Усиленный апикальным напряжением сдвига транспорт органических катионов в клетках почки собак OCT2/MATE1- человека, трансфицированных Madin-Darby, включает ресничное зондирование

Чтобы получить больше информации:emily.li@wecistanche.com

Айшвария Джаягопал, Пол Р. Брейкман, Питер Солер, Николас Феррелл, Уильям Фисселл, Дина Л. Кроец и Шуво Рой

Кафедры биоинженерии и терапевтических наук (AJ, PS, DLK, SR) и педиатрии (PRB),

Калифорнийский университет Сан-Франциско (UCSF), Сан-Франциско, Калифорния;

и медицинский факультет, отделение нефрологии, Медицинский центр Университета Вандербильта, Нэшвилл, Теннесси (NF, WF)

АННОТАЦИЯ

Активный транспортпочечныйпроксимальные канальцы играют важную роль в распределении лекарств. Во время разработки лекарств, оценкипочечныйэкскреция имеет важное значение для определения дозы. Почечные биореакторы, которые воспроизводят физиологические родственники почек, такие как напряжение сдвига, вызванное потоком, могут лучше предсказывать поведение лекарств in vivo, чем современные модели in vitro. В этом исследовании мы исследовали роль напряжения сдвига в активном транспорте 4-(4-(диметиламино)-стирил)-N-метилпиридиния йодида (ASP plus) с помощью собак Madin-Darby.почкаклеткиэкзогенно экспрессирующие переносчики органических катионов человека, переносчик органических катионов 2 (OCT2) и белок 1 (MATE1), высвобождающий множество лекарств и токсинов. Клетки, культивированные в параллельном планшете при непрерывной перфузии среды, образовывали плотный монослой с высоким барьером для инулина. В ответ на повышение уровня напряжения сдвига (0.2-2 дин/см) клетки продемонстрировали соответствующее увеличение транспорта ASP плюс , достигая максимального 4,2-кратного увеличения при 2 дин/см² по сравнению с клетками, культивируемыми в статических условиях. Этот транспорт ингибировался имипрамином, что указывает на наличие активного транспорта в условиях напряжения сдвига. Клетки, подвергнутые сдвиговому напряжению в 2 дин/см2, также показали увеличение экспрессии РНК как у трансфицированных людей, так и у эндогенного OCT2 (в 3,7- и 2,0- раза соответственно). Удаление ресничек с помощью сульфата аммония устранило эффекты сдвига на ASP плюс транспорт при 0.5 дин/см², не влияя на ASP плюс транспорт в статических условиях. Эти результаты показывают, что напряжение сдвига влияет на активный транспорт органических катионов впочечныйтрубчатыйэпителиальные клетки зависимым от ресничек образом.

Цистанхе хорошо влияет на функцию почек

Введение

Несмотря на значительный прогресс в доклинических методах выбора оптимальных лекарственных препаратов-кандидатов, разработка лекарств остается длительным и дорогостоящим процессом, который имеет очень низкий выход на рынок новых молекулярных соединений (Watkins, 2011). Основным недостатком доклинических моделей является невозможность предсказать клиренс и токсичность для человека. Приблизительно 30 процентов препаратов, успешно прошедших доклинические исследования, не действуют на людей из-за непредвиденных значений клиренса или токсичности (Kola and Landis, 2004).

Почки являются особенно важной мишенью для моделирования клеточных культур in vitro, поскольку они отвечают за элиминацию более трети всех лекарств и большинства метаболитов (Morrissey et al., 2013).почечныйпроксимальные канальцы важны для тестирования лекарств во время разработки, потому что они выполняют большую часть активного транспорта кандидатов в лекарства и особенно чувствительны к токсическому повреждению (Giacominiet al., 2010).почечныйтрубочкапредставляет собой монослой эпителиальных клеток с оттекающим по апикальной поверхности фильтратом. Базальная мембрана лежит под канальцевым эпителием, а соседние перитубулярные капилляры обеспечивают реабсорбцию воды и салютов. Микроокружение проксимальных канальцев, особенно напряжение сдвига жидкости и апикобазальные онкотические градиенты, не полностью воспроизводятся обычными методами культивирования клеток. Эпителиальные клеточные биореакторы, которые улавливают существенную физиологию in vivo, могут повысить точность прогнозов клиренса и токсичности, полученных на основе анализов in vitro (Pfaller and Gstraunthaler, 1998; Astashkina et al., 2012).

