Потеря JAK1 приводит к врожденному иммунодефициту

Сигнальный путь Янус-киназа — преобразователи сигнала и активаторы транскрипции (JAK-STAT) имеет решающее значение в настройке иммунных ответов, а его нарушение регуляции тесно связано с раком и иммунными нарушениями. Нарушение сигнального пути интерлейкина (IL)-15/STAT5 из-за потери цепей рецепторов IL-15, JAK3 или STAT5, приводит к иммунодефициту с аномалиями естественных клеток-киллеров (NK). JAK1 вместе с JAK3 передает сигналы ниже IL-15, но точный вклад JAK1 в биологию NK-клеток еще предстоит выяснить. Для изучения последствий дефицита JAK1 в NK-клетках мы создали мышей с условной делецией JAK1 в NKp46+-клетках (Jak1fl/flNcr1Cre). Здесь мы показываем, что удаление внутреннего JAK1 NK-клеток значительно снижает количество NK-клеток в костном мозге и нарушает их развитие. В свою очередь, мы наблюдали почти полную потерю NK-клеток в селезенке, крови и печени, что доказывает решающую роль JAK1 в периферических NK-клетках. В свою очередь, у мышей Jak1fl/+Ncr1Cre наблюдалось значительное нарушение наблюдения за опухолями, опосредованными NK-клетками. Наши данные свидетельствуют о том, что JAK2 не способен компенсировать потерю JAK1 в NK-клетках. Важно отметить, что условная делеция JAK2 в клетках NKp46+ не оказывала влияния на периферические NK-клетки, показывая, что собственный JAK2 NK-клеток необязателен для выживания NK-клеток. Таким образом, мы определили, что потеря JAK1 в NK-клетках приводит к врожденному иммунодефициту, тогда как дефицит JAK2 оставляет количество и созревание NK-клеток неизменными. Таким образом, мы предполагаем, что в отличие от используемых в настоящее время ингибиторов JAK1/JAK2, использование специфических ингибиторов JAK2- будет выгодно для пациентов, поскольку NK-клетки останутся нетронутыми.

Ключевые слова: JAK-STAT, естественные клетки-киллеры, JAK1, JAK2, надзор за опухолями.

Преимущества цистанхе тубулозной-противоопухолевой

ВВЕДЕНИЕ

Естественные киллеры (NK) – это врожденные лимфоциты, которые распознают и уничтожают инфицированные вирусом или трансформированные клетки (1). Дефицит NK-клеток является редким, но все более распространенным подтипом первичного иммунодефицита (ПИД). Классический дефицит NK-клеток характеризуется отсутствием NK-клеток в периферической крови и приводит к повышенной восприимчивости к вирусным инфекциям (2). Янус-киназа (JAK) — сигнальный путь преобразователя и активатора транскрипции (STAT) действует ниже множества цитокинов, факторов роста и гормонов, тем самым критически регулируя иммунные ответы (3, 4). При связывании специфического лиганда с родственным ему рецептором конформационные изменения приводят к олигомеризации рецептора и активации связанных с рецептором JAK. JAK ауто- и транс-фосфорилируют друг друга и фосфорилируют цепи рецепторов, обеспечивая места стыковки для молекул STAT. Затем STAT подвергаются JAK-опосредованному фосфорилированию, димеризации и транслокации в ядро, где они регулируют транскрипцию генов-мишеней (5). JAK3 и STAT5 играют решающую роль в передаче сигнала после цитокинов, которые используют рецептор c (6). Мутации «потери функции» (LOF) в генах, кодирующих JAK3 (7) или STAT5B (8), приводят к ПИД с аномалиями NK-клеток, что подчеркивает важность этого пути для врожденных лимфоцитов. Иммунодефицит этих пациентов объясняется нарушением реакций IL-7 и IL-15 (6). Важно отметить, что JAK1 играет доминирующую роль по сравнению с JAK3 в активации STAT5 ниже c-содержащих цитокиновых рецепторов (9). Интересно предположить, что LOF-мутации JAK1 также могут приводить к ВЗОМТ. На сегодняшний день был выявлен только один пациент с мутациями зародышевой линии JAK1, у которого JAK1 был снижен, но не отсутствовал, и действительно имел иммуносупрессию (10). У мышей полная потеря JAK1 приводит к перинатальной летальности, а у новорожденных мышей наблюдается сильное снижение количества тимоцитов и В-клеток (11). Эти наблюдения были подтверждены на взрослых мышах: индуцируемая делеция JAK1 приводит к нарушению гомеостаза гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и заметно снижает частоту В-клеток и субпопуляции B220+CD11c+NK1.1+ NK-клетки (12). Однако на сегодняшний день ни одно исследование не анализировало непосредственно влияние потери JAK1 на обычные NK-клетки.

Цистанхе пустынная ма-Поддержание печени

Первые сведения о вкладе JAK1 в биологию NK-клеток получены в результате исследований с использованием ингибиторов JAK — одобренных препаратов для лечения рака и аутоиммунных заболеваний (13). И у мышей, и у пациентов, получавших ингибитор JAK1/JAK2 руксолитиниб, наблюдалось снижение количества NK-клеток, нарушение их созревания и функции (14, 15). Поскольку JAK2 также участвует в дифференцировке NK-клеток (14, 16), еще предстоит выяснить, какая из двух киназ ответственна за наблюдаемые эффекты лечения руксолитинибом. Используя мышей с нокаутом Jak1 или Jak2 в клетках NKp46+, мы показываем, что JAK2 необходим для выживания NK-клеток. Напротив, делеция JAK1 в зрелых NK-клетках приводит к дефициту NK-клеток, а потери одного аллеля Jak1 достаточно, чтобы нарушить контроль роста опухоли. Таким образом, мы определили JAK1 как ключевой фактор для зрелых NK-клеток и создали мышиную модель классической недостаточности NK-клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Мыши и клеточные линии

Jak1fl/fl (C57BL/6N-Jak1tm1c(EUCOMM)Hmgu/H; были любезно предоставлены доктором Александром Доналом (CCRI, Вена, Австрия). Аллель Jak1tm1c мутанта была получена от мышей с первым аллелем, нокаутным по Jak1tm1a (описано Международным консорциумом фенотипирования мышей https://www.mousephenotype.org) путем удаления кассеты lacZ-neo посредством Flp-рекомбинации.

