Бета-глюкан усиливает иммунный ответ на вакцину против болезни Ньюкасла и изменяет экспрессию мРНК в селезенке у кур

АБСТРАКТНЫЙ

Настоящее исследование было проведено с целью изучения влияния перорального введения b-глюкана (G70), продукта, полученного из клеточной стенки дрожжей, на титры специфического ингибирования гемагглютинации (HI) вируса болезни Ньюкасла (NDV), пролиферацию лимфоцитов и роль субпопуляций Т-лимфоцитов у цыплят, обработанных живой вакциной против вируса NDV. Кроме того, с помощью секвенирования транскриптома исследовали влияние b-глюкана на экспрессию генов селезенки. Результаты показали, что добавление b-глюкана повышало титр сывороточного NDV HI, повышало индекс стимуляции NDV лимфоцитов в периферической крови и кишечном тракте и способствовало дифференцировке Т-лимфоцитов в CD4+ Т-клетки. Анализ секвенирования РНК (RNA-seq) продемонстрировал, что G70 усиливает экспрессию мРНК, связанную с рецептором, связанным с G-белком, и полипептидом MHC класса I, и подавляет экспрессию мРНК, связанную с кателицидином и бетадефензином. Иммуномодулирующий эффект G70 может осуществляться через сигнальный путь митоген-активируемой протеинкиназы. Подводя итог, можно сказать, что G70 может повысить иммунологическую эффективность живой вакцины против вируса NDV у кур и может применяться в качестве потенциального адъюванта в птицеводстве.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Ключевые слова: вакцина против болезни Ньюкасла, бета-глюкан, адъювант, чернокостная курица, РНК-секвенирование.

ВВЕДЕНИЕ

Полисахариды клеточной стенки дрожжей образуются непосредственно из клеточной стенки Saccharomyces cerevisiae и широко используются в качестве стимуляторов роста, противомикробных средств или иммуномодуляторов у домашней птицы для улучшения продуктивности и здоровья (Schiavone et al., 2017; Hasted et al., 2021). Ранее было показано, что продукт под названием PW220, который содержит полисахариды клеточной стенки дрожжей, усиливает иммунный ответ, вызванный вирусом болезни Ньюкасла (NDV), и изменяет микробное сообщество слепой кишки кур при пероральном введении (Bi et al., 2020). ). Полисахариды клеточной стенки дрожжей в основном состоят из b-глюкана и маннанолигосахаридов (Wang et al., 2018). В настоящем исследовании b-глюкан исследовали на предмет его влияния на иммунный ответ на вакцину NDV у кур. Селезенка является ключевым органом, запускающим иммунный ответ. Недавнее исследование показало, что PW220, который является продуктом клеточной стенки дрожжей, усиливает экспрессию мРНК TGF-b, IL-6, TLR5, GATA-3 и T-bet в селезенке кур (( Би и др., 2022). Однако конкретный механизм требует выяснения. Секвенирование РНК (RNA-seq) — одна из высокопроизводительных технологий, которую можно применять для количественного анализа экспрессии генов и обеспечения анализа различных профилей экспрессии на уровне всего транскриптома (Zhao et al., 2018). Благодаря преимуществам высокой чувствительности и низкой стоимости метод РНК-секвенирования широко применяется в исследованиях на домашнем скоте и птице (Teixeira et al., 2019; Yuan et al., 2020). Таким образом, в данном исследовании оценивали влияние введения b-глюкана на титры специфического торможения гемагглютинации (HI), пролиферацию лимфоцитов и субпопуляций Т-лимфоцитов у цыплят, перорально вакцинированных вакциной NDV. Кроме того, анализ транскриптома использовался для оценки влияния b-глюкана на экспрессию генов и основные пути передачи сигнала в селезенке кур.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Нажмите здесь, чтобы просмотреть продукты Cistanche Enhance Immunity

【Запросить дополнительную информацию】 Электронная почта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Животные

Однодневные коммерческие чернокостные цыплята (самцы) были приобретены у компании Guizhou Yushun Poultry Co., Ltd. (Аньшунь, Китай). Цыплята были помещены в проволочные клетки, обеспечивающие свободный доступ к корму и воде. В течение первых 7 дней комнатная температура поддерживалась на уровне от 33 до 35 градусов Цельсия, а затем постепенно снижалась на 1 градус Цельсия каждые 2 дня до 27 градусов Цельсия. Все цыплята обрабатывались в соответствии со стандартами, установленными Юго-Западным университетом по уходу за животными и Комитет по использованию (номер сертификата этики: IAC-2021-0057). В конце исследования все подопытные птицы были подвергнуты эвтаназии CO2.

Польза цистанхе для мужчин – укрепление иммунной системы

Вакцина

Живая вакцина против вируса NDV (штамм La Sota) была предоставлена ​​компанией Qingdao YEBIO Bioengineering Co., Ltd. (Циндао, Китай).

Реагенты 

Продукт клеточной стенки дрожжей (YP) G70 получали из стенки дрожжевых клеток (Saccharomyces cerevisiae), которая содержит b-глюкан (более или равно 70%) (AngelG70, QB/T4572, Angel Yeast, Ичан, Китай). И антиген, и сыворотки положительного контроля для измерения титров HI, специфичных для NDV, были приобретены в Центре развития диагностики Qingdao Regen (Циндао, Китай). CD3-APC (C2818-T9580), CD4-FITC (D0117-WA78E) и CD8- PE (L{{14) }}TH49T) у крыс были предложены компанией Nanjing Zeweil Biological Technology Co., Ltd. (Нанкин, Китай).

