении, мы провели метаболомный анализ R. Антоцианы Мейера. Мы обнаружили, что Nar может быть важным метаболитом флавоноидов, поскольку путь биосинтеза флавоноидов был сильно обогащен антоцианами R. Meyer (дополнительная таблица 1). Чтобы определить антистареющие эффекты Nar, различные концентрации (0, 1,7, 3,4, 6,8, 13,6 и 27,2 мкг/мл) применяли к 23M-NSC, а анализы CCK-8 применяли для исследовать жизнеспособность клеток. Как показано на дополнительном рисунке 3, обработка Nar 6,8 мкг / мл увеличила жизнеспособность клеток на 150 процентов. Для дальнейшего изучения антистареющих эффектов Nar 23M-NSC обрабатывали Nar, и затем были обнаружены связанные со старением индикаторы. .гесперидин используетВ 23M-NSC, обработанных 6,8 мкг/мл Nar, экспрессия мРНК p16nk4a была снижена (рис. 3A). Nar также удлинял теломеры культивируемых mNSC и увеличивал синтез ДНК (рис. 3B, 3C). Чтобы дополнительно изучить влияние Nar на пролиферацию клеток, мы провели иммунофлуоресцентное окрашивание Ki67, который представляет собой ядерный антиген митотических клеток, который экспрессируется на протяжении всего клеточного цикла, за исключением G0 [19,27]. Обработка Nar усиливала пролиферацию клеток, что измерялось увеличением числа Ki67-положительных клеток (рис. 3D, 3E). Затем мы также обнаружили потенциал дифференцировки НСК в нейроны. Действительно, обработка Nar 6,8 мкг/мл также увеличивала количество MAP2-положительных клеток (рис. 3F, 3G). Эти результаты постоянно демонстрируют, что Nar может обратить вспять старение 23M-NSC.

Рисунок 2. Антоцианы Рибес-Мейера улучшают память и способность к обучению мышей за счет увеличения количества нервных стволовых клеток (НСК). (A) Требуется время, чтобы найти платформу. (B) Требуется время, чтобы сначала добраться до платформы. (C) Средняя скорость, чтобы найти платформу. (D) Расстояние, пройденное до того, как найти платформу. (Э. Ф) Лечение Р.потерянная империякаждый антоциан увеличивал количество и размер нейросфер по сравнению с контролем. (G) Количество нейросфер размером от 50-100 мкм было увеличено в результате лечения мышей антоцианином R. Meyer. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. *П<><0.01, and=""><0.0001 compared="" with="" untreated="" cells."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" in="" each="" experimental="">

Рисунок 3. Влияние нарингенина (Nar) на старение нервных стволовых клеток мыши (MNC). (A) Экспрессию мРНК p16k4a измеряли с помощью qRT-PCR в 23M-NSC с обработкой 6,8 мкг/мл Nar в течение 48 часов и без нее. (B) Распределение фаз клеточного цикла 23M-NSC, обработанных Nar в течение 48 часов, и контрольных клеток. (C) Относительная длина теломер 23M-NSCs значительно увеличилась при обработке Nar, (D) Иммунофлуоресцентное окрашивание Ki67 мышц, обработанных Nar в течение 48 часов, с ядерным мечением DAPI, (E) Количественная оценка (D), (F) Представитель поля иммунофлуоресцентного окрашивания MAP2 и GFAP культивируемых мНСК после контроля и обработки Nar. (G) Количественная оценка (F). Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов. *П<>< 0.01,="" and="">< 0.0001="" compared="" with="" untreated="">

Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы узнать больше

Nar улучшает память и познание у стареющих мышей

Когнитивные уровни снижаются с возрастом, и омолаживающие процедуры могут улучшить когнитивные уровни [11, 28]. Чтобы проверить антивозрастные эффекты Nar in vivo, мы вводили 20 мг/кг Nar стареющим мышам C57BL/6 (возраст 12 месяцев) через хвостовую вену. Тест MWM использовался для изучения пространственной памяти и когнитивных способностей мышей.микронизированная очищенная флавоноидная фракция 1000 мг.В течение 5 дней повторного обучения время, необходимое стареющим мышам, получавшим Nar, для нахождения платформы, постепенно уменьшалось по сравнению с контрольной группой (рис. 4А). Результаты испытаний показали, что время, необходимое для первого достижения платформы, сократилось (рис. 4B), а время, проведенное в зоне платформы, увеличилось (рис. 4C). Кроме того, стареющие мыши, получавшие Nar, наблюдались в зоне платформы с большей частотой, чем в контрольной группе (рис. 4D). Вместе эти результаты показывают, что Nar может улучшить пространственную память и когнитивные способности у стареющих мышей.