Условный потенциал мышей Jak1fl/fl активировали посредством Cre-рекомбинации и вырезания loxP-фланкированного экзона 3 Jak1. Тканеспецифическую рекомбинацию индуцировали скрещиванием Jak1fl/fl или Jak2fl/fl [Jak2tm1Kuw; (17)] с B6NTg(Ncr1Cre); (18) мышей. Мыши Stat5fl/fl (19) и Stat5fl/flNcr1Cre (18) были описаны ранее. Мыши Jak1fl/fl, Ncr1Cre, Stat5fl/fl, Stat5fl/flNcr1Cre находились на фоне C57B6/N, а Jak2fl/fl находились на смешанном фоне. Экспериментальные животные были подобраны по возрасту (8–12 недель) и содержались в особых беспатогенных условиях в Университете ветеринарной медицины в Вене в соответствии с рекомендациями Федерации ассоциаций наук о лабораторных животных (FELASA) (2014). Эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике и защите животных Венского университета ветеринарной медицины и национальным органом власти (Австрийским федеральным министерством науки и исследований) в соответствии с §§ 26ff. Закона об экспериментах над животными, Tierversuchsgesetz 2012 — TVG 2012, по лицензиям BMWF-68.205/0218-II/3b/2012 и BMBWF-68.205/0174-V/3b /2018 и проводились в соответствии с рекомендациями FELASA и ARRIVE. На протяжении всей статьи Jak1WT относится к объединенным данным от мышей Jak1fl/+ и Jak1fl/fl. Клеточные линии мышиной лимфомы RMA-Rae1 [любезно предоставлены профессором А. Червенкой; (20)] и YAC-1 культивировали в полной среде RPMI1640 (Sigma), содержащей 10% FCS (Bio & Sell), 100 ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина (Sigma) и 50 мкМ {{58) }}меркаптоэтанол (Sigma).

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Модель опухоли in vivo

Мышам Jak1fl/+ и Jak1fl/+Ncr1Cre инъецировали подкожно 106 клеток RMA-Rae1 в оба бока и контролировали рост опухоли через день. Через десять дней после инъекции мышей умерщвляли и определяли массу опухоли. Для проточно-цитометрического анализа NK-клеток, инфильтрирующих опухоль, опухоли разрезали на кусочки площадью ~5 мм2 и получали суспензию отдельных клеток с использованием GentMACSTM Octo Dissociator (MilteNY Biotec) с буфером для расщепления, содержащим коллагеназу D (1 мг/мл; Sigma Aldrich). и ДНКаза I (20 мг/мл; Roche).

Изоляция, расширение и стимуляция NK-клеток

NK-клетки выделяли из суспензий одноклеточных клеток селезенки с использованием меченных DX5- шариков MACS в соответствии с инструкциями производителя (MilteNY Biotec). NK-клетки размножали в полной среде RPMI1640, дополненной 5,000 ед/мл rhIL-2 (Пролейкин, Novartis) в течение 7 дней. Количество клеток CD3-NK1.1+ оценивали с помощью проточной цитометрии в дни 0, 3, 5 и 7. На 7 день клетки лизировали для вестерн-блот-анализа. Для анализа pSTAT5 106 спленоцитов стимулировали 50 нг/мл rmIL-15 (PeproTech) в течение 15 минут и клетки фиксировали в 2% PFA с последующей пермеабилизацией метанолом и регидратацией.

Анализ цитотоксичности NK-клеток

Для анализа цитотоксичности in vitro NK-клетки, отсортированные по DX5-MACS, размножали в течение 7 дней в IL-2, как описано выше, и смешивали в указанных соотношениях эффектор: целевое соотношение с сукцинимидиловым эфиром диацетата карбоксифлуоресцеина (CFSE, Molecular Probes , CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit), меченные клетки-мишени. После 4 часов инкубации при 37°C клетки окрашивали красителем мертвых клеток Sytox Blue (Thermo Fischer) и оценивали специфический лизис клеток-мишеней с помощью проточной цитометрии.

Проточной цитометрии

Одноклеточные суспензии готовили из селезенки, костного мозга или печени. Печень перфузировали через воротную вену 5–1 мл стерильного PBS. Разделение лимфоцитов осуществляли с использованием 37,5% персонального (GE Healthcare). Для анализа крови эритроциты лизировали с помощью лизирующего раствора BD FACS Lysing Solution в соответствии с протоколом производителя (BD Bioscience). Антитела (клоны), нацеленные на следующие белки, были приобретены у eBioscience: CD3 (17A2), CD3e (145-2C11), CD11b (M1/70), CD16/CD32 (93), CD19 (eBio1D3), CD27 (LG. 7F9), CD49b (DX5), CD122 (5H4), CD226 (10E5), Gr-1 (RB6-8C5), KLRG1 (2F1), Ly49A (A1), Ly49G2 (eBio4D11), NKG2A /C/E (20d5), NKG2D (CX5), NKp46 (29A1.4), NK1.1 (PK136) и Ter119 (TER-119). Антитела CD49a (Ha31/8) и pSTAT5 [47/Stat5(pY694)] были приобретены у BD Pharminogen, а pan-Rae1 (186107) — у R&D Systems. Общее количество клеток оценивали с помощью проточной цитометрии с использованием счетных шариков Count Bright Beads (Invitrogen). Эксперименты по проточной цитометрии проводились на BD FACSCanto II (BD Bioscience) или Cytoflex (Beckman Coulter) и анализировались с использованием программного обеспечения BD FACSDiva V8.0 (BD Bioscience), CytExpert (Beckman Coulter) или FlowJo V10 (FlowJo, LLC).