Экспериментальная дизайн

Сорок восемь чернокостных цыплят в возрасте 5 дней были случайным образом разделены на 3 группы (Таблица 1) и получали либо основной рацион (Таблица 2), либо базальный рацион с 0,1% G7{{10} } (b-глюкан, 0,7 г/кг) на протяжении всего настоящего исследования. Группу H (вакцина G70 +) и C (вакцина) перорально иммунизировали вакциной NDV на 14 и 28 день соответственно. Группу S (Sailne) обрабатывали равным объемом физиологического раствора. Образцы крови собирали путем пункции крыльев вены в возрасте 5, 7, 14, 21, 28, 35 и 42 дней для проверки титра HI. Через семь дней после повторной вакцинации по 8 цыплят в каждой колонке случайным образом отбирали и умерщвляли путем асфиксии с использованием CO2. Лимфоциты отделяли как от периферической крови, так и от тощей кишки для проведения пролиферации лимфоцитов и анализа проточной цитометрии. В случае отбора проб тощей кишки начальной точкой тощей кишки была поддерживающая связка двенадцатиперстной кишки, а от начальной точки тощей кишки отбирали срез длиной 5 см. Селезенку быстро замораживали в жидком азоте, а затем хранили при температуре -80 для RT-qPCR и анализа последовательности.

Таблица 1. Экспериментальный план

Таблица 2.1 Состав и содержание питательных веществ в экспериментальных базальных рационах бройлеров.

Привет исследование

Анализ титров HI, специфичных для NDV, в сыворотке проводили в соответствии с предыдущим описанием (Ball et al., 2019). Вкратце, сыворотку разводили фосфатно-солевым буфером (PBS) от 1:2 до 1:1024 в титровальном микропланшете с V-образным дном 96-луночек. Затем в каждую лунку добавляли 25 мл разведения NDV и инкубировали при 37 градусах в течение 30 минут. После этого в каждую лунку добавляли по 25 мл 1% суспензии петушиных эритроцитов и инкубировали при 37° в течение 30 мин. Все образцы были протестированы дважды, и в каждый планшет были включены как положительные, так и отрицательные контроли. Титры HI основывались на наибольшем разведении, которое приводило к полному ингибированию гемагглютинации. Средний титр HI и стандартную ошибку (SE) измеряли для каждой группы.

Выделение лимфоцитов из периферической крови

Лимфоциты выделяли и собирали из лимфоцитов периферической крови с использованием набора для разделения лимфоцитов (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd., Тяньцзинь, Китай). Затем лимфоциты хранили в суспензии со средой RPMI 1640 (Solarbio, Пекин, Китай), включающей 5% фетальной телячьей сыворотки и 25 мМ HEPES (рН 7,0).

Выделение лимфоцитов из тощей кишки

Процесс назначения проводился в соответствии с предыдущим описанием и с небольшими изменениями (Юань и др., 2020). Короче говоря, используйте клеточный фильтр диаметром 70 мм, чтобы разделить кишечник на 4 мл холодного PBS. После этого суспензию клеток-образца центрифугировали при 4500 об/мин в течение 12 мин с удалением супернатанта. Затем ресуспендируйте клетки кишечника на полной среде (Solarbio Co., Пекин, Китай), состоящей из 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в RPMI 1640 (Sijiqing Co., Ханчжоу, Китай). В конце концов, набор для выделения куриных лимфоцитов (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.) для разделения лимфоцитов. ткань кишечника разделяли на 4 мл холодного PBS с использованием клеточного фильтра 70 мм. Далее суспензию клеток-образца центрифугировали при 4500 об/мин в течение 12 мин и супернатант отбрасывали. После этого кишечные клетки ресуспендировали в RPMI 1640 (Solarbio Co.), содержащем 5% FBS (Sijiqing Co.). Наконец, лимфоциты разделяли с использованием набора для выделения куриных лимфоцитов (Tianjin Haoyang Biological Manufacture Co. Ltd.).

Пролиферация лимфоцитов 

Клетки высевали в 96-луночные планшеты (5£105 на лунку), стимулированные антигеном инактивированного NDV в течение 4 единиц гемагглютинации или равным объемом физиологического раствора. Каждый образец испытывался в 3 повторностях. Клетки и антиген инкубировали в течение 44 часов при 37 градусах в 5% CO2, а затем в каждую лунку добавляли 50 мл метилтиазолилтетразолия (МТТ) (2 мг/мл) и инкубировали еще 4 часа. Образцы центрифугировали при 1200 g в течение 8 минут при комнатной температуре. После этого супернатант осторожно удаляли и в каждую лунку добавляли по 100 мл ДМСО. Планшеты встряхивали в течение 8 минут для полного растворения кристаллов. Наконец, средняя оптическая плотность (ОП) была зарегистрирована при 570 нм. Индекс стимуляции (SI) получали по уравнению: значения ОП стимулированных скважин/значения ОП нестимулированных скважин (Cui et al., 2020).

