Антиоксидантный и антивозрастной потенциал пептидной композиции (Gal2-Pep), конъюгированной с галловой кислотой

Кожа очень уязвима к преждевременному старениюиз-за внешнего стресса, поэтому в этом исследовании пептидная композиция (галлоил)2–КТППТТП (Гал2–Pep) был синтезирован путем объединения пептида TPPTTP и галловогокислота (ГА). Все пептиды были синтезированы на 2-хлортритилхлоридной смоле с использованием твердофазного синтеза пептидов.синтез (SPPS) и анализировали на ионизации электрораспылением (ESI)/квадруполь-время-fflПросветная (Q-TOF) тандемная система масс-спектроскопии (МС). Изначально Гал2–Pep не показал токсичности ниже концентрации 100mM с выживаемостью клеток 88 процентов для кератиноцитов ифибробласты.активные формы кислорода(ROS) очищающая активность Gal2–Пеп был более стабильным по сравнению с одним ГА; и через четыре недели в комнатетемпература, ееАктивность по очистке АФКоставался выше 50%. Кроме того, пептидная композиция,Гал2–Pep также проявлял ингибирующий эффект на эластазу в CCD-1064Sk.фибробластклетки. На основании результатов RT-qPCR в данном исследовании было доказано, что Gal2–Пеп увеличил экспрессию PGC-1a кпредотвращатьокислительный стресс, и подтвердил свой потенциал в качествесредство против старениякувеличение экспрессииколлаген I типаи поснижение экспрессии матриксной металлопротеиназы -1 (MMP1).Выводы полученные подтверждают предположение о том, что пептидный состав, синтезированный в этом исследовании, может быть использован в качествеприродный антиоксидантисредство против старениядля его косметических применений.

Нажмите здесь, чтобы получить больше информации об антивозрастных продуктах Cistanche

1. Введение

Старение кожипроисходит в результате постепенного снижения и, в конечном итоге, прекращения деления клеток кератиноцитов и бромида.взрывы в коже. Морщины на коже развиваются по мере уменьшения количества клеток, что приводит к денатурации внеклеточного матрикса, что приводит к сухости и потере упругости.зуд в коже.1 Повреждение внутриклеточной митохондриальной ДНКа также происходит снижение скорости синтеза белкав процессе старения кожи.2 Старение кожи имеет два основных путипути, внутренние и внешние, с ультрафиолетовым (УФ) воздействием

основной движущей силойвнешнее старение. Ультрафиолетовые лучи вступают в реакцию с основными компонентами кожи., включая липиды, белки и нуклеиновые кислоты, для производства активных форм кислорода (АФК), которые приводят ксмерть.3–5 Чрезмерный уровень АФК также приводит к расщеплению ианомальное связывание цепей коллагена или эластина и способствует экспрессии матриксных металлопротеиназ (ММР), таких как ММР-1, которые расщепляют коллаген, что приводит к образованию морщин на коже иускорение старения кожи.6,7 Поэтому антиоксидантная терапия для устраненияАФК и активировать митохондриальный потенциал обладают достоинствами для защиты кожи от старения.

В дополнение к АФК эластаза играет важную роль в потереэластичность кожи, которая расщепляет эластин, важный белоквнеклеточный матрикс.8 Эластин из-за его значительной упругой отдачихарактеристики, обеспечивают эластичность кожи, в то время как эластазаспособность расщеплять эластин и другие белки.8 Поэтому ингибироватьАктивация фермента эластазы может быть ключевой стратегией обвисания кожи. предотвращение потери эластичности кожи.