РИСУНОК 1|Потеря JAK1 в клетках NKp46+ приводит к практически полному отсутствию периферических NK-клеток. (A) Частота (левая панель) и общее количество (правая панель) NK-клеток Lin-(CD3-CD19-Ly-6G-Ter119-) CD122+ в костном мозге оценивались методом потока. цитометрия. (B) Клетки Lin-CD122+ костного мозга были далее разделены на предшественники NK (NKP: NKp46-NK1.1-), незрелые NK-клетки (iNK: NKp46-NK1.1+) и зрелые. NK-клетки (мНК: NKp46+NK1.1+). (C) Частоту CD3-NKp46+ NK-клеток в селезенке оценивали с помощью проточной цитометрии, и показаны репрезентативные графики. (D, E) Частота (левая панель) и общее количество (правая панель) NK-клеток CD3-NKp46+ в (D) селезенке и (E) крови оценивались с помощью проточной цитометрии. (F) Частота обычных NK-клеток (CD3-NK1.1+NKp46+CD49b+, левая панель) и клеток ILC1 (CD3-NK1.1+NKp46+CD49a+ , правая панель) анализировали в печени мышей Jak1WT, Jak1fl/+Ncr1Cre и Jak1fl/flNcr1Cre методом проточной цитометрии. (A, B, D–F) Гистограммы представляют среднее значение ± SEM для 1–2 независимых экспериментов; н=3–11. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0,001.

РИСУНОК 2|Остальные NK-клетки Jak1fl/flNcr1Cre демонстрируют незрелый фенотип. (A, B) NK-клетки CD3-NKp46+ селезенки анализировали на экспрессию CD27 и CD11b методом проточной цитометрии. (А) Показана частота клеток на каждой стадии созревания: DN (CD27-CD11b-), CD27 (CD{{10}}CD11b-), DP (CD27+CD11b+), CD11b (CD27-CD11b+). Общее количество клеток на каждой стадии созревания показано на рисунке S1C. (B) Показаны репрезентативные участки. (C) Клетки pSTAT5(Y694)+ анализировали в популяции CD3-NKp46+NK1.1+ ex vivo после 15-минутной стимуляции IL-15 методом проточной цитометрии. (D) CD3-NKp{{30}} NK-клетки селезенки анализировали на экспрессию указанных активирующих и ингибирующих рецепторов методом проточной цитометрии. Показан процент NK-клеток, положительных по каждому рецептору. Данные о средней интенсивности флуоресценции представлены на рисунке S1D. (A – D) Гистограммы и цифры на графиках представляют собой среднее значение ± SEM для 2 независимых экспериментов; н=5–8. **р <0,01, ***р <0,001.

Вестерн-блоттинг

Лизис клеток, SDS-PAGE и вестерн-блоттинг проводили, как описано ранее (21). Обнаружение хемилюминесценции проводили с использованием субстрата Clarity Western ECL (BioRad) и ChemiDocT XRS+ Molecular Imager (BioRad) и анализировали с помощью программного обеспечения Image Lab (BioRad). Использовали следующие антитела: анти-актин (C4, sc-47778) из Санта-Крус в качестве контроля нагрузки, анти-JAK2 (D2E12; #3230), анти-Перфорин (#3693) и анти-JAK1 (#3332). ) от Cell Signaling Technology.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Нажмите здесь, чтобы просмотреть продукты Cistanche Enhance Immunity

【Запросить дополнительную информацию】 Электронная почта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Статистический анализ

Непарные t-критерии или однофакторный дисперсионный анализ с пост-тестами Тьюки выполнялись с использованием GraphPad Prism версии 5.00 (GraphPad Software). Уровень значимости указан для каждого эксперимента (∗p < 0.05; ∗∗p < 0.01; ∗∗∗p < 0,001).

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Удаление JAK1 снижает количество NK-клеток и ILC1 в зависимости от дозы