Польза цистанхе для мужчин – укрепление иммунной системы

Анализ проточной цитометрии субпопуляций Т-лимфоцитов

Суспензии лимфоидных клеток выделяли и дважды промывали PBS. Концентрацию клеток доводили до 106/мл и затем хранили на льду. Каждый образец окрашивали 2 мл крысиного анти-куриного CD3-APC, CD4- FITC и крысиного анти-куриного CD8-PE в светонепроницаемых условиях в течение 30 минут, а затем путем 2 промываний PBS. Клетки анализировали посредством проточной цитометрии на проточном цитометре (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния).

RT-qPCR анализ

Тотальную РНК получали из селезенки с использованием реагента TRIzol (Takara, Shiga, Япония) в соответствии с рекомендациями производителя, а затем конвертировали в кДНК с помощью PrimeScript RT Master Mix (Takara, Далянь, Китай) на термоциклере T100 (Bio-Rad, Китай). Геркулес, Калифорния). Куриный бета-актин использовался в качестве гена внутреннего контроля. RT-qPCR выбранных генов проводили на системе множественной ПЦР в реальном времени (AB, Карлсбад, Калифорния) с использованием SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). Для оценки количественных изменений применяли относительный количественный метод (244CT) (Bi et al., 2022). Последовательности праймеров перечислены в Таблице 3.

Экстракция РНК

Каждый из 3 образцов селезенки из группы H (вакцина G70 +) и группы C (вакцина) использовался для секвенирования РНК с реагентом TRIzol (Takara). После этого РНК тестировали на загрязнение и деградацию с помощью 1% агарозного геля, а чистоту РНК анализировали с использованием спектрофотометра NanoPhotometer (IMPLEN, Westlake Village, CA). Концентрацию РНК определяли с использованием набора для анализа РНК Qubit во флуорометре Qubit 2.0 (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния). Целостность РНК измеряли с использованием набора для анализа RNA Nano 6000 системы Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния). Результаты показали, что РНК была полной и без загрязнения ДНК.

Транскриптомный анализ

Секвенирование транскриптома, сборка последовательностей и анализ данных были предоставлены компанией Novogene Bioinformatics Technology Co. Ltd. (Пекин, Китай). Основные процедуры транскриптома были перечислены следующим образом: 1) Очистку мРНК от тотальной РНК проводили с использованием магнитных шариков, прикрепленных к поли-Т-олиголиго. Фрагментацию проводили двухвалентными катионами в буфере реакции синтеза первой цепи NEB Next First Strand (5X) при высокой температуре. 2) Первую цепь кДНК синтезировали с использованием случайного гексамерного праймера и обратного вируса мышиного лейкоза Молони (M-MuLV). Затем синтезировали вторую цепь кДНК с использованием ДНК-полимеразы I и РНКазы H. 3) Оставшиеся выступающие части трансформировались в тупые концы за счет экзонуклеазной/полимеразной активности. Затем лигировали структуру шпильки-петли NEB Next Adaptor для подготовки к гибридизации после аденилирования 3'-конца фрагментов ДНК. 4) Получали фрагменты кДНК размером примерно от 250 до 300 п.о. и библиотеку очищали с использованием системы AMPure XP компании Beckman Coulter (Beckman Coulter, Беверли, Массачусетс). Затем наносили 3 мл фермента NEBU SER (Thermo Fisher, Хиллсборо, Орегон) с кДНК выбранного размера, лигированной с адаптером, при 37 градусах Цельсия в течение 15 минут, а затем в течение 5 минут при 95 градусах. ПЦР-амплификацию проводили с использованием ДНК-полимеразы Phusion High-Fidelity. В завершение продукты ПЦР очищали (система AMPure XP) и оценивали качество библиотеки с помощью системы Agilent Bioanalyzer 2100. Кластеризацию образцов с индексным кодированием проводили с помощью TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS (Illumina, Сан-Диего, Калифорния). Затем секвенирование было выполнено на платформе Illumina Novaseq и были получены парные считывания длиной 150 п.н. Файлы аннотаций эталонного генома и модели гена были загружены с веб-сайта генома (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release- 98/fasta/gallus_gallus/ и ftp://ftp. ensembl.org/pub/re-lease-98/gtf/gallus_gallus/). Индекс эталонного генома был установлен с использованием HISAT2 (v2.0.5), и чистые чтения парных концов были сопоставлены с эталонным геномом. Количество чтений, сопоставленных с каждым геном, и количество фрагментов на килобаз на миллион (FPKM) для каждого гена в зависимости от длины гена и количества чтений, сопоставленных с геном, были рассчитаны с использованием Feature Counts v1.5.{{38} }р3. Дифференциальную экспрессию между группой H (вакцина G70 +) и группой C (вакцина) получали с использованием пакета DESeq2 R (1.16.1). Гены с P < 0,05 и |log2 (кратное изменение)| > 1 были определены как гены дифференциальной экспрессии (DEG).

Таблица 3. Последовательности праймеров для RT-qPCR.