Анализ секвенирования РНК обработанной Nar крови стареющих мышей

Чтобы исследовать специфические для Nar механизмы омоложения, мы проанализировали профиль экспрессии генов в обработанной Nar крови стареющих мышей с использованием секвенирования РНК (RNA-seq). Результаты выявили 1961 ген с дифференциальной экспрессией (DEG). Как правило, Nar подавлял экспрессию генов, и только небольшое количество генов повышалось по сравнению с необработанной контрольной группой (рис. 5А, 5В). Кроме того, гены важных сигнальных путей, связанных со старением, были подавлены, особенно гены сигнального пути TNF (рис. 5C).отефлавоноидЭти результаты подразумевают, что Nar влияет на сигнальный путь TNF, тем самым сильно влияя на функцию TNF-a, которая участвует в связанных со старением когнитивных нарушениях [29,30]. Поэтому мы исследовали уровни TNF- в плазме мышей. Результаты d иммуноферментного анализа (ИФА)

Рисунок 4. Нарингенин (Nar) улучшает память и способность к обучению у стареющих мышей. (A) Латентный период ускользания у стареющих мышей, получавших Nar, был короче по сравнению с контрольной группой. (B) Время, необходимое для первого достижения платформы, было короче у стареющих мышей, получавших Nar, чем в контрольной группе. (C) Продолжительность времени, проведенного в зоне платформы. (D) Частота наблюдения в зоне платформы для стареющих мышей, получавших Nar, по сравнению с контрольной группой. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение трех независимых экспериментов.*P<>< 0.01,=""><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" used="" for="" each="" experimental="" group.="" revealed="" that="" nar="" treatment="" led="" to="" the="" downregulation="" of="" plasma="" tnf-a="" levels="" (figure="" 5d).="" we="" also="" examined="" pl6ink4agene="" expression="" in="" the="" hippocampus="" of="" mice="" and="" demonstrated="" that="" nar="" treatment="" downregulates="" pl6ink4amrna="" expression(figure="">

Цистанхе может омолаживать

ОБСУЖДЕНИЕ

Старение связано с повышенным риском снижения когнитивных функций, а также с потерей способности к обучению и памяти [22,23]. Потеря нейронов и нарушение нейрогенеза тесно связаны с возрастной дисфункцией головного мозга [11-13]. Таким образом, увеличение числа нейронов и улучшение нейрогенеза имеют решающее значение для лечения старения. R. Meyer, богатое флавоноидами и другими биологически активными веществами растение [1, 3-6], имеет множество функций, которые еще не описаны. В настоящем исследовании антоцианы R. Meyer способствовали пролиферации НСК и увеличивали образование нейросфер однородной морфологии. Лечение антоцианином R. Meyer также улучшило фенотип клеточного старения со снижением уровня АФК и связанной со старением экспрессии гена P16nk4, увеличением фазы синтеза ДНК и удлинением теломер.пуритане витамин сБолее того, результаты иммунофлуоресцентного окрашивания показали, что антоцианы R Meyer стимулировали образование нейронов. Эти результаты свидетельствуют о том, что антоцианы R. Meyer оказывают омолаживающее действие на мНСК, а также могут непосредственно способствовать образованию нейронов in vitro. Кроме того, снижение когнитивных функций тесно связано со старением [22, 23]. Наши результаты MWM показали, что внутрижелудочное введение антоцианов R. Meyer улучшило пространственную память и способности к обучению у стареющих мышей, а также увеличило

Figure 5. Tumor necrosis factor(TNF)-a plays an essential role in naringenin (Nar)-mediated anti-aging effects. (A) Summary of gene expressions in mouse blood, as determined by RNA-seq. (B)Heatmap showing differentially expressed genes (DEGs) in the blood between control and Nar-treated mice. DEGs were identified by a fold change of >2.0 или<0.5. (c)bar="" graph="" showing="" the="" major="" correlated="" signaling="" pathways.="" (d)="" heatmap="" showing="" degs="" in="" the="" tnf="" signaling="" pathway="" (e)="" plasma="" tnf-a="" levels="" determined="" by="" enzyme-linked="" immunosorbent="" assay.="" (e)="" p16hka="" gene="" expression="" levels,="" as="" determined="" by="" qrt-pcr.="" data="" are="" presented="" as="" the="" mean="" ±="" sd="" of="" three="" independent=""><><><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group.="" nsc="" and="" neuronal="" numbers="" in="" the="" hippocampus="" of="" aging="" mice.="" these="" results="" suggest="" that="" r.="" meyer="" anthocyanins="" may="" enhance="" cognitive="" function="" by="" increasing="" nsc="" proliferation="" and="">