Растущее количество данных указывает на то, что морфология и функциональность клеток проксимальных канальцев могут варьироваться в зависимости от среды роста, такой как пористость поверхности роста, воздействие жидкости с обеих сторон и/или напряжение сдвига жидкости. Предыдущая работа Essig и Friedlander (2003), а также наша лаборатория (Ferrell et al., 2010) продемонстрировали, что индуцированная потоком канальцевой жидкости перестройка в апикальном актиновом цитоскелете клеток проксимальных канальцев (Ferrell et al., 2010) . Впоследствии в нескольких исследованиях было продемонстрировано, что напряжение сдвига влияет на уровни экспрессии и локализацию множественных переносчиков захвата и оттока, включая натрий-водородный антипортер 3. Na/K-АТФазу, транспортеры глюкозы, эпителиальный натриевый канал и рецепторы эндоцитоза, мегалин и тубулин. (Дуан и др., 2010 г.; Рагхаван и др., 2014 г.; Янсен и др., 2016 г.; Эрнандес и др., 2018 г.). Другая работа продемонстрировала, что сдвиговый поток в системе трубчатого биореактора ориентирует и удлиняетпочечныйтрубчатыйклетки вдоль пути потока (Venzac et al. 2018). Данные in vitro указывают на то, что некоторые изменения в структуре цитоскелета и транспортной функции, вероятно, связаны с механосенсорной функцией ресничек (Overgaard et al., 2009; Raghavan et al., 2014); однако в нескольких исследованиях изучалось влияние напряжения сдвига на переносчики лекарств в почечных клетках. Кроме того, мало что известно о влиянии различных скоростей сдвига на функциональность клеток, особенно при длительном воздействии напряжения сдвига. В большинстве исследований рассматривалась одна скорость напряжения сдвига и проводились только краткосрочные эксперименты ({4}} часов), что затрудняло различие между истинными эффектами сдвига и реакцией клеточного стресса на резкие изменения в микроокружении (Duan и др., 2010; Джанг и др., 2013: Маджиорани и др., 2015).

Здесь микрофлюидный биореактор был использован для изучения влияния постепенного уровня напряжения сдвига напочечныйпереносчики лекарств в проксимальные канальцы, переносчик органических катионов 2 (OCT2) и белок 1 (MATE1), высвобождающий множество лекарств и токсинов. Мы демонстрируем, что увеличение апикального напряжения сдвига приводит к увеличению транспорта органических катионов и экспрессии транспортеров и что реснички участвуют в этом клеточном ответе на напряжение сдвига.

Материалы и методы

Изготовление и сборка устройства. Ранее мы опубликовали нашу конструкцию биореактора с параллельными пластинами, который обеспечивает путь потока жидкости регулируемой высоты через апикальную сторону клеток и статический резервуар на базальной стороне (Brakeman et al., 2016). Для работы, представленной здесь, мы адаптировали наш предыдущий дизайн для создания мультиплексного устройства с четырьмя отдельными путями потока, чтобы можно было одновременно тестировать четыре биологических условия (рис. 1). Каждое устройство состоит из трех слоев: основания с апикальным резервуаром 5- мл, средней пластины для вставки Snapwell (Costar, Corning, Corning, NY) с площадью ячеек 1,12 см² и верхней пластины, содержащей базолатеральный резервуар от 1- до 2- мл. Тарелки

были изготовлены из полисульфона, чтобы их можно было стерилизовать автоклавированием. Вырезанные лазером силиконовые прокладки высотой от 500- до 1000- мкм помещали между каждым набором пластин для герметизации отсеков для жидкости и на апикальной стороне для определения высоты канала. Биореактор был собран с помощью винтов. Резервуар для среды и ловушка для пузырей были встроены в колонку. Входные и выходные отверстия были соединены с помощью зазубренных соединителей с силиконовой трубкой Masterflex LS14 с внутренним диаметром 1,6- мм (Cole Parmer Lab Supplies, Vernon Hills, IL). Поток жидкости и, следовательно, апикальное напряжение сдвига устанавливали и контролировали с помощью перистальтического насоса (Cole Parmer).

Клеточная культура и поток. Клетки MDCK, трансфицированные либо пустым вектором, либо парой переносчиков захвата и оттока (hOCT2/hMATE1) (Konig et al..2011), были предоставлены доктором Мартином Фроммом (Эрланген, Германия) и культивированы в минимальная необходимая среда со сбалансированным солевым раствором Эрла (центр клеточных культур UCSF) с 10-процентной фетальной бычьей сывороткой (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс) и 1-процентным раствором пенициллина-стрептомицина (центр клеточных культур UCSF). Пятьсот микрограммов на миллилитр гигромицина (UCSF Cell Culture Facility) и 100 мг/ч мл генетицина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) добавляли к среде для дважды трансфицированных клеток. Для проточных экспериментов клетки hOCT2/hMATE1 MDCK высевали на нижнюю сторону вкладышей Snapwell (Corning) с плотностью 300 000 клеток/лунку (250 000 клеток/см"), выращивали в статических условиях до слияния, а затем помещали в в биореактор. Поток апикальной среды увеличивали в течение 7 дней с 0,1 до 1-6 мл/мин до тех пор, пока не было достигнуто желаемое напряжение сдвига, а затем оставляли стабильным на 72 часа перед экспериментом. Клетки выращивали в статических условиях в течение того же периода времени, что и в контрольной группе. .