Было показано, что ингибитор JAK1/JAK2 руксолитиниб снижает количество, созревание и функцию NK-клеток (14, 15). Чтобы сравнить и оценить вклад JAK1 и JAK2 в биологию NK-клеток, мы создали мышей с условной делецией JAK1 или JAK2 в клетках NKp46+. Таким образом, мы скрестили мышей Ncr1Cre (18) с мышами Jak1fl/fl или Jak2fl/fl [см. раздел «Материалы и методы» и (17)] соответственно. NK-клетки развиваются в костном мозге из предшественников NK-клеток (NKP), которые определяются как Lin-CD122+NK1.1-NKp46-. Они развиваются в незрелые NK-клетки (iNK), которые становятся NK1.1+, в то время как только зрелые NK-клетки (mNK) являются NK1.1+NKp46+ (22). Поскольку экспрессия рекомбиназы Cre у мышей Ncr1Cre управляется промотором NKp46, Cre-опосредованная делеция ограничивается NK-клетками. Мы наблюдали значительное снижение процентного содержания и общего количества NK-клеток костного мозга у мышей Jak1fl/flNcr1Cre (рис. 1А). NK-клетки Lin-CD122+ у мышей Jak1fl/flNcr1Cre показали повышенное процентное содержание предшественников NK-клеток (NKP) и незрелых NK-клеток, в то время как количество mNK было значительно снижено в костном мозге в соответствии с блокировкой развития iNK-клетки. стадия, предотвращающая переход на стадию клеток мНК (рис. 1Б). Удаление одного аллеля Jak1 привело к промежуточному количеству NK-клеток костного мозга (рис. 1А). Соответственно, развитие NK-клеток демонстрировало промежуточный фенотип, что указывает на влияние дозы гена Jak1 на развитие NK-клеток (рис. 1B). Блокада развития NK-клеток костного мозга привела к резкому уменьшению количества NK-клеток на периферии. Потеря JAK1 привела к почти полному дефициту NK-клеток селезенки и крови (рисунки 1C-E). В соответствии с эффектом дозировки гена Jak1, у мышей Jak1fl/+Ncr1Cre наблюдалось снижение процентного содержания NK-клеток и общего количества до 50% по сравнению с однопометными животными дикого типа в селезенке и крови (рис. 1C–E). Удаление нижестоящего эффектора JAK1 и транскрипционного фактора STAT5 в клетках NKp46+ также приводит к уменьшению количества зрелых NK-клеток (18). Прямое сравнение мышей Jak1fl/flNcr1Cre и Stat5fl/flNcr1Cre показало, что делеция JAK1 провоцирует еще более выраженный дефицит NK-клеток в селезенке и крови, чем делеция STAT5 (рисунки S1A, B). Врожденные лимфоциты печени NKp46+ включают две группы различных линий (23). Обычные NK-клетки (cNK) характеризуются экспрессией CD49b и свободно циркулируют, тогда как резидентные в печени врожденные лимфоциты 1-го типа (ILC1) характеризуются экспрессией CD49a и ограничены печенью (24). Подобно селезенке и крови, cNK печени и резидентные в тканях ILC1 были почти полностью удалены после потери JAK1 (рис. 1F). И снова удаление одного аллеля Jak1 привело к промежуточному количеству врожденных лимфоцитов печени (рис. 1F). Таким образом, эти результаты привели нас к выводу, что экспрессия JAK1 в клетках NKp46+ необходима для развития и поддержания NK-клеток в периферических органах дозозависимым образом.

JAK1 имеет решающее значение для созревания NK-клеток

На периферии NK-клетки проходят этапы созревания, которые характеризуются последовательной экспрессией поверхностных маркеров CD27 и CD11b (22). Одного аллеля Jak1 было достаточно для управления созреванием NK-клеток, поскольку мы не обнаружили каких-либо различий в процентном соотношении клеток на каждой стадии созревания между клетками Jak1WT и Jak1fl/+Ncr1Cre (рис. 2A, B). В оставшихся NK-клетках Jak1fl/flNcr1Cre наблюдалось увеличение незрелой популяции (CD27+CD11b-) и уменьшение зрелой популяции CD27-CD11b+ (рис. 2A, B и рис. S1C). Этот результат предполагает, что оставшиеся клетки, возможно, просто потеряли JAK1 и не получили достаточного количества сигналов IL-15 для полного созревания. Действительно, оставшиеся NK-клетки Jak1fl/flNcr1Cre показали снижение фосфорилирования STAT5 ex vivo при кратковременной стимуляции IL-15 (рис. 2C). Активность NK-клеток контролируется балансом между активирующими и ингибирующими рецепторами. Удаление ни одного, ни обоих аллелей Jak1 не повлияло на процент NK-клеток, экспрессирующих следующие активирующие и ингибирующие рецепторы: KLRG1, NKG2D, NKG2A/C/E и Ly49A (рис. 2D). Наиболее заметным различием было небольшое снижение количества NK-клеток Ly49G2+ и увеличение количества NK-клеток DNAM-1+ у мышей Jak1fl/flNcr1Cre (рис. 2D). Аналогично, не было обнаружено грубых различий в уровне экспрессии (MFI) каждого рецептора, помимо увеличения MFI DNAM1 и Ly49G2 (рисунок S1D). Помимо своей роли активирующего рецептора, экспрессия DNAM- 1 отмечает этап развития; Клетки DNAM-1+ дают начало клеткам DNAM-1- (25). Мы пришли к выводу, что изменения в ДНКАМ-1+ отражают блок созревания NK-клеток Jak1fl/flNcr1Cre.

РИСУНОК 3|JAK2 необходим для выживания и созревания NK-клеток. (A) Частоту (левая панель) и общее количество (правая панель) CD3-NKp46+ NK-клеток в селезенке мышей Jak2WT и Jak2fl/flNcr1Cre оценивали с помощью проточной цитометрии. (B) NK-клетки CD3-NKp46+ селезенки анализировали на экспрессию CD27 и CD11b методом проточной цитометрии. Показана частота клеток на каждой стадии созревания: DN (CD27-CD11b-), CD27 (CD27+CD11b-), DP (CD27+CD11b+), CD11b (CD27-CD11b+). (C) Экспрессию JAK2 и -актина анализировали с помощью вестерн-блоттинга в NK-клетках после 6 дней экспансии IL-2. Сканирование полных блотов доступно в дополнительных материалах. (A,B) Гистограммы представляют среднее значение ± SEM для 2–3 независимых экспериментов; п=5–12.