Использование метаболомного анализа для изучения специфического состава антоцианов R. Meyer показало, что Nar может быть важным метаболитом флавоноидов. Ранее сообщалось, что Nar улучшает старение клеток миокарда [31], улучшает метаболическую способность кишечного тракта [32] и оказывает противовоспалительное [33] и противораковое [34] действие. Однако влияние Nar на НСК при старении остается неизвестным. Чтобы изучить омолаживающие эффекты антоцианов R. Meyer, мы провели дальнейшие исследования с использованием Nar. Лечение 6,8 мкг/мл Nar повышало жизнеспособность клеток, снижало экспрессию гена P16ink4a, удлиняло теломеры и стимулировало дифференцировку NSC в нейроны in vitro. Чтобы дополнительно оценить влияние Nar на пролиферацию клеток, мы провели исследования иммунофлуоресценции. Результаты показали, что лечение Nar увеличивало как количество Ki67-положительных клеток, так и долю MAP2-положительных клеток, что позволяет предположить, что Nar может способствовать нейрогенезу. Кроме того, влияние Nar на обучение и память также оценивалось у стареющих мышей. Результаты теста MWM последовательно продемонстрировали, что лечение Nar улучшает пространственное обучение у стареющих мышей. Интересно, что анализ RNA-seq показал, что Nar может влиять на старение через сигнальный путь TNF, особенно путем подавления экспрессии TNF-a в крови стареющих мышей. Анализы ELISA также показали, что лечение Nar снижало уровни TNF-α в плазме по сравнению с контрольными стареющими мышами. TNF-a является ключевым фактором сигнального пути TNF и тесно связан с когнитивным старением. В его функции входит содействие патологическим изменениям в синапсах гиппокампа [29] и ингибирование пролиферации клеток-предшественников [35]. Измененные уровни TNF связаны с когнитивными нарушениями при депрессии, шизофрении, биполярном расстройстве и болезни Альцгеймера [30,36,37]. Более конкретно, TNF-α активируется у пациентов с болезнью Альцгеймера [38].

Таким образом, наше исследование демонстрирует, что антоцианы R. Meyer улучшают эффекты старения в НСК через Nar, который снижает уровни TNF-a in vivo и улучшает когнитивные функции у стареющих мышей. В совокупности наши результаты обеспечивают новую стратегию для разработки клинических методов лечения, направленных на более широкое использование лечебной ценности антоцианов R.Meyer.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальные животные

Это исследование было одобрено Комитетом по уходу за животными Университета Тунцзи и проводилось в соответствии с установленными правилами. Антоцианы R. Meyer вводили внутрижелудочно в течение 2 месяцев 12-месячным мышам, содержащимся на фоне C57BL/6. Nar вводили в хвостовую вену мышам в возрасте от 1- до 12- месяцев, содержавшихся на фоне C57BL/6. Контрольным мышам давали такой же объем фосфатно-солевого буфера (PBS).

Получение антоцианов R. Meyer и Nar

Плоды R. Meyer (500 г) гомогенизировали с использованием гомогенизатора тканей и суспендировали в 1 л метанола, содержащего 0,1% соляной кислоты. Ультразвуковую экстракцию проводили трижды по 30 мин при комнатной температуре. Экстракты объединяли, а метанол концентрировали при пониженном давлении с получением экстрактов R Meyer. Экстракт дополнительно очищали макропористой смолой AB-8 для увеличения содержания антоцианов.

Нарингенин (C15H1205; молекулярная масса: 272,25; чистота: больше или равна 98 процентам; степень чистоты для ВЭЖХ) был приобретен у Chengdu Push Biotechnology Co. Ltd. (Сычуань, Китай) и хранился при 2 градусах {{6 }} градусов в сухой среде без света. Концентрация исходного раствора составляла 100 мМ в диметилсульфоксиде (ДМСО). Конечная концентрация ДМСО не превышала 0,1% в культуральной среде.

Анализы нейросферы и дифференцировки

NSC были получены из SVZ мыши. Мышей умерщвляли после анестезии, а SVZ осторожно вырезали и диссоциировали на отдельные клетки с помощью 0,4 ЕД/мл папаина (Imogen, Александрия, Вирджиния, США; № по каталогу: LS003126). НСК высевали в чашки диаметром 10 см, содержащие 10 мл базальной среды NSC с 10 нг/мл EGF (PeproTech, Крэнбери, штат Нью-Джерси, США; № по каталогу: AF-100-15) и 10 нг/мл FGF (PeproTech, Крэнбери, штат Нью-Джерси). , США; № по каталогу: AF-100-18B). Нейросферы пассировали каждые 5 дней. НСК из недавно диссоциированных нейросфер -2 пассажей высевали на ламинин (Gibco, Gaithersburg, MD, USA; № по каталогу: 23017015) и гидробромид поли-L-орнитина (Poly-L; Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). ; № по каталогу: P3655), покрытые предметными стеклами в среде NSCBasalMedium без добавок для дифференциации. Дифференцированные клетки подвергали иммуноокрашиванию на Tu1 (бета-тубулин II; Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США; номер по каталогу: 480011), MAP2 (Thermo Fisher Scientific, номер по каталогу: MA5-12826) и глиальный фибриллярный кислый белок. (GFAP; Thermo Fisher Scientific, № по каталогу PA5-16291), а затем докрасили 4'6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI; Thermo Fisher Scientific, № по каталогу: D1306). Слайды исследовали с помощью микроскопа Olympus BX53 (Olympus, Мэдисон, Висконсин, США). Количественную оценку TuJ1- и MAP2-положительных клеток проводили путем подсчета меченых клеток в трех независимых экспериментах. Статистический анализ проводили с использованием непарного t-критерия.

Эта статья взята с сайта www.aging-us.com AGING 2020, Vol. 12, № 17