Количественная ПЦР-проверка в реальном времени 

Два DEG с повышенным уровнем экспрессии и 4 DEG с пониженным уровнем экспрессии при сравнении группы H (вакцина G70 +) и группы C (вакцина) были выбраны для подтверждения результатов секвенирования транскриптома с помощью RT-qPCR. РНК конвертировали в кДНК с использованием PrimeScript RT Master Mix (Takara) на термоциклере T100 (Bio-Rad). Последовательности праймеров приведены в таблице 3. В качестве гена внутреннего контроля использовали куриный b-актин. RT-qPCR выбранных генов проводили на системе множественной ПЦР в реальном времени (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния) с использованием SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Takara). Относительный количественный метод (244CT) был применен для оценки изменений в количественном определении. Все образцы были взяты для анализа в трех экземплярах.

Статистический анализ

Однофакторный дисперсионный анализ с апостериорным критерием Дункана использовали для множественных сравнений между группами с использованием программного обеспечения SPSS (версия 21.0, SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс). Данные выражены как среднее значение § SE. Значение P < 0,05 считалось статистически значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ Влияние b-глюкана на титры сывороточных антител.

Как показано на фигуре 1, титры HI, специфичные для NDV, снижались во всех группах до вакцинации и увеличивались в группах H (G70+вакцина) и C (вакцина) после иммунизации. Интересно, что более высокие титры HI наблюдались в группе H (G70+вакцина) при 21 (P > 0.05), 28 (P < 0.{{ 14}}5), 35 (Р > 0,05) и 42 (Р > 0,05) дня возраста, чем в группе С (Вакцина).

Влияние b-глюкана на пролиферацию лимфоцитов

Влияние G70 на пролиферацию лимфоцитов периферической крови показано на рисунке 2А. SI в лимфоцитах крови был повышен у птиц, получавших G70 (вакцина G70 +) через 7 дней (P <0,05) ревакцинации по сравнению с группой, получавшей вакцину. Кроме того, SI в лимфоцитах тощей кишки был значительно увеличен через 7 дней (P <0,05) после бустерной иммунизации по сравнению с группой вакцинации (рис. 2B).

Влияние b-глюкана на соотношение CD4 +/CD8 + Т-клеток в периферической крови 

На рисунках 3A и 3B показано гейтирование лимфоцитов и клеток CD3 +, а на рисунках 3C–3E показано соотношение Т-клеток CD4 +/CD8 + в G70, группы вакцины и физиологического раствора соответственно. Как показано на рисунке 3F, не было заметной разницы между группой вакцины и группой физиологического раствора после повторной иммунизации (P > 0,05), тогда как доля CD4 +/CD{{12} } Уровень Т-клеток был явно выше в группе G70 (вакцина G70 +), чем в группе вакцины (P <0,05).

Рисунок 1. Влияние перорального введения b-глюкана на титры сывороточных антител к вакцине NDV. Данные выражены как среднее значение § SE.

Родственная экспрессия генов

Как показано на рисунке 4, значительно увеличилась экспрессия мРНК TGF-b (P < 0.05), IL-6 (P < 0.{{13} }5), а TLR5 (P <0.05) был обнаружен в селезенке цыплят, обработанных G70 (вакцина G70 +), по сравнению с группой вакцины. Не было обнаружено существенных различий в экспрессии мРНК IFN-g (P > 0,05), TLR4 (P > 0,05) и TLR3 (P > 0,05) в селезенке между вакциной G70 (вакцина G70 +) и вакциной. группы.

Анализ данных секвенирования РНК 

Секвенирование РНК из 8 библиотек селезенки дало 24,1 Г необработанных данных, как представлено в таблице S1 дополнительного материала. CN означает вакцину группы, а HN означает вакцину группы G70 +. Библиотека C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 и H4 соответственно состоит из 45 591 492, 47 424 782, 46 193 492, 54 403 376, 47 118 476, 45 899 262, 45 841 884 и 45 504,43. 8 оригинальных прочтений. После аптамера были удалены неоднозначные последовательности и последовательности низкого качества, в результате чего осталось 44 050 198, 45 449 884, 44 261 112, 52 097 846, 45 542 404, 44 566 290, 44 113 172 и 44 026 960 чистых прочтений. Более 96% чистых чтений были среди исходных чтений, а 8 библиотек были сопоставлены с использованием HISAT2 для секвенирования чтений со справочной базой данных, состоящей из генома Gallus. Кроме того, чистые чтения были сопоставлены с этой базой данных более чем в 95% случаев. Конкретно для библиотек из C1, C2, C3, C4, H1, H2, H3 и H4 были 40 921 384 (92,9%), 41 302 100 (90,87%), 40 771 075 (92,11%), 46 905 784 (90,03%), 42 444 112 (93,2). %), 40 213 444 (90,23%), 40 922 895 (92,77%) и 40 971 972 (93,06%) прочтений были однозначно присвоены эталонной базе данных соответственно.

Дифференциально экспрессируемые гены

Как показано на рисунке 5А, всего было идентифицировано 198 дифференциально экспрессируемых генов, включая 47 генов с повышающей регуляцией и 151 ген с понижающей регуляцией. ДЭГ были подробно описаны в дополнительном материале, Таблица S2. Рисунок 5B показывает, что ДЭГ имеют хорошую воспроизводимость обработок.