РИСУНОК 4|Потеря одного аллеля Jak1 ухудшает активность NK-клеток. (А) NK-клетки были очищены MACS из селезенки и культивированы в IL-2 в течение 7 дней. Количество живых клеток CD3-NK1.1+NKp46+ оценивали каждые 2–3 дня. Символы и столбцы ошибок представляют среднее значение ± SEM для 2–4 биологических повторов. (B) Экспрессию JAK1, перфорина и -актина анализировали в расширенных NK-клетках из двух независимых экспериментов с помощью вестерн-блоттинга. Сканирование полных блотов доступно в дополнительных материалах. (C) Разросшиеся NK-клетки мышей Jak1WT и Jak1fl/+Ncr1Cr смешивали с окрашенными CFSE клетками-мишенями YAC{{20}} (левая панель) или RMA-Rae1 (правая панель) при указанных соотношениях эффекторных мишеней. . Специфический лизис оценивали методом проточной цитометрии. Для YAC-1 показан репрезентативный график одного из двух независимых экспериментов. Символы и столбцы ошибок представляют собой среднее значение ± SEM для двух технических повторов. Для RMA-Rae1 показано среднее значение двух независимых экспериментов. Символы и столбцы ошибок представляют среднее значение ± SEM для 2–3 биологических повторов. *p < 0.05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

JAK2 незаменим для выживания и созревания NK-клеток

На данный момент мы показали, что внутренняя делеция JAK1 NK-клеток приводит к дефициту NK-клеток. Чтобы выяснить, влияет ли JAK2 на выживаемость и созревание NK-клеток, мы проанализировали NK-клетки селезенки у мышей Jak2fl/flNcr1Cre и их однопометников дикого типа. Нам не удалось обнаружить какого-либо влияния делеции JAK2 на частоту или общее количество клеток CD3-NKp46+ в селезенке (рис. 3А). Кроме того, у мышей Jak2fl/flNcr1Cre наблюдалось нормальное созревание NK-клеток, поскольку в обоих генотипах было обнаружено одинаковое процентное содержание клеток CD27-CD11b+ (рис. 3B). Поскольку удаление белка JAK2 в NK-клетках было очень эффективным (рис. 3C), эти данные однозначно определяют, что в отличие от JAK1, JAK2, свойственный NK-клеткам, необязателен для выживания и созревания NK-клеток.

Польза цистанхе для мужчин – укрепление иммунной системы

Потеря одного аллеля Jak1 нарушает функциональность NK-клеток

Чтобы получить дальнейшее представление о том, как JAK1 регулирует функциональность NK-клеток, мы проанализировали рост NK-клеток селезенки, очищенных MACS, из Jak1WT, Jak1fl/+Ncr1Cre и Jak1fl/flNcr1Cre. NK-клетки с дефицитом JAK1-не размножались, что показывает, что даже при очень высокой дозе IL-2 другие JAK не могут компенсировать потерю JAK1 (рис. 4А). Потеря одного аллеля Jak1 привела к незначительному нарушению роста (рис. 4А). Вестерн-блот-анализ подтвердил снижение экспрессии белка JAK1 в расширенных NK-клетках Jak1fl/+Ncr1Cre, что сопровождалось снижением уровня перфорина (рис. 4B). Напротив, NK-клетки Jak1fl/+Ncr1Cre проявляли нарушенную цитотоксическую активность в отношении клеточных линий-мишеней YAC-1 и RMA-Rae1 (рис. 4C). Эти результаты доказывают, что JAK1 не только необходим для поддержания NK-клеток на периферии, но и способствует их цитотоксической активности.

Истощение NK-клеток, вызванное потерей одного аллеля Jak1, ухудшает наблюдение за опухолями

NK-клетки имеют решающее значение для раннего распознавания и устранения трансформированных клеток. Чтобы выяснить, приводит ли уменьшение NK-клеток и нарушение их функциональности у мышей Jak1fl/+Ncr1Cre к повышенной восприимчивости к опухолевому росту и не компенсируется ли это другими способами, мы использовали клетки лимфомы RMA-Rae1. Эта клеточная линия является инструментом для надежного и эффективного изучения наблюдения за опухолями, зависимыми от NK-клеток (20). Мы подкожно трансплантировали клетки лимфомы RMA-Rae1 в оба бока мышей Jak1fl/+ и Jak1fl/+Ncr1Cre. Отсутствие одного аллеля Jak1 нарушило способность NK-клеток контролировать рост опухоли, о чем свидетельствует увеличение размера опухоли (рис. 5A) и веса опухоли в Jak1fl/+Ncr1Cre (рис. 5B). В свою очередь, эти опухоли показали значительно сниженную инфильтрацию NK-клеток (рис. 5C, D). Нам не удалось обнаружить какой-либо разницы в частоте NKG2D+ инфильтрирующих опухоль NK-клеток (рис. 5E), которые имеют решающее значение для распознавания опухолей RMA-Rae1. Таким образом, наши результаты показывают, что снижение количества NK-клеток в сочетании с нарушением функциональности NK-клеток у мышей Jak1fl/+Ncr1Cre достаточно, чтобы значительно ухудшить контроль роста опухоли in vivo.

РИСУНОК 5|Потеря одного аллеля Jak1 ухудшает наблюдение за опухолью. (A, B) Мышам Jak1fl/+ и Jak1fl/+Ncr1Cre подкожно вводили 106 клеток RMA-Rae1 и через 10 дней оценивали массу опухоли. Показаны (A) репрезентативные изображения опухолей и (B) точечные графики с горизонтальными линиями, представляющие средний вес опухоли ± SEM из 2 независимых экспериментов; n=6–8 (C, D) Инфильтрирующие опухоль NK-клетки анализировали методом проточной цитометрии. (C) Показаны репрезентативные участки инфильтрирующих опухоль клеток CD3-NKp46+ и их процент среди клеток Rae1-. (D) Общее количество инфильтрирующих опухоль клеток CD3-NKp46+ на грамм опухоли и (E) процентное содержание NKG2D+ NK-клеток представлены в виде гистограмм, показывающих среднее значение ± SEM из одного эксперимента n=4- 5. ***р < 0,001.