Иммунофлуоресценция. Клетки фиксировали 4-процентным параформальдегидом (Thermo Fisher Scientific), пермеабилизировали 0,1-процентным тритон-ксином PBS (Sigma-Aldrich) и блокировали бычьим сывороточным альбумином (Sigma-Aldrich). Затем их инкубировали с меченым Alexa 488 мышиным моноклональным антителом zonula occludens-1 в разведении 1:50 (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) или первичным ацетилированным мышиным моноклональным антителом -тубулина (Life Technologies) в течение 60 минут. Клетки, обработанные антителом к ​​а-тубулину, затем инкубировали со вторичным антителом 561 против мышиного козла (Life Technologies) и фаллоидином (Thermo Fisher Scientific) для окрашивания F-актина. Визуализация была выполнена с использованием спектрального конфокального микроскопа Nikon (Токио, Япония) с 40-кратным масляным объективом.

Барьерная производительность. Инулин, полимер с молекулярной массой 5000 Да, является хорошо известным маркером скорости клубочковой фильтрации и маркером негерметичности проксимальных канальцев in vivo (Sohtell et al, 1983):

Меченый FITC инулин (Sigma-Aldrich) добавляли к апикальной среде и пропускали через устройства. Образцы отбирали из базального резервуара каждые 24 часа и анализировали на содержание инулина с помощью флуоресцентного считывателя планшетов Genios Pro (Tecan, Маннедорф, Швейцария). Барьерную функцию клеточного монослоя рассчитывали по уровням инулина, измеренным в апикальном и базальном компартментах, как описано в уравнении 1. Здесь Capital представляет собой концентрацию инулина в апикальном компартменте, а Cmal представляет собой концентрацию в базальном компартменте. Утечку инулина рассчитывали как концентрацию в базальном (донорском) компартменте, деленную на площадь клетки через 24 часа.

АСП плюс Транспорт. Трансдуцированные гены-транспортеры индуцировали 10 мМ бутиратом натрия (Sigma-Aldrich) за 24 часа до эксперимента по переносу, как описано ранее (Konig et al, 2011). При необходимости клетки инкубировали с ингибитором (500 мкМ имипрамина или 1 мМ циметидина (Sigma-Aldrich)) на базальной стороне в течение 30 минут с последующим добавлением 25 мкМ 4-(4-диметиламино)- стирил-N-метилпиридиний (ASP plus) (Life Technologies) и инкубирование в течение 1 часа. Образцы отбирали из апикальной и базальной сред. Затем клетки трижды промывали ледяным фосфатно-солевым буфером и лизировали для измерения ASP, а также накопления и транспорта. Транспортные эксперименты одновременно проводили на клетках, находящихся под напряжением сдвига, и культивировали в статических условиях. Концентрацию ASP плюс количественно определяли на флуоресцентном планшет-ридере Genios Pro (Tecan) при длине волны возбуждения 485 нм и длине волны испускания 590 нм.

Количественное определение белка. Клетки лизировали лизирующим буфером с 1% SDS-10 M NaOH при встряхивании в течение ночи. Содержание белка измеряли с использованием стандартного набора для анализа белка Pierce BCA (Thermo Fisher). При необходимости содержание белка нормализовали к площади роста клеток.

Экспрессия РНК. РНК экстрагировали из клеток с использованием набора RNeasy RNA Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany), а кДНК получали с использованием набора скриптов (Bio-Rad, Hercules, CA). кДНК использовали для обнаружения OCT2 и MATE1 человека и собаки и собачий P-гликопротеин (P-GP) с помощью количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой с использованием анализа Тагмана и зондов (Applied Biosystems) на приборе Fast Realtime PCR (Applied Biosystems). Рибосомный белок S18 (RS-18) использовали в качестве домашнего контроля. Влияние напряжения сдвига на экспрессию транспортера анализировали с использованием метода 4ACt с использованием уровней транспортеров, выраженных относительно RS-18 (Peters et al.2007; Schmittgen and Livak, 2008). P-GP использовали как меру глобальных эффектов напряжения сдвига на экспрессию транспортера.

Децилия. Клетки выращивали до слияния, а затем инкубировали в отсутствие или в присутствии 30 мМ сульфата аммония (Fluka AG) в течение 24 часов перед измерением ASP плюс транспорт (Oxergard et al 2009). Наличие ресничек определяли с помощью визуализации α-тубулина, как уже описано здесь.

Статистика. Все эксперименты были выполнены в трехкратной повторности с минимум двумя техническими повторами в каждом эксперименте. Данные выражены как среднее значение ± стандартное отклонение и представлены в виде диаграмм с ячейками и усами. Статистический анализ проводили с помощью непарного однофакторного или двустороннего дисперсионного анализа, а Р-значение<0.05 was="" considered="" significant.="" data="" were="" analyzed="" using="" prism="" version="" 6.0="" (graphpad,="" san="" diego,="">

Полученные результаты

Морфология клеток и барьерная функция. Недавний анализ Immunofluo клеток, помещенных под поток, выявил однородное образование монослоя с белком плотных контактов, zonula occludens -1, локализованным в плотных контактах между клетками как в статических, так и в проточных условиях (рис. 2, A-C). Количественная оценка общего содержания белка продемонстрировала увеличение содержания белка на квадратный сантиметр монослоя в 1,6- раз в ответ на напряжение сдвига (рис. 2D). Затем мы измерили проницаемость инулина, маркера негерметичности проксимальных канальцев, через монослой. Устройства сохранили барьерную эффективность на уровне 97,9% 6 1,42% в течение 7 дней культивирования при сдвиговом напряжении до 2 дин/см2 (рис. 2E), что привело к окончательной скорости утечки инулина на 6-й день { {15}},13–0,69 мг/см2 в сутки.