В этом исследовании мы разработали новый материал, который сочетает в себегамма-коактиватор рецептора, активируемого пролифератором пероксисом1-альфа (PGC-1a)-производный пептид TPPTTP и галловая кислота (GA)для использования в антивозрастной косметике. ГА — это фитохимическое вещество, содержащееся в различных фруктах и ​​овощах, в том числе в винограде, помидорах и зеленом чае, которое, как известно, обладает высокими антиоксидантными и антибактериальными свойствами. eффЭСТ.9 Хотя ГА используется в косметической и пищевой промышленности из-за этих полезных свойств.ффects, его состав имеет тенденцию быть нестабильным.10 Таким образом, мы разработали (галлоил)2–КТППТТП (Гал2–Pep), чтобы повысить стабильность GA, привязав его к PGC-1aпроизводное пептида TTPTTP.

В этом исследовании мы синтезировали (галлоил)2–КТППТТП (Гал2– Pep) пептидный состав в конъюгации с галловой кислотой и подтвержденныйего потенциал в качестве антиоксиданта и антивозрастного агента.

2. Материалы и методы

2.1. Материалы

Модифицированный ДульбеккоСреда Игла (DMEM), пенициллин/стрептомицин, эмбриональная бычья сыворотка (FBS), фосфат-буффкрасныйфизиологический раствор (PBS) и трипсин были приобретены у Gibco (Carls

плохо, Калифорния). Гидроксибензотриазол (HOBt), диизопропилкарбодиимид (DIC), 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен (DBU),N, N-диизопропилэтиламин (ДИЭА), галловая кислота иN-сукцинил-три-аланил-pнитроанилид были получены от Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури).L-Аминокислоты формы (Fmoc-Lys (Boc)–ОН, Fmoc-Thr (tбу)–ОН и Fmoc-Pro–OH) были приобретены у Bead-Tech (Сеул,Корея).

2.2. Синтез пептидов и пептидов, связанных с галловой кислотой

Все пептиды были синтезированы на 2-хлортритилхлоридной смоле (200mмолярная шкала, значение замещения¼ 1,46 ммоль г 1) с использованием HOBt–DIC-опосредованный твердофазный синтез пептидов (SPPS).

Синтез пептидов методом SPPS проводили с небольшими модификациями.катионы, относящиеся к предыдущим исследованиям.11–13 2-смола хлортритилхлорида (ХТХ) набухала в дихлор

метан (ДХМ, 8 мл) в течение 30 мин. Смолу промывалидиметилформамид (ДМФА). Все реакции проводили при комнатной температуре. Производные аминокислот с защитой Fmoc (2 эквивалента(эквивалент), дляфипервую присоединенную аминокислоту или 5 экв. для других аминокислот) связывали либо с DIEA (5 экв. для присоединенной аминокислоты), либо с HOBt/DIC (6 экв./5 экв.) в ДМФА.футовэснятие защиты с Fmoc с использованием 2% (об./об.) DBU в ДМФ (2 раза по 2 мин, 8 мл). И все этапы промывали 5 раз ДМФА. Конечную галловую кислоту соединили с пептидами, присоединенными к лизину.После сочетания галловой кислоты смола былаaфильтруют, моют,и сушат в высоком вакууме. Расщепляющий раствор (TFA:деионизированная [DI] вода: TIS¼ 95 : 2,5 : 2,5, об./об./об. процент) обрабатывали в течение 2 ч.для получения сырых пептидов. Неочищенные пептиды осаждали и трижды промывали холодным диэтиловым эфиром.

Аналитическая обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография(ОФ-ВЭЖХ) проводили на разделении Waters 2695.Модуль с колонкой Capcell Pak C18 (4,6 мм 250 мм, 5mм, Шисейдо). Подвижная фаза состояла из 0,05% ТЖК в Н2O (подвижная фаза А) и 0,05% ТФУ в ацетонитриле (подвижная фаза В).

