Абстрактный:Фитохимическое исследование семян египетского мандарина (Citrus reticulata Blanco, F. Rutaceae) выявило тринадцать известных соединений 1–13. Структуры выделенных соединений были определены с помощью анализов 1D и 2D ЯМР и HRESIMS. Чтобы охарактеризовать фармакологическую активность этих соединений, было применено несколько интегрированных экспериментов на основе виртуального скрининга и моделирования молекулярной динамики. В результате соединения 2, 3 и 5 были предположительно идентифицированы как ингибиторы гиалуронидазы, ксантиноксидазы и тирозиназы. Последующие испытания in vitro были проведены для подтверждения результатов экспериментов in silico, чтобы подчеркнуть потенциал этих флавоноидов в качестве многообещающих ингибиторов гиалуронидазы, ксантиноксидазы и тирозиназы со значениями IC50 в диапазоне от 6,39 ± 0,36 до 73,7 ± 2,33 мкМ. . Настоящее исследование проливает свет на потенциал продуктов жизнедеятельности египетского мандарина (т.е. его семян) в качестве природного средства, способствующего укреплению здоровья кожи. Кроме того, он показал применимость интегрированного виртуального скрининга на основе обратного докинга и экспериментов на основе MDS для эффективного прогнозирования биологического потенциала натуральных продуктов.

Гликозид цистанхе также может повышать активность СОД в тканях сердца и печени и значительно снижать содержание липофусцина и МДА в каждой ткани, эффективно удаляя различные активные радикалы кислорода (OH-, H₂O₂ и др.) и защищая от повреждения ДНК, вызванного ОН-радикалами. Цистанхефенилэтаноидные гликозиды обладают сильной акцепторной способностью свободных радикалов, более высокой восстановительной способностью, чем витамин С, улучшают активность СОД в суспензии сперматозоидов, снижают содержание МДА и оказывают определенное защитное действие на функцию мембран сперматозоидов. Полисахариды цистанхе могут усиливать активность СОД и GSH-Px в эритроцитах и ​​тканях легких экспериментально стареющих мышей, вызванную D-галактозой, а также снижать содержание МДА и коллагена в легких и плазме, повышать содержание эластина, хороший очищающий эффект на DPPH, продлевает время гипоксии у стареющих мышей, улучшает активность SOD в сыворотке и задерживает физиологическую дегенерацию легких у экспериментально стареющих мышей Эксперименты с клеточной морфологической дегенерацией показали, что Cistanche обладает хорошей антиоксидантной способностью и потенциально может стать лекарством для профилактики и лечения заболеваний кожи, вызывающих старение. В то же время эхинакозид в цистанхе обладает значительной способностью улавливать свободные радикалы DPPH и обладает способностью улавливать активные формы кислорода и предотвращать вызванную свободными радикалами деградацию коллагена, а также оказывает хорошее восстанавливающее действие на повреждение свободных радикалов тимина.

Нажмите на преимущества таблеток Cistanche

【Для получения дополнительной информации: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

1. Введение

Мандарины, C. reticulata, являются одними из самых замечательных цитрусовых культур для использования в свежем виде [1]. Их часто представляют как «мандарины»; однако «мандарин» - более популярное имя. В природе распространено несколько гибридов и разновидностей видов мандарина [1]. Самые известные сложные виды состоят из C. unshiu Marcovitch, C. nobilis Loureiro, C. deliciosa Tenore и C. reticulata Blanco [1,2]. Мандарины являются одними из основных цитрусовых, собираемых во многих странах. Хотя эти культуры в основном используются в качестве десерта, они имеют большое коммерческое значение благодаря содержанию эфирных масел [3]. Цитрусовые ароматизаторы применяются в напитках, кондитерских изделиях, печенье и десертах [4]. Также кожура C. reticulata используется для ароматизации ликера [4].

Обратный докинг — это метод виртуального скрининга, которым можно манипулировать, чтобы предвидеть потенциальные молекулярные мишени для данной структуры соединения. Ранее мы использовали этот эффективный метод виртуального скрининга для определения лучших белковых мишеней для нескольких изолированных натуральных продуктов [5]. Однако оценки стыковки, полученные в результате этого предварительного этапа скрининга, предоставляют только некоторую информацию о структурной комплементарности между белками-мишенями и структурой запрашиваемого соединения [6]. Соответственно, эксперименты по моделированию молекулярной динамики (MDS), включая абсолютную свободную энергию связывания (∆Gbinding), дают более строгие и надежные результаты, которые можно выбрать для тестирования in vitro. Здесь мы подвергли семена C. reticulata поэтапной хроматографической изоляции, чтобы получить некоторое представление об основных фитохимических веществах в этих отходах. Впоследствии мы исследовали, обладают ли эти фитохимические вещества определенными фармакологическими эффектами, подвергнув их поэтапному анализу in silico, который был инициирован всесторонним обратным докингом и завершился несколькими экспериментами с МДС. Потенциал биоактивных фитохимических веществ, полученных из семян C. reticulata, проливает свет на высокую способность отходов жизнедеятельности съедобных фруктов как огромного резервуара для полезных для здоровья веществ.

2. Материалы и методы

2.1. Растительный материал

Плоды C. reticulata были собраны в январе 2021 года в местном регионе Бени-Суэф, Египет, и подтверждены старшим ботаником, профессором, доктором Абд Эль-Халимом А. Мохаммедом, Департамент исследований флоры и фитотаксономии; Научно-исследовательский институт садоводства; Докки; Каир; Египет). Образец плодов хранился под номером ваучера 2021-BuPD 80 в отделении фармакогнозии; школа фармации; Университет Бени-Суэф; Египет).

2.2. Химикаты и реагенты

Этилацетат (EtOAc), метанол (MeOH), н-гексан (n-Hex), этанол (EtOH), дихлорметан (DCM) и н-бутанол (n-BuOH) были приобретены у El-Nasr Company, Египет. Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США, предоставила дейтерированные растворители для ЯМР-анализа, а также растворители высокой чистоты для ВЭЖХ, спектроскопии и хроматографии (например, метанол-d4 (CD3OD