Влияние напряжения сдвига на транспорт органических катионов. Транспорт ASP plus, автофлуоресцентного субстрата OCT2 и MATE1, измеряли в течение 1 часа при различных уровнях напряжения сдвига (0.2-2 дин/см²). Клетки MDCK, экзогенно экспрессирующие hOCT2 и hMATE1, показали 4,2-кратное увеличение ASP плюс транспорт в ответ на напряжение сдвига 2 дин/см², что отражалось в показателях как клеточного накопления (рис. 3A), так и трансклеточного транспорта (рис. 3Б). Влияние напряжения сдвига на накопление или трансцеллюлярный транспорт ASP было сходным при напряжении сдвига 0,5 и 2 дин/см². Чтобы определить, увеличился ли транспорт активного ASP plus, транспорт ASP plus клетками, подвергшимися воздействию напряжения сдвига 0,2 дин/см, измеряли с предварительной обработкой 500 мкМ имипрамина или без нее, ОКТ{{20} } и MATE1-специфический ингибитор. Транспорт ASP плюс ингибировался имипрамином на 60,3% ± 15,8% в условиях напряжения сдвига по сравнению с 47,6% ± 19,7% в статических условиях (рис. 3C).

Чтобы лучше понять это наблюдение, влияние напряжения сдвига на экспрессию человеческого OCT2 (трансфицированного), собачьего OCT2 (эндогенного) и собачьего P-GP (эндогенного) измеряли в клетках, подвергавшихся воздействию различных уровней сдвига в течение 72 часов после медленное нарастание сдвига в течение 7 дней (рис. 4). По сравнению с клетками, культивируемыми в статических условиях, клетки MDCK, подвергшиеся сдвигу, показали повышенную экспрессию трансфицированного человеческого и эндогенного OCT2 (до 3,{9}} и 2,0- раз соответственно) без существенного эффекта. на экспрессию трансфицированного MATE1 или эндогенного P-GP.

Роль ресничек в ответ на сдвиг. Визуализация показала, что дважды трансфицированные клетки MDCK экспрессируют реснички как в статических, так и в проточных условиях (рис. 5, A и E). Воздействие на клетки 30 мМ сульфата аммония в течение 24 часов вызывало полную потерю ресничек (рис. 5, C и G). Важно отметить, что децилирование не оказало сильного влияния на клеточно-мембранные соединения, что было измерено с помощью визуализации F-актина, который закрепляет белки плотных контактов на клеточно-мембранных соединениях в эпителиальных клетках (рис. 5.D и HD (Stevenson and Begg. 1994). Хотя на этих изображениях наблюдается некоторое утолщение окрашивания F-актина, это не было последовательным открытием, и поэтому мы не оценивали этот эффект количественно. Децилирование не влияло на транспорт клеток, культивируемых в статических условиях, но полностью устранено влияние напряжения сдвига на ASP плюс транспорт в клетках, подвергающихся сдвигу 0,5 дин/см² (рис. 6).

Обсуждение

Почки играют центральную роль в выведении лекарств из организма человека. Важно точно воспроизвести сложную физиологию почек для тестирования лекарств in vitro, особенно в отношении потока жидкости. Было показано, что напряжение сдвига от потока жидкости влияет на морфологию клеток и переносчики ионов in vitro, но мало что известно о влиянии на переносчики лекарств (Duan et al., 2010; Ferrell et al., 2012; Jansen et al., 2016). . Кроме того, в большинстве предыдущих исследований измерялось только влияние кратковременного сдвига (1-6 часов), что вряд ли позволяет полностью изолировать эффекты напряжения сдвига от других реакций клеток на стресс (Duan et al.. 2010; Jang et al. 2013; Maggiorani et al.. 2015).В этих исследованиях мы сосредоточились на влиянии устойчивого (7 дней) напряжения сдвига от потока жидкости на перенос лекарственного средства, чтобы лучше имитировать устойчивое напряжение сдвига, испытываемоепочечныйтрубчатыйклеток в естественных условиях.

Понимание того, как переносчики лекарств реагируют на устойчивое напряжение сдвига, может улучшить прогнозы in vitro относительно переноса лекарств почками in vivo. Тщательно разработанные модели почек in vitro могут стандартизировать доклинические испытания и снизить частоту неэффективности лекарств.