Анализ классификации онтологии генов и Киотской энциклопедии генов и обогащения геномов

Гены, которые представляют собой дифференциально экспрессируемые гены, были разделены на 3 основные функциональные категории на основе системы классификации Gene Ontology (GO): биологический процесс, клеточный компонент и молекулярная функция. Топ-10 терминов ГО в трех категориях представлены на рисунке 6. Преобладали гены, участвующие в «ответе на гуморальный иммунный ответ», «хемокиновом ответе», «ответе на антимикробные гуморальные препараты», «защитном ответе против бактерии», «ответе на антимикробные гуморальные препараты». «иммунный ответ на противомикробную реакцию, опосредованную антимикробными пептидами», «защитный ответ против грамотрицательных бактерий» и «защитный ответ против грамположительных бактерий» в категории биологических процессов. Кроме того, в категории молекулярных функций значительное соотношение генов было связано со «связыванием хемокинового рецептора хемокинового рецептора (CCR) мотива CC», «связыванием хемокинового рецептора» и «связыванием липополисахарида». Более того, «митохондриальный комплекс дыхательной цепи I», «комплекс НАДН-дегидрогеназы» и «дыхательная цепь» были наиболее доминирующими терминами в категории клеточных компонентов. Киотская энциклопедия генов и геномов анализ путей также проводился на дифференциально экспрессируемых генах. Результаты показали, что гены в основном сгруппированы в 7 путей, включая «взаимодействие нейроактивного лиганда и рецептора», «щелевые соединения», «сигнальный путь митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK),» «переносчики ABC», «биосинтез аминокислот» и «биосинтез аминокислот». «Метаболизм лекарств» и «Экспорт белка».

Рисунок 2. Влияние перорального введения b-глюкана на индекс стимуляции лимфоцитов (SI). (А) Лимфоциты периферической крови; (Б) лимфоциты кишечника. Данные выражены как среднее значение § SE.

Рисунок 3. Влияние перорального введения b-глюкана на соотношение CD4+/CD8+ клеток периферической крови. (А) Ворота на лимфоцитах; (B) ворота на CD3+ Т-клетках; (C) частоты CD3+ CD4 + CD8 + Т-клеток в группе вакцин G70+; (D) частоты CD3+ CD4 + CD8 + Т-клеток в группе вакцин; (E) частоты CD3+ CD4 + CD8 + Т-клеток в группе физиологического раствора; (F) бардиаграмма, показывающая соотношение CD4+/CD8+. Данные выражены как среднее значение § SE.

Рисунок 4. Влияние перорального введения b-глюкана на экспрессию мРНК в куриной селезенке. Данные выражены как среднее значение § SE.

Рисунок 5. Сводка данных RNA-Seq. (A) Список дифференциально экспрессируемых генов, (B) карта кластеризации DEG.

Проверка генов, дифференциально экспрессируемых с помощью RT-qPCR

6 ДЭГ, активность которых была повышена или понижена, были подтверждены количественной ПЦР в реальном времени. Результат показал, что данные RT-qPCR в целом соответствовали данным секвенирования РНК, что указывает на надежный результат секвенирования (рис. 7). Экспрессия мРНК генов, связанных с путем MAPK. Как показано на рисунке 8, значительно снизилась экспрессия мРНК FAS (P < 0.05) и CACNA2 (P < 0.05). обнаружен в селезенке цыплят в группе G70 (вакцина G70 +) по сравнению с группой вакцины. Кроме того, в группе G70 (вакцина G70 +) по сравнению с группой вакцины было обнаружено численное увеличение экспрессии мРНК DUSP5 и DUSP4 и численное снижение экспрессии мРНК p38, JNK и ERK (P > 0,05). .

ОБСУЖДЕНИЕ

Живая вакцина против болезни Ньюкасла широко прививается на птицефермах, однако в стадах иммунизированной птицы все еще наблюдаются спорадические вспышки болезни Ньюкасла (Zhang et al., 2022). Определены оптимальные вакцины, стимулирующие клеточный и мукозальный иммунитет, а также эффективный гуморальный иммунитет (Shan et al., 2019). Поэтому все больше и больше внимания уделяется адъювантам, которые могут вызывать как слизистые, так и клеточные иммунные реакции (Chen et al., 2014; Yu et al., 2015). По сравнению с инъекционным путем пероральное введение является более простым подходом, который снижает затраты и вызывает меньший стресс у цыплят-бройлеров (Boyaka et al., 2003; Zhang et al., 2008). Результаты этого исследования показали, что диета с добавлением b-глюкана заметно повышала уровень титров HI, специфичных для NDV, в сыворотке кур, что согласуется с предыдущими сообщениями (Horst et al., 2019). NDV-специфическое антитело необходимо для развития гуморального иммунного ответа для защиты цыплят от инфекции NDV (Martinez et al., 2018; Li et al., 2020). В-лимфоциты вырабатывают антитела, а Т-лимфоциты увеличиваются в размерах в ответ на митоген (Bohacova et al., 2021). В настоящем исследовании индекс стимуляции лимфоцитов периферической крови кур к NDV в группе G70 был явно выше, чем в группе вакцины, что указывает на активацию большего количества Т-лимфоцитов. Преобладающими субпопуляциями Т-лимфоцитов являются Т-клетки CD4 + и CD8 + (Cui et al., 2020). Т-клетки CD4 + в основном продуцируют цитокины и способствуют созреванию В-клеток, тогда как Т-клетки CD8 + связаны с уничтожением клеток-мишеней (Zhang et al., 2021b). В этом исследовании соотношение CD4 +/CD8 + Т-клеток, обнаруженных в группе G70, явно увеличивалось, что позволяет предположить, что G70 может активировать больше CD4 + Т-клеток из периферической крови. Кроме того, мы наблюдали значительно более высокий индекс стимуляции кишечных лимфоцитов в группе G70, чем в группе вакцины, что подтвердило, что b-глюкан также может стимулировать кишечные лимфоциты. Наши предыдущие эксперименты подтвердили, что экстракт стенки дрожжевых клеток PW220 значительно увеличивает количество кишечноспецифичных sIgA и IgA + клеток (Bi et al., 2020). То есть и b-глюкан G70, и PW220 эффективны в повышении иммунитета слизистой оболочки кишечника.