Элюирование было достигнуто с использованием линейного градиента для мобильныхфаза B от 5 до 65 процентов в течение 30 минут прирасход 1.0 мл мин 1. Пики пептидов детектировали при длине волны 230 нм. Полупрепаративную ОФ-ВЭЖХ проводили на системе ВЭЖХ Waters (насос 600E, детектор UV-484) с Gemini RP-C18.колонка (21,2 мм 250 мм, 5mм, Феноменекс). Подвижная фаза состояла из 0,05% ТЖК в Н2О (подвижная фаза А)и 0,05% TFA в ацетонитриле (подвижная фаза B). Элюирование было достигнуто с использованием линейного градиента для подвижной фазы B изот 7 до 22 процентов в течение 15 минут приlрасход 10 мл мин 1.пептидные пики регистрировали спектрофотометрически при длине волны 230 нм.

Синтезированные пептиды растворяли в 5% растворе муравьиной кислоты в воде и анализировали методом ионизации электрораспылением (ESI).квадруполь-время-lПросветная (Q-TOF) тандемная масс-спектроскопия(MS) (TripleTOF6600, ABSciex, Фостер-Сити, Калифорния). Образцы вводили в систему Q-TOF, оснащеннуюисточник нанораспыления вlставка 1mл мин 1. Ион ESIпараметры источника были следующими: напряжение ионного распыления 1,5 кВ, завеса газа при 10 фунтов на квадратный дюйм и защитный газ при 5 фунтов на квадратный дюйм. Спектры вв режиме полного сканирования и МС/МС собирали в диапазонеm/z

100–1200 Да при времени накопления 25 мс на спектр.Энергия столкновения была увеличена с 10 до 80. В результатеданные были получены с помощью Analyst TF, поэтомуизделия и автоматическиназначается центроидом 80 процентов с минимальным пиком, шумоподавлением 10 процентов, средней деизотопией с 3-процентным порогом, без шумоподавления и без сглаживания. Синтезированные пептиды были идентифицированы.с допуском по массе 0.05 Da и секвенированы вручную с допуском МС/МС 0.01 Да.

2.3. Клеточные культуры и анализы жизнеспособности

Человеческие, взрослые клетки с низким содержанием кальция и высокой температурой (HaCaT)и CCD-1064Sk (нормальная человеческая кожафибробласты) клетки быликультивировали в DMEM с 10% FBS и 1% пенициллином/стрептомицин. Клетки инкубировали при 37 C в камере увлажненного воздуха с 5% CO2.Для анализа жизнеспособности использовали набор для подсчета клеток-8 (CCK-8, Dojindo Co. Ltd. Пекин, Китай). Клетки HaCaT и CCD-1064Skбыли посеяны в 96-луночные микропланшеты (5 103 клеток на лунку) и инкубировали при 37 C в 5 процентах CO2 в течение 24 часов. Затем культуры подвергали воздействию различных концентраций синтезированных пептидов или ГК и инкубировали при 37°С. C в 5 процентах CO2 в течение 24 часов. Жизнеспособность клетоквпоследствии было измерено с помощью CCK-8 в соответствии с рекомендациями производителя.

2.4. Определение антиоксидантной активности

2.4.1. анализ ДФПГ.Антиоксидантная активность синтезированныхпептиды и ГА оценивали индивидуально с помощью анализа DPPH. Анализы DPPH были выполнены после ранее сообщенного

методология с небольшими модификациямикатион.12,14–16 Во-первых, 0,12 мг/мл 1 Раствор DPPH готовили в метаноле, затем 100mл раствора DPPH и 100mл синтезированных пептидов или ГК смешивали в различных концентрациях ({{0}},1 мМ, 0,05 мМ, 0,01 мМ и 1mM) в 96-луночных микропланшетах. В инкубаторе с орбитальным встряхиваниемсмеси реагировали в течение 30 мин при 37 C и 100 об/мин безсвет. Затем измеряли оптическую плотность при 517 нм и рассчитывали антиоксидантную способность.

2.4.2. Активность по удалению АФК.