ОБСУЖДЕНИЕ

Нарушение регуляции сигнального пути JAK-STAT тесно связано с развитием рака, а также иммунными нарушениями (7). Первым обнаруженным JAK-связанным заболеванием был тяжелый комбинированный иммунодефицит (SCID), который характеризовался аномалиями NK-клеток, вызванными мутациями LOF JAK3 (26, 27). Здесь мы показываем, что делеция JAK1 в клетках NKp46+ приводит к врожденному иммунодефициту с потерей клеток NK и ILC1 в периферических органах, тогда как JAK2 является избыточным для выживания и созревания NK-клеток. Наша предыдущая работа показала, что потеря STAT5 в NK-клетках приводит к серьезному снижению количества NK-клеток в периферических органах (18). Потеря NK-клеток у мышей Stat5fl/flNcr1Cre была предотвращена за счет усиленной экспрессии молекулы, способствующей выживанию BCL2 (28). Это исследование определило STAT5 как решающий фактор выживания NK-клеток. У мышей с дефицитом STAT5B в основном отсутствуют NK-клетки (29), что соответствует тому факту, что STAT5 передает сигналы после цитокинов, которые жизненно важны для биологии NK-клеток, таких как IL-2 или IL-15 (30). IL-15 имеет решающее значение для развития и выживания NK-клеток, поскольку мыши Il15-/- в основном лишены периферических NK-клеток (31). IL-15 передает сигналы через рецепторный комплекс цепи c-рецепторов, IL-2R и IL-15r (32). Мыши с нокаутом каждой рецепторной цепи доказывают абсолютно важную роль сигналов, посылаемых ниже IL-15, для развития NK-клеток (33, 34). На сегодняшний день вклад c-ассоциированного JAK3 в развитие NK-клеток хорошо известен. Мыши с дефицитом JAK3 демонстрируют фенотип SCID, аналогичный наблюдаемому у пациентов-людей, и развитие NK-клеток блокируется на стадии пре-NK-предшественников (35, 36). Теперь мы считаем ранее недооцененный JAK1 важной частью оси IL-15/STAT5 в NK-клетках. NK-клетки Jak1fl/flNcr1Cre демонстрируют блокировку развития на стадии iNK-клеток и почти полную потерю NK-клеток в периферических органах.

Интересно, что последствия делеции JAK1 для NK-клеток превосходят последствия дефицита STAT5-. Нарушение совместной активации STAT3 и STAT5 может лежать в основе более выраженной потери NK-клеток, поскольку было показано, что STAT3 индуцирует экспрессию важнейшего гена выживания NK-клеток Mcl1 (37, 38). Альтернативно, JAK1 и STAT5 могут иметь разные периоды полураспада, что объясняет разную частоту появления «просто делетеров» — NK-клеток, которые только что потеряли ген, но все еще несут белок, что может объяснить различия. Эффект дозировки генов при дефиците JAK1- отражается на количестве NK-клеток, тогда как потеря одного аллеля JAK1 необязательна для созревания NK-клеток. Это предполагает, что активированный STAT5 ограничивает выживаемость NK-клеток, но не их созревание. Удаление одного аллеля Jak1 также достаточно, чтобы значительно ухудшить наблюдение за опухолью на основании уменьшения количества NK-клеток в сочетании с уменьшением функциональности остальных NK-клеток. В соответствии с нашими данными, специфичная для NK-клеток делеция гена-мишени STAT5 Mcl1 приводит к серьезному дефициту NK-клеток, что вызывает значительное увеличение метастатической нагрузки (38).

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

JAK могут выполнять избыточные функции и компенсировать друг друга. JAK1, расположенный ниже рецептора интерферона, может частично компенсировать потерю активности киназы JAK2 (39). Также было показано, что JAK2 фосфорилирует STAT5 ниже IL-15 во время дифференцировки NK-клеток in vitro (16). С другой стороны, конститутивно активный JAK2 может лишь умеренно компенсировать потерю JAK1 в стволовых клетках, что указывает на неизбыточную роль JAK1 и 2 в HSC. В свою очередь, мы наблюдаем, что в отсутствие JAK1 JAK2 не может компенсировать активацию STAT5 даже при высокой дозе IL -2 in vitro, что обеспечивает выживание NK-клеток. Остается выяснить, достижимы ли компенсаторные эффекты путем экспрессии конститутивно активной формы JAK2. Что еще более важно, мы показываем, что потеря JAK2 в клетках NKp46+ необязательна для выживания NK-клеток. NK-клетки с дефицитом JAK2-полностью созревают, что доказывает, что JAK2, присущий NK-клеткам, не управляет созреванием NK-клеток. Это также указывает на то, что нарушение созревания NK-клеток у мышей Jak2fl/flMx1Cre (14), скорее всего, вызвано внешними для NK-клеток функциями JAK2. Можно предположить, что конститутивная делеция JAK2 изменяет цитокиновую среду.