Польза цистанхе для мужчин – укрепление иммунной системы

Ранее сообщалось об улучшении иммунитета животных при введении b-глюкана. Го и др. (2003) подтвердили, что введение b-глюкана улучшало показатель бурсы и NDV-специфических антител у цыплят. Левин и др. (2018) предположили, что добавки b-глюкана могут повышать уровень MHC Ⅱ кишечника и увеличивать количество клеток CD45 +, чтобы облегчить повреждение кишечника.

Ли и др. (2005) выявили, что пищевой b-глюкан может повышать уровни экспрессии мРНК IL-8 и TGF-b в кишечном тракте свиней. Механизм иммуномодулирующего действия b-глюкана не ясен. Ким и др. (2010) показали, что b-глюкан способствует созреванию дендритных клеток путем повышения экспрессии CD40, CD80 и CD86. Кроме того, Ли и Ким (2014) и Су и др. (2020) сообщили, что b-глюкан активирует рецепторы распознавания образов, такие как рецептор дектина-1, Toll-подобный рецептор и CR3 (Baert et al., 2015). Селезенка является важнейшим органом для инициации иммунного ответа и играет важную роль как во врожденном, так и в приобретенном иммунитете (Bronte and Pittet, 2013). Однако существует лишь небольшое количество исследований, основанных на секвенировании РНК-анализа экспрессии мРНК в селезенке после перорального введения дрожжевых полисахаридов. В настоящем исследовании анализ путей Киотской энциклопедии генов и геномов показал, что эти гены в основном сгруппированы в два пути, включая «взаимодействие нейроактивного лиганда и рецептора» и «сигнальный путь MAPK». Рецепторы распознавания образов, нацеленные на b-глюкан, были сосредоточены на поверхности иммунных клеток (Goodridge et al., 2009). После распознавания b-глюкана эти рецепторы стимулировали тирозинкиназу и ядерный фактор каппаВ (NF-каппаВ), что приводило к индукции секреции провоспалительных цитокинов и активации иммунных ответов (Kankkunen et al., 2010; Masuda et al. ., 2012; Сюй и др., 2016; Боде и др., 2019). МАРК, как семейство серин-треониновых протеинкиназ, играет решающую роль в воспалении и выработке цитокинов у кур. Бьюн и др. (2016) продемонстрировали, что b-глюкан увеличивает выработку интерферона-g и интерлейкина-2 и запускает значительно более высокие уровни фосфорилирования MAPK p38 в перитонеальных макрофагах. Ван и др. (2014) сообщили, что b-глюкан ослабляет воспалительные реакции в клетках THP-1, ингибируя активацию p38 MAPK. В этом исследовании 13 DEG, включая DUSP4, CACNA2D1, PDGFD, PTPRR, ENSGALG00000006351, FAS, MAP2K3, MYC, DUSP5, MAX, SRF, PRKCB и EGFR, были идентифицированы в сигнальном пути MAPK, что позволяет предположить, что b-глюкан может регулировать иммунный ответ. селезенки через МАРК у кур. МАРК представляет собой консервативный класс киназ Ser/Thr в клетках, которые в основном участвуют в клеточных реакциях, таких как иммунный ответ, апоптоз и пролиферация. Семейство MAPK включает как минимум 3 подсемейства: N-концевую киназу c-Jun (JNK), p38 MAPK и киназу, регулируемую внеклеточными сигналами (ERK) (Hong et al., 2020; Zhang et al., 2021a). DUSP4 и DUSP5 представляют собой фосфатазы двойной специфичности, которые специфически ингибируют активность членов семейства MAPK, таких как p38, JNK и ERK, играя важную регуляторную роль в предотвращении чрезмерной воспалительной реакции и способствуя регрессу воспаления в организме (Imasato et al. ., 2002; Талрея и др., 2021). Кроме того, сообщалось, что небольшая некодирующая РНК под названием gga-miR-200a-3p подавляет экспрессию провоспалительных факторов и, таким образом, регулирует аутоиммунный ответ хозяина, отрицательно регулируя путь MAPK. и его нижестоящие сигнальные молекулы (Pham et al., 2017). В настоящем исследовании анализ RT-qPCR показал, что экспрессия мРНК P38, JNK и ERK снизилась, а экспрессия мРНК DUSP4 и DUSP5 увеличилась у цыплят, которых кормили b-глюканом (G70). Эти результаты позволяют предположить, что иммуноукрепляющее действие b-глюкана (G70) на вакцину против болезни Ньюкасла может быть связано с регуляцией провоспалительных факторов по принципу отрицательной обратной связи, опосредованной МАРК. Кроме того, ФАС является важным веществом, которое опосредует апоптоз и жизненно важно для иммунного гомеостаза (Krueger et al., 2003; Guegan and Legembre, 2018). Между тем, CACNA2 представляет собой субъединицу потенциал-зависимого кальциевого канала, которая оказывает стимулирующее воздействие на пролиферацию, миграцию и инвазию клеток (Sun et al., 2020). В этом исследовании FAS и CACNA2 были значительно снижены у цыплят, получавших b-глюкан (G70), что указывает на то, что b-глюкан (G70) оказывает иммуностимулирующее действие, главным образом, путем ингибирования апоптоза иммунных клеток и балансирования аутоиммунитета. Эти результаты обеспечивают теоретическую основу для использования b-глюкана (G70) в качестве усилителя иммунитета в клинических условиях. Однако механизм усиления иммунного ответа b-глюканом за счет эффекта отрицательной обратной связи пути МАРК нуждается в дальнейшем доказательстве. Интересно отметить, что гены, кодирующие кателицидин, включающие CATH3, CATH1, CATH2, и гены, кодирующие b-дефенсин, включая AvBD6, AvBD7, AvBD1 и AvBD4, были заметно снижены в сравнении H (вакцина группы G70 +). против контроля (групповая вакцина). Пептиды защиты хозяина (HDP) представляют собой эффекторные молекулы, играющие решающую роль во врожденной иммунной системе (Cuperus et al., 2013). Эти пептиды были обнаружены у различных видов животных, от млекопитающих до птиц. У кур имеется 4 кателицидина, состоящих из CATH1, CATH2, CATH3 и CATHB1, которые эффективно убивают различные бактерии (Hamad et al., 2017). Птичьи бета-дефенсины (AvBD), также называемые галлиновыми, представляют собой небольшие катионные пептиды с тремя цистеиндисульфидными связями между цистеиновыми остатками и играют важную роль во врожденной иммунной системе (Yoshimura, 2015). Снижение экспрессии кателицидинов и бета-дефензина, возможно, объяснялось регуляцией по принципу обратной связи, при которой популяции бактерий и парабактерий уменьшались за счет полисахаридов клеточной стенки дрожжей (Bi et al., 2020). Подобные результаты были получены и в других исследованиях. Шао и др. (2016) показали, что добавление дрожжевого b-глюкана цыплятам-бройлерам подавляет инфекцию сальмонеллы и снижает экспрессию HDP с помощью количественного ПЦР-анализа в реальном времени. В этом исследовании продукт G70, состоящий в основном из b-глюкана, повышал уровень NDV-специфических антител в сыворотке, увеличивал индекс стимуляции NDV лимфоцитов периферической крови и кишечных лимфоцитов и способствовал дифференцировке Т-лимфоцитов периферической крови в CD{{ 123}} Т-клетки. Кроме того, анализ RNA-seq показал, что G70 усиливает экспрессию мРНК, связанную с G-белком, связанным с рецептором серотонина и полипептидом MHC класса I, и подавляет экспрессию мРНК, связанную с кателицидином и бета-дефенсином. Учитывая усиленное воздействие G70 на вакцину против болезни Ньюкасла у кур, можно дополнительно изучить влияние G70 на другие вакцины для домашней птицы, такие как вакцина против птичьего гриппа.