В этой работе микрожидкостный биореактор с параллельными пластинами использовался для определения влияния устойчивого напряжения сдвига на транспорт органических катионов с помощью OCT2 и MATE1 впочечныйтрубочкаклеточная линия. Для этих исследований рассматривались несколько клеточных линий, в том числе клеточные линии человека, такие как клетки проксимальных канальцев человека из группы Хопфера (Orosz et al, 2004) и RPTEC (CRL-4031: Американская коллекция типовых культур, Манассас, Вирджиния) ( Wieser et al., 2008), но дважды трансфицированные клетки hOCT2/hMATE1 MDCK считались наиболее подходящим выбором для этого исследования по нескольким причинам. Во-первых, клетки MDCK постоянно демонстрируют прочное крепление к вставкам трансвелл, что позволяет им выдерживать начальное напряжение потока жидкости. Во-вторых, эти клетки образуют плотные монослои, что предотвращает протекание и имеет важное значение для изучения трансцеллюлярного транспорта маркерных субстратов. Наконец, экзогенная экспрессия транспортеров позволяет лучше обнаруживать активный транспорт и влияние возмущений.

Клетки, помещенные под поток, образовывали сливной монослой и локализовали белок плотных контактов на периферии клетки. Они также сохранили высокую барьерную функцию, измеренную по проницаемости для инулина. Способность эпителиальных клеток образовывать монослой, предотвращающий утечку жидкости и белка, чрезвычайно важна для правильного функционирования канальца. Здесь утечка через клетки MDCK была минимальной и составляла менее 1 мкг/см2 в день, что значительно ниже, чем через клетки человека. Ранее мы показали, что монослои клеток почек человека имеют утечку инулина 10-20 мкг/см² в день (Brakeman et al., 2016), подтверждая вывод о том, что клетки hOCT2/hMATE1 MDCK образуют прочный монослой.

Транспорт ASP plus был значительно увеличен в клетках hOCT2/hMATE1 MDCK, подвергнутых различным уровням напряжения сдвига в течение 72 часов, по сравнению со статическими контролями. ASP plus поглощается OCT2 (SLC22A2) и выводится MATE1 (SLC47A1), двумя переносчиками органических катионов, которые работают вместе, чтобы облегчитьпочечныйсекреция часто используемых препаратов, таких как метформин и цисплатин (Biermann et al., 2006; Wittwer et al., 2013). Аналогичные эффекты напряжения сдвига были зарегистрированы для переносчиков ионов в проксимальных канальцах. Сообщалось об увеличении поглощения альбумина, реабсорбции ионов, а также экспрессии и функции мегалина и тубулина в ответ на повышенное напряжение сдвига (Overgaard et al..2009; Duan et al.2010: Ferrell et al..2012:Raghavan et al., 2014). Контакт спочечныйклетки проксимальных канальцев к стрессу сдвига также связаны со снижением апоптоза и более быстрым восстановлением после острой токсичности цисплатина и усиленным ингибированием транспорта органических анионов (Jang et al.2013). Поскольку сдвиговое напряжение от потока жидкости постоянно присутствует в проксимальных канальцах, эти результаты в совокупности поддерживают использование более физиологических модельных систем in vitro для прогнозирования распределения и токсичности лекарств в почках. Следует отметить, что нет существенной разницы в транспортной функции между 0,5 и 2,0 дин/см² напряжения сдвига. Предыдущие исследования Эссига и Фридландера (2003) показали, что минимальный уровень сдвига 0,17 дин/см2 требуется для того, чтобы вызвать изменение морфологии клеток, а другие исследования измеряли влияние на физиология до 1 дин/см² (Duan et al., 2010). Это первое исследование, в котором изучается влияние диапазона более высоких и устойчивых уровней напряжения сдвига на функциональность почечных транспортеров лекарств, и возможно, что величина биологической разницы между напряжением сдвига 0,5 и 2,0 дин/см², которое мы оцененный был недостаточно большим, чтобы позволить идентифицировать различия между этими уровнями напряжения сдвига в наших анализах. Хотя необходимы дальнейшие исследования, наши результаты проливают свет на необходимые условия для физиологически значимых моделей и влияние повышенных уровней напряжения сдвига из-за болезни на почечные лекарственные препараты.

Одним из ограничений наших экспериментальных методов является то, что мы рассматривали транспорт только при pH 7,4 с использованием среды с pH 7,4 как на апикальной, так и на базальной сторонах, имитируя экспериментальные методы, ранее описанные для клеток hOCT2/hMATE1 MDCK (Konig et al..2011). Градиент pH от апикального к базальному может влиять на функцию OCT2 и MATE1, и обычно существует градиент pH в физиологических условиях (Muller et al., 2013). Таким образом, наши методы ограничили нашу способность оценивать взаимодействие между апикальным и базальным градиентом pH и напряжением сдвига на функцию OCT2 и MATE1. Поскольку мы использовали постоянное значение pH 7,4 во всех экспериментальных условиях, отсутствие градиента pH вряд ли повлияло на наши результаты, но потенциально ограничивает применимость наших результатов к транспорту OCT2 и MATE1 в присутствии градиента pH от апикального к базальному.