Внутриклеточную активность по очистке от АФК оценивали с использованием набора 20,70-дихлорфлуоресцеиндиацетата.(DCF-DA, Abcam, США). Клетки HaCaT высевали в микропланшеты с 96-лунками (5 103 клеток на лунку) и инкубировали при 37 С в течение 24 часов.AфутовПосле инкубации культуры подвергали воздействию синтезированных пептидов или ГК (100mМ) и инкубировали при 37 С в течение 24 часов. Затем клетки подвергали воздействию 10mМ раствора DCF-DA и инкубируют в течение 30 мин. АфутовПосле инкубации раствор промывали PBS.клетки анализировали с помощью микропланшет-ридера при возбуждении и

длины волн излучения 485 нм и 530 нм соответственно.

рисунок 1Стадия синтеза и подтверждение последовательности пептидов с использованием квадрупольного времениполет(Q-TOF) масс-спектрометрия: (a) подробная процедура синтеза (b) TPPTTP, (c) галлоил–TPPTTP и (d) (галлоил)2–КТППТТП.

2.5. Анализ митохондриального мембранного потенциала

Для окрашивания митохондрий использовали краситель JC-1 (Thermo Fisher, США).анализ мембранного потенциала (МмП). Клетки CCD-1064Sk и HaCaT высевали в 96-луночные микропланшеты (5 10 3клеток на лунку)

и инкубировали в 37 C и в 5 процентах CO2 в течение 24 часов. Кормовойэ инкубация,на культуры воздействовали различными концентрациями синтезированных пептидов и инкубировали при 37 C в 5 процентах CO2 в течение 24 часов.Краситель JC-1 был добавлен к клеткам CCD-1064Sk и HaCaT дляпроизводить конечная концентрация 10mM. Aфутовчерез 10 мин инкубации клетки дважды промывали 37 С ПБС. Зеленый и красныйфлуоресценциябыли измерены с помощью Varioskan LUXМногорежимный микропланшетный ридер (ThermoFisher, США) на выставкенация (lБывший)/излучение (lЭм) 475/530 нм иlБывший/lЭмиз 475/590 нм соответственно.

2.6. Анализ ингибирующей активности эластазы

Клетки CCD-1064Sk высевали в 6-луночные планшеты и инкубировали при 37 C в 5 процентах CO2 в течение 24 часов. Затем культуры обрабатывали концентрацией 100mМ синтезированных пептидов или ГА и инкубируют при 37 C в 5 процентах CO2 в течение 24 часов. Клетки дважды промывали dPBS и собирали каждую клетку с помощью клеточного скребка. Адобавить 0.2 M Трис–HCl (рН 8,0) с 0,1 процента Тритона-Х к собранномуклетки гомогенизировали с помощью ультразвука. Гомогенизированный раствор центрифугировали 20 мин при 3000 об/мин.и 4 С. Затемфутовберя супернатант, количество белка-катионирование проводили с использованием анализа белка BCA. белок на каждыйобразец был выдан вфиконечная концентрация 100mгмл 1, иN-сукцинил-три-аланил-p-нитроанилид был добавлен вконечная концентрация 1,6 мМ и реагировала при 36 С в течение 1 ч.Затем измеряли оптическую плотность при 405 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов.

2.7. ОТ-кПЦР

Уровни мРНК антивозрастных маркеров в клетках CCK-1064Skоценивали с помощью RT-qPCR. Тотальную РНК собирали с использованием реагента TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA) и обратного анализа.

расшифровано с использованием набора реагентов PrimeScript RT (Takara BioInc., Кусацу, Япония). Система CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния) и iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Labora

tories) использовали для RT-qPCR.b-Актин использовали для нормализации уровней мРНК коллагена I типа, MMP-1 и PGC-1.a. 

2.8. статистический анализ

 Данные представлены в виде среднего стандартное отклонение оттри независимых измерения и проанализированы с использованием Стьюдентаt-тесты, сp < 0.05 considered to be a signiне может разница.

Попросить больше:

Электронная почта: wallence.suen@wecistanche.com WhatsApp: плюс 86 15292862950