Рисунок 6. Анализ пути KEGG.

Рисунок 7. Подтверждение RT-qPCR выбранных кандидатов DEG. Данные выражены как среднее значение § SE.

Рисунок 8. Относительная экспрессия мРНК в селезенке. Тотальную РНК экстрагировали из селезенки. Куриный b-актин служил геном внутреннего контроля. Данные выражены как среднее значение § SE.

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

Баерт К., Э. Сонк, Б. М. Годдерис, Б. Девриендт и Э. Кокс. 2015. Специфические для типов клеток различия в распознавании и передаче сигналов b-глюкана в клетках врожденного иммунитета свиней. Дев. Комп. Иммунол. 48:192–203.

Болл, К., А. Форрестер, А. Херрманн, С. Лемьер и К. Ганапати. 2019. Сравнительный защитный иммунитет, обеспечиваемый живыми вакцинами вируса болезни Ньюкасла или птичьего метапневмовируса при совместном введении однодневным цыплятам-бройлерам вместе с классическими и вариантными штаммами вируса инфекционного бронхита. Вакцина. 37:7566–7575.

Би, С., Дж. Чжан, Ю. Цюй, Б. Чжоу, X. Хэ и Дж. Ни. 2020. Продукт стенки дрожжевых клеток усиливал реакцию IgA кишечника и изменял виды микрофлоры слепой кишки после пероральной вакцинации кур. Поулт. наук. 99:6576–6585.

Би, С., Дж. Чжан, Л. Чжан, К. Хуан, Дж. Ли и Л. Цао. 2022. Стенка дрожжевых клеток активировала клеточно-опосредованный иммунный ответ на вакцину против вируса болезни Ньюкасла. Поулт. наук. 101:101712–101721.

Боде, К., Ф. Бужупи, К. Линк, Т. Хейн, С. Циммерманн, Д. Пейрис, В. Жаке, Б. Лепенис, Х. Вейд и П. Х. Краммер. 2019. Связывание дектина-1 с аннексинами на апоптотических клетках индуцирует периферическую иммунную толерантность посредством НАДФН-оксидазы-2. Клетка. Отчет 29: 4435–4446.

Бохакова П., Й. Коссл, М. Хайкова, Б. Германкова, В. Холан и Э. Яворкова. 2021. Разница между митоген-стимулированными В- и Т-клетками в неспецифическом связывании антител, конъюгированных с R-фикоэритрином. Дж. Иммунол. Методы. 493:113013–113023.

Бояка, П.Н., А. Тафаро, Р. Фишер, К. Фудзихаши, Э. Джирилло и Дж. Р. МакГи. 2003. Терапевтические манипуляции иммунной системы: усиление врожденного и адаптивного иммунитета слизистой оболочки. Курс. Фарм. Дизайн. 9: 1965–1972.

Бронте В. и М. Дж. Питтет. 2013. Селезенка в местной и системной регуляции иммунитета. Иммунитет. 39:806–818.

Бьюн Э., С. Пак, Б. Чан, Н. Сон и Э. Бюн. 2016. Облученный гамма-излучением b-глюкан индуцирует иммуномодуляцию и противораковую активность через пути MAPK и NF-kB. Дж. Наук. Еда. Агр. 96:695–702.

Чен, С., С. Чен, С. Цю, Ю. Ху, К. Цзян, Д. Ван, Ц. Фань, К. Чжан, Ю. Хуан, Ю. Ю, Х. Ян, К. Лю, Z Гао, Р. Хоу и С. Ли. 2014. Влияние пероральной жидкости эпимедиум полисахарид-прополис-флавон на иммунитет слизистых оболочек у кур. Межд. Ж. Биол. Макромол. 64:6–10.

Цуй С., Ю. Ван, Р. Гуань, М. Лу, Л. Юань, В. Сюй и С. Ху. 2020. Усиление иммунного ответа с помощью протеомного анализа сыворотки овец Ху на вакцину против ящура, эмульгированную в адъюванте растительного масла. Вакцина. 8: 180–197

Куперус Т., М. Куренс, А. ван Дейк и Х. П. Хаагсман. 2013. Птичьи защитные пептиды хозяина. Дев. Комп. Иммунол. 41:352–369.

Гудридж, Х.С., Эй.Дж. Вольф и Д.М. Андерхилл. 2009. Распознавание бета-глюкана врожденной иммунной системой. Иммунол. Откр. 230:38–50.

Геган Дж. и П. Легембре. 2018. Неапоптотические функции Fas/CD95 в иммунном ответе. ФЕВС Дж. 285: 809–827.

Го Ю., Р.А. Али и М.А. Куреши. 2003. Влияние бета-глюкана на иммунные реакции у цыплят-бройлеров. Иммунофарм. Иммунол. 25: 461–472.

Хамад, С.К., С. Ким, С.В. Эль-Кади, Э.А. Вонг и Р.А. Даллул. 2017. Сравнительная экспрессия пептидов защиты хозяина у индюшат. Поулт. наук. 96:2083–2090.

Хастед Т., С. Шариф, П. Бурлин и М. С. Диарра. 2021. Иммуностимулирующий потенциал плодов и их экстрактов у птицы. Передний. Иммунол. 12:641696.

Хонг, Ю., Дж. Ли, Т.Х. Ву, С. Ли, Х.С. Лиллехой и Ю.Х. Хонг. 2020. Куриный птичий b-дефенсин 8 модулирует иммунный ответ через митоген-активируемые сигнальные пути протеинкиназы в клеточной линии куриных макрофагов. Поулт. наук. 99:4174–4182.

Хорст Г., Р. Левин, Р. Чик и К. Хофакр. 2019. Влияние бета- 1,3-глюкана (AletaTM) на реакцию на вакцинацию у цыплят-бройлеров. Поулт. наук. 98: 1643–1647.

Имасато А., К. Дебуа-Мутон, Дж. Хан, Х. Кай, ACB Cato, С. Акира и Дж. Ли. 2002. Ингибирование p38 MAPK глюкокортикоидами посредством индукции фосфатазы MAPK-1 усиливает нетипируемую экспрессию Toll-подобного рецептора, индуцированную влиянием Haemophilus 2. J. Biol. хим. 277:47444–47450.

Канккунен П., Л. Тейрилья, Дж. Ринтахака, Х. Алениус, Х. Вольф и С. Матикайнен. 2010. (1,3)-бета-глюканы активируют как дектин-1, так и воспаление NLRP3 в макрофагах человека. Дж. Иммунол. 184:6335–6342.

Ким, Х.С., Дж.И. Ким, Х.К. Ли, М.С. Ким, С.Р. Ли, Дж.С. Канг, Х.М. Ким, К. Ли, Дж. Т. Хонг, Ю. Ким и С. Хан. 2010. Активация дендритных клеток глюканом, выделенным из umbilicaria esculenta. Иммунитет. Сеть. 10:188–197.

Крюгер А., С.К. Фас, С. Бауманн и П.Х. Краммер. 2003. Роль CD95 в регуляции апоптоза периферических Т-клеток. Иммунол. Откр. 193:58–69.