Неожиданно экспрессия мРНК трансфицированного человеческого и эндогенного OCT2 была увеличена в клетках, подвергавшихся воздействию всех уровней напряжения сдвига, по сравнению со статическими контролями. Это усиление экспрессии транспортера было специфическим, без заметного влияния на экспрессию эндогенного P-GP или трансфицированного MATE1. Повышающая регуляция экспрессии транспортера дает представление о механизме повышенного транспорта и может быть результатом повышенной стабильности мРНК или повышенной транскрипции мРНК. Интересно отметить, что как трансфицированные, так и эндогенные транспортеры активировались, что неожиданно, поскольку трансфицированный OCT2 экспрессировался под промотором цитомегаловируса и не должен подвергаться эндогенным механизмам регуляции экспрессии генов. Это наблюдение, хотя и удивительное, не является беспрецедентным. Сообщалось об аналогичном эффекте на клетки проксимальных канальцев, трансфицированных OAT1, подвергавшихся перфузии, но механизм повышенной экспрессии остается неясным (Jansen et al., 2016). В другом исследовании было обнаружено, что передача сигналов Nrf2 играет роль в увеличении эндогенной экспрессии MATE2-K в ответ на напряжение сдвига (Fukuda et al., 2017). Необходимо дальнейшее изучение этого вопроса, и оно станет предметом будущих исследований.

Мы также определили, что введение апикального сдвигового потока увеличивало содержание белка на квадратный сантиметр клеток. Этот эффект был одинаковой величины как для 0,5, так и для 2дин/см² сдвига, подобно эффекту, наблюдаемому для экспрессии мРНК и ASP плюс транспорт. Имеются некоторые свидетельства того, что напряжение сдвига вызывает более высокиепочечныйэпителиальные клетки, что приведет к большему объему клеток на квадратный сантиметр и, следовательно, к вероятному увеличению количества белка на квадратный сантиметр; однако это ранее опубликованное явление было лишь незначительным наблюдением в большом массиве данных и не оценивалось количественно (Long et al., 2017). Увеличение общего белка в клетках, выращенных в присутствии апикального сдвигового потока, может представлять собой нормальное содержание белка для здоровых людей.почечныйтрубчатыйэпителиальных клеток, что может быть достигнуто только путем воздействия на клетки апикального сдвигового потока. Таким образом, более низкие уровни содержания белка в клетках, выращенных в статической культуре, могут свидетельствовать об аномальном клеточном состоянии, которое может наблюдаться клинически в ситуациях с низким потоком апикального фильтрата, таких как острая почечная недостаточность. Это явление заслуживает дальнейшего изучения.

Известно, что реснички играют механосенсорные роли в проксимальных канальцах (Raghavan and Weisz, 2016). Следовательно, чтобы определить, играют ли они критическую роль в усилении транспорта, опосредованного OCT2 и MATE1-, о котором здесь сообщается, был измерен эффект удаления ресничек на функцию транспортера. Полная блокада зависимого от сдвига увеличения ASP плюс транспорта путем удаления ресничек в наших исследованиях аналогична эффекту, обнаруженному в исследованиях Raghavan et al. (2014), которые продемонстрировали зависимую от ресничек активацию эндоцитоза в ответ на ток жидкости. Сульфат аммония, вероятно, оказывает другие нехарактерные эффекты на поведение и функциональность клеток, которые могут косвенно влиять на перенос растворенных веществ. Несмотря на возможные нецелевые эффекты, этот метод децилирования действительно проверяет роль цилиарного восприятия в опосредованном транспортером движении органических растворенных веществ. Механизм передачи сигналов между механосенсорными белками в ресничках и транспортером в настоящее время неизвестен. Одна из гипотез состоит в том, что функция переносчиков органических катионов изменяется в результате изменения транспорта ионов. Известно, что удаление ресничек изменяет подвижность растворенных веществ в клетках проксимальных канальцев, в частности, путем снижения Nat/K plus . Локализация мембраны АТФазы и модификация парацеллюлярного транспорта (Overgaard et al.., 2009). Возможно, это приводит к изменениям функции MATE1, антипортера, зависящего от градиента H. Другая гипотеза состоит в том, что ощущение напряжения сдвига влияет на экспрессию переносчиков органических катионов. Напряжение сдвига модулирует функцию MATE2-K посредством передачи сигналов Nrf2 (Fukuda et al., 2017). Др. переносчики органических катионов могут сходным образом реагировать на сдвиговое напряжение, которое устраняется при удалении механосенсорных ресничек. Многое из этого неизвестно и требует дальнейшего изучения. Интересно, что удаление ресничек не оказывает значительного влияния на транспорт ASP plus клетками, подвергающимися сдвиговому напряжению 0,2 дин/см2, но устойчивый эффект наблюдается, когда сдвиговое напряжение увеличивается до 0,5 дин/см2. Это предполагает, что реснички ощущают пороговый уровень напряжения сдвига; в свою очередь, реснички сигнализируют об изменениях в экспрессии и функции транспортеров до того, как ожидаются измеримые эффекты на транспорт. В целом, зависимость транспорта органических катионов от восприятия цилиарным напряжением сдвига обеспечивает понимание задействованного механосенсорного сигнального пути и минимального уровня стресса, который может потребоваться для запуска надежного ответа на сдвиг.