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Абель А.М., Ян С., Такар М.С., Маларканнан С. Естественные клетки-киллеры: развитие, созревание и клиническое использование. Фронт Иммунол. (2018) 9:1869. дои: 10.3389/fimmu.2018.01869

2. Оранжевый JS. Дефицит естественных клеток-киллеров. J Аллергия Клин Иммунол. (2013) 132:515–25. doi: 10.1016/j.jaci.2013.07.020

3. О'Ши Дж. Дж., Плендж Р. Сигнальные молекулы JAK и STAT в иммунорегуляции и иммуноопосредованных заболеваниях. Иммунитет (2012) 36:542–50. doi: 10.1016/j.immuni.2012.03.014

4. Старк Г.Р., Дарнелл Дж.Э. Путь JAK-STAT в двадцать лет. Иммунитет (2012) 36:503–14. doi: 10.1016/j.immuni.2012.03.013

5. Шуай К., Лю Б. Регуляция передачи сигналов JAK-STAT в иммунной системе. Нат Рев Иммунол. (2003) 3:900–11. дои: 10.1038/nri1226

6. О'Ши Дж.Дж., Холланд С.М., Штаудт Л.М. JAK и STAT при иммунитете, иммунодефиците и раке. N Engl J Med. (2013) 368:161–70. дои: 10.1056/NEJMra1202117

7. Хаммарен Х.М., Виртанен А.Т., Райвола Дж., Силвеннойнен О. Регуляция JAK в передаче сигналов цитокинов и ее нарушение при заболевании. Цитокин (2018). doi 10.1016/j.cyto.2018.03.041. [EPUB перед печатью].

8. Лоренцини Т., Дотта Л., Джакомелли М., Вайро Д., Бадолато Р. Мутации STAT как переключатели программ: превращение первичных иммунодефицитов в аутоиммунные заболевания. J Лейкок Биол. (2017) 101:29–38. doi: 10.1189/jlb.5RI0516-237RR

9. Хаан С., Ролверинг С., Раульф Ф., Капп М., Дрюкес П., Тома Г. и др. Jak1 играет доминирующую роль по сравнению с Jak3 в передаче сигнала через c-содержащие цитокиновые рецепторы. Хим Биол. (2011) 18:314–23. doi: 10.1016/j.chembiol.2011

10. Элетто Д., Бернс С.О., Ангуло И., Планноль В., Гилмор К.С., Энрикес Ф. и др. Биаллельные мутации JAK1 у иммунодефицитного пациента с микобактериальной инфекцией. Нац Коммун. (2016) 7:13992. doi: 10.1038/ncomms13992

11. Родиг С.Дж., Мераз М.А., Уайт Дж.М., Лампе П.А., Райли Дж.К., Артур К.Д. и др. Нарушение гена Jak1 демонстрирует обязательную и неизбыточную роль Jaks в биологических реакциях, индуцированных цитокинами. Cell (1998) 93:373–83.

12. Клеппе М., Спитцер М.Х., Ли С., Хилл К.Э., Донг Л., Папалекси Э. и др. Jak1 интегрирует чувствительность к цитокинам для регуляции функции гемопоэтических стволовых клеток и стрессового гемопоэза. Клеточная стволовая клетка (2018) 22:277. doi: 10.1016/j.stem.2017 13. Шварц Д.М., Канно Ю., Вилларино А., Уорд М., Гадина М., О'Ши Дж.Дж. Ингибирование JAK как терапевтическая стратегия при иммунных и воспалительных заболеваниях. Nat Rev Drug Discov. (2017) 16:843–62. дои: 10.1038/номер.2017.201

14. Боттос А., Готхардт Д., Гилл Дж.В., Гаттелли А., Фрей А., Цанков А. и др. Снижение иммунологического надзора за опухолями NK-клеток вследствие ингибирования JAK усиливает метастазирование на моделях рака молочной железы. Нац Коммун. (2016) 7:12258. дои: 10.1038/ncomms12258

15. Шенберг К., Рудольф Дж., Воннахме М., Парампалли Яджнанараяна С., Корнес И., Хиджази М. и др. Ингибирование JAK нарушает функцию NK-клеток при миелопролиферативных новообразованиях. Рак Рез. (2015) 75:2187–99. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-14-3198

16. Ким В.С., Ким М.Дж., Ким ДО, Бён Дж.Е., Хай Х., Сон ХИ и др. Супрессор передачи сигналов цитокина 2 отрицательно регулирует дифференцировку NK-клеток, ингибируя активность JAK2. Sci Rep. (2017) 7:46153. дои: 10.1038/srep46153

17. Кремплер А, Ци Ю, Триплетт АА, Чжу Дж, Руй Х, Вагнер К.У. Генерация условно нокаутного аллеля гена Янус-киназы 2 (Jak2) у мышей. Бытие (2004) 40:52–7. дои: 10.1002/gen.20063

18. Экельхарт Э., Варш В., Зебедин Э., Симма О., Штойбер Д., Кольбе Т. и др. Новая мышь Ncr1 -Cre выявила важную роль STAT5 в выживании и развитии NK-клеток. Кровь (2011) 117:1565–74. дои: 10.1182/кровь-2010-06-291633

19. Цуй Ю, Ридлингер Г, Миёши К, Тан В, Ли С, Дэн С и др. Инактивация Stat5 в эпителии молочной железы мышей во время беременности обнаруживает различные функции в пролиферации, выживании и дифференцировке клеток. Мол Клеточная Биол. (2004) 18:8037–47. doi: 10.1128/MCB.24.18.8037-8047.2004

20. Червенка А, барон Дж.Л., Ланье Л.Л. Эктопическая экспрессия рано индуцируемого ретиноевой кислотой гена -1 (RAE-1) обеспечивает опосредованное естественными киллерными клетками отторжение опухоли, несущей MHC класса I, in vivo. Proc Natl Acad Sci США. (2001) 98:11521–6. дои: 10.1073/pnas.201238598

21. Путц Э., Готхардт Д., Херманн Г., Чисар А., Вирт С., Бергер А. и др. CDK8-опосредованное STAT1-фосфорилирование S727 ограничивает цитотоксичность NK-клеток и надзор за опухолями. Cell Rep. (2013) 4:437–44. doi: 10.1016/j.celrep.2013.07.012

22. Гейгер Т.Л., Сан Дж.К. Развитие и созревание естественных клеток-киллеров. Курр Опин Иммунол. (2016) 39:82–9. дои: 10.1016/j.coi.2016.01.007