Таким образом, эти данные демонстрируют, что напряжение сдвига от потока жидкости оказывает значительное влияние на функцию переносчика органических катионов и экспрессию в клетках MDCK. Более того, активация транспорта органических катионов зависела от присутствия ресничек. Мы предполагаем, что апикальное напряжение сдвига является важным компонентом любого моделирования in vitroпочечныйтрубчатыйклеток и, вероятно, является важным компонентом моделирования почечного секреторного клиренса и нефротоксичности лекарств. Конкретный механизм, с помощью которого сигналы механического стресса увеличивают активность и экспрессию транспортера, все еще неясен и требует дальнейшего изучения.

использованная литература

Асташкина А., Манн Б. и Грейнджер Д.В. (2012) Критическая оценка моделей клеточных культур in vitro для высокопроизводительного скрининга лекарств и токсичности. Pharmacol Ther 134:82–106.

Biermann J, Lang D, Gorboulev V, Koepsell H, Sindic A, Schröter R, Zvirbliene A, Pavenstädt H, Schlatter E, and Ciarimboli G (2006) Характеристика регуляторных механизмов и состояний переносчика органических катионов человека 2. Am J Physiol Cell Физиол 290: C1521–C1531.

Brakeman P, Miao S, Cheng J, Lee CZ, Roy S, Fissell WH и Ferrell N (2016) Модульный микрожидкостный биореактор с повышенной производительностью для оценки поляризованных клеток почечного эпителия. Биомикрофлюидика 10:064106.

Duan Y, Weinstein AM, Weinbaum S и Wang T (2010)Вызванные сдвиговым стрессом изменения локализации и экспрессии мембранных транспортеров в клетках проксимальных канальцев мыши. Proc Natl Acad Sci USA 107:21860–21865.

Ernandez T, Udwan K, Chassot A, Martin PY и Feraille E (2018)Нефрэктомия Union и напряжение сдвига апикальной жидкости снижают количество ENaC в основных клетках собирательных протоков. Am J Physiol Renal Physiol 314: F763–F772.

Эссиг М. и Фридлендер Г. (2003)Напряжение сдвига в канальцах и фенотип клеток проксимальных канальцев почек. J Am Soc Nephrol 14 (Приложение 1): S33–S35.

Ferrell N, Desai RR, Fleischman AJ, Roy S, Humes HD и Fissell WH (2010)Микрожидкостный биореактор со встроенными электродами для измерения трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) для оценки клеток почечного эпителия. Биотехнология Биоэнг 107:707–716.

Ferrell N, Ricci KB, Groszek J, Marmerstein JT и Fissell WH (2012)Обработка альбумина эпителиальными клетками почечных канальцев в микрожидкостном биореакторе. Биотехнология Биоэнг 109:797–803.

Феррелл Н., Риччи К.Б., Десаи Р.Р., Грошек Дж., Мармерштейн Дж.Т. и Фисселл В.Х. (2012)Микрожидкостный биореактор для исследований эпителиальных клеток в условиях напряжения сдвига жидкости. FASEB J 26:911.3.

Fukuda Y, Kaishima M, Ohnishi T, Tohyama K, Chisaki I, Nakayama Y, Ogasawara-Shimizu M, and Kawamata Y (2017) Напряжение сдвига жидкости стимулирует экспрессию MATE2-K через активацию пути Nrf2. Biochem Biophys Res Commun 484: 358–364.

Джакомини К.М., Хуанг С.М., Твиди Д.Дж., Бенет Л.З., Брауэр К.Л.Р., Чу Х., Далин А., Эверс Р., Фишер В., Хиллгрен К.М. и др.; Международный консорциум транспортеров (2010 г.) Мембранные транспортеры в разработке лекарств. Nat Rev Drug Discov 9: 215–236.

Jang KJ, Mehr AP, Hamilton GA, McPartlin LA, Chung S, Suh KY и Ingber DE (2013)Проксимальный каналец почки человека на чипе для оценки транспорта лекарств и нефротоксичности. Интегр Биол 5:1119–1129.

Янсен Дж., Федекостанте М., Уилмер М.Дж., Петерс Дж.Г., Кройзер У.М., ван ден Брук П.Х., Менсинк Р.А., Болтье Т.Дж., Стаматиалис Д., Ветцельс Дж.Ф. и соавт. (2016) Биоинженерные почечные канальцы эффективно выделяют уремические токсины. Научный представитель 6:26715.

Кола И. и Лэндис Дж. (2004 г.) Может ли фармацевтическая промышленность снизить уровень текучести кадров? Nat Rev Drug Discov 3: 711–715.