23. Сойка Д.К., Плугастель-Дуглас Б., Ян Л., Пак-Виттель М., Артёмов М.Н., Иванова Ю. и др. Тканевые естественные киллеры (NK) представляют собой клеточные линии, отличные от NK-клеток тимуса и обычных NK-клеток селезенки. Элайф (2014) 3:e01659. doi: 10.7554/eLife.01659

24. Пэн Х., Цзян Х., Чэнь Ю., Сойка Д.К., Вэй Х., Гао Х. и др. Находящиеся в печени NK-клетки обеспечивают адаптивный иммунитет при воспалении при контакте с кожей. Джей Клин Инвест. (2013) 123:1444–56. дои: 10.1172/JCI66381

25. Мартине Л., Феррари Де Андраде Л., Гильри С., Ли Дж.С., Лю Дж., Соуза-Фонсека Гимарайнш Ф. и др. Экспрессия DNAM-1 отмечает альтернативную программу созревания NK-клеток. Cell Rep. (2015) 11:85–97. doi: 10.1016/j.celrep.2015. 03.006

26. Макки П., Вилла А., Джилиани С., Сакко М.Г., Фраттини А., Порта Ф. и др. Мутации гена Jak-3 у пациентов с аутосомно-тяжелым комбинированным иммунодефицитом (ТКИД). Природа (1995) 377(6544):65–8.

27. Рассел С.М., Тайеби Н., Накадзима Х., Риди М.К., Робертс Дж.Л., Аман М.Дж. и др. Мутация Jak3 у пациента с ТКИД: существенная роль Jak3 в развитии лимфоидной системы. Наука (1995) 270:797–800.

28. Готхардт Д., Путц Э.М., Грундшобер Э., Прчал-Мерфи М., Страка Э., Кудвейс П. и др. STAT5 является ключевым регулятором NK-клеток и действует как молекулярный переключатель от наблюдения за опухолью к ее продвижению. Рак Дисков. (2016) 4:414–29. doi: 10.1158/2159-8290.CD-15-0732

29. Вилларино А.В., Сьюме Г., Дэвис Ф.П., Ивата С., Зитти Б., Робинсон Г.В. и др. Пороговые значения STAT5, определяемые подмножествами и тканями, контролируют гомеостаз и функцию врожденных лимфоидных клеток. J Exp Med. (2017) 214:2999–3014. дои: 10.1084/jem.20150907

30. Марсайс А., Виль С., Грау М., Генри Т., Марвел Дж., Уолцер Т. Регуляция развития и функции NK-клеток мыши с помощью цитокинов. Фронт Иммунол. (2013) 4:450. дои: 10.3389/fimmu.2013.00450

31. Кеннеди М.К., Глаккум М., Браун С.Н., Батц Э.А., Вини Дж.Л., Эмберс М. и др. Обратимые дефекты в линиях естественных киллеров и CD8 Т-клеток памяти у мышей с дефицитом интерлейкина 15-. J Exp Med. (2000) 191:771–80. дои: 10.1084/jem.191.5.771

32. Икемидзу С., Чирифу М., Дэвис С.Дж. Сигнальные комплексы IL-2 и IL-15: разные, но одинаковые. Нат Иммунол. (2012) 13:1141–2. дои: 10.1038/ni.2472

33. Уильямс Н.С., Клем Дж., Пузанов И.Дж., Сивакумар П.В., Шацле Дж.Д., Беннетт М. и др. Дифференциация естественных клеток-киллеров: данные нокаутных и трансгенных моделей мышей, а также систем in vitro. Иммунол Ред. (1998) 165:47–61.

34. Лодольче Дж.П., Бун Д.Л., Чай С., Суэйн Р.Э., Дассопулос Т., Треттин С. и др. Рецептор IL-15 поддерживает лимфоидный гомеостаз, поддерживая хоминг и пролиферацию лимфоцитов. Иммунитет (1998) 9:669–76.

35. Пак С.Ю., Сайджо К., Такахаши Т., Осава М., Арасе Х., Хираяма Н. и др. Дефекты развития лимфоидных клеток у мышей с дефицитом киназы Jak3. Иммунитет (1995) 3:771–82.

36. Робинетт М.Л., Селла М., Теллиес Дж.Б., Улланд Т.К., Барроу А.Д., Капудер К. и др. Дефицит Jak3 блокирует развитие врожденных лимфоидных клеток. Мукозальный иммунол. (2017) 1:50–60. doi: 10.1038/ми.2017.38 37. Абдулгани Дж., Аллен Дж.Э., Дикер Д.Т., Лю Ю.Ю., Гольденберг Д., Смит К.Д. и др. Сорафениб повышает чувствительность солидных опухолей к антителам-агонистам рецепторов Apo2L/TRAIL и Apo2L/TRAIL посредством оси Jak2-Stat3-Mcl1. PLoS ONE (2013) 8:e75414. doi: 10.1371/journal.pone.0075414

38. Сате П., Дельконте Р.Б., Соуза-Фонсека-Гимараеш Ф., Сейе С., Шопен М., Ванденберг С.Дж. и др. Врожденный иммунодефицит после генетического удаления Mcl1 в естественных клетках-киллерах. Нац Коммун. (2014) 5:4539. дои: 10.1038/ncomms5539

39. Кейл Э., Финкенштедт Д., Вуфка С., Триллинг М., Либфрид П., Штробль Б. и др. Важная каркасная функция Янус-киназы 2, обнаруженная на новой мышиной модели с мутацией петли активации Jak2. Кровь (2014) 123:520–9. дои: 10.1182/кровь-2013-03-492157