König J, Zolk O, Singer K, Hoffmann C и Fromm MF (2011)Двойно трансфицированные клетки MDCK, экспрессирующие человеческий OCT1/MATE1 или OCT2/MATE1: детерминанты поглощения и трансклеточной транслокации органических катионов. Br J Pharmacol 163:546–555.

Long KR, Shipman KE, Rbaibi Y, Menshikova EV, Ritov VB, Eshbach ML, Jiang Y, Jackson EK, Baty CJ и Weisz OA (2017)Апикальный эндоцитоз проксимальных канальцев модулируется напряжением сдвига жидкости через mTOR-зависимый путь. Мол Биол Селл 28:2508–2517.

Маджорани Д., Диссар Р., Беллой М., Солнье-Блаш Дж.С., Каземайу А., Дюкасс Л., Гре С., Бельер Дж., Кобе С., Баскандс Дж.Л. и др. (2015)Вызванное сдвиговым напряжением изменение организации эпителия в клетках почечных канальцев человека. PLoS One 10:e0131416.

Моррисси К.М., Стокер С.Л., Виттвер М.Б., Сюй Л. и Джакомини К.М. (2013) Почечные транспортеры в разработке лекарств. Annu Rev Pharmacol Toxicol 53: 503–529.

Мюллер Ф., Кениг Дж., Хойер Э., Мандери К. и Фромм М.Ф. (2013) Роль переносчика органических катионов OCT2 и белков MATE1 и MATE 2-K, выводящих несколько лекарств и токсинов, для транспорта и взаимодействия с лекарственными средствами противовирусного ламивудина. Биохим Фармакол 86: 808–815.

Orosz DE, Woost PG, Kolb RJ, Finesilver MB, Jin W, Frisa PS, Choo CK, Yau CF, Chan KW, Resnick MI, et al. (2004)Потенциал роста, иммортализации и дифференцировки нормальных клеток проксимальных канальцев взрослого человека. In Vitro Cell Dev Biol Anim 40:22–34.

Overgaard CE, Sanzone KM, Spiczka KS, Sheff DR, Sandra A, and Yeaman C (2009) Deciliation связано с резким ремоделированием соединений эпителиальных клеток и поверхностных доменов. Мол Биол Селл 20:102–113.

Peters IR, Peeters D, Helps CR, and Day MJ (2007) Разработка и применение множественных анализов внутренних эталонных (домашних) генов для точной нормализации исследований экспрессии собачьих генов. Вет Иммунол Иммунопатол 117:55–66.

Pfaller W и Gstraunthaler G (1998) Тестирование нефротоксичности in vitro--что мы знаем и что нам нужно знать. Environment Health Perspect 106 (Приложение 2): 559–569.

Raghavan V, Rbaibi Y, Pastor-Soler NM, Carattino MD и Weisz OA (2014)Стресс-зависимая регуляция апикального эндоцитоза в клетках проксимальных канальцев почек, опосредованная первичными ресничками. Proc Natl Acad Sci USA 111:8506–8511.

Рагхаван В. и Вайс О.А. (2016)Определение роли механосенсорики в регуляции функции проксимальных канальцев. Am J Physiol Renal Physiol 310:F1–F5.

Schmittgen TD and Livak KJ (2008) Анализ данных ПЦР в реальном времени с помощью сравнительного метода C(T). Нацпроток 3:1101–1108.

Sohtell M, Karlmark B и Ulfendahl H (1983) FITC-инулин как маркер почечных канальцев у крыс. Acta Physiol Scand 119: 313–316.

Стивенсон Б.Р. и Бегг Д.А. (1994) Концентрационные эффекты цитохалазина D на плотные контакты и актиновые филаменты в эпителиальных клетках MDCK. J Cell Sci 107: 367–375.

Вензак Б., Мадун Р., Бенараб Т., Моннье С., Кайрак Ф., Майрам С., Леконт Л., Амблар Ф., Виови Дж.Л., Декруа С. и др. (2018) Разработка небольших трубок с изменением диаметра для изучения организации клеток почек. Биомикрофлюидика 12: 024114.

Уоткинс П.Б. (2011)Науки о безопасности лекарств и узкое место в разработке лекарств. Clin Pharmacol Ther 89:788–790.

Wieser M, Stadler G, Jennings P, Streubel B, Pfaller W, Ambros P, Riedl C, Katinger H, Grillari J, and Grillari-Voglauer R (2008) hTERT сам по себе увековечивает эпителиальные клетки проксимальных канальцев почек без изменения их функциональных характеристик. Am J Physiol Renal Physiol 295: F1365–F1375.

Wittwer MB, Zur AA, Khuri N, Kido Y, Kosaka A, Zhang X, Morrissey KM, Sali A, Huang Y, and Giacomini KM (2013) Открытие сильнодействующих, селективных ингибиторов транспортера 1 (MATE1, SLC47A1) экструзии нескольких лекарств и токсинов с помощью профилирования отпускаемых по рецепту лекарств и компьютерного моделирования. J Med Chem 56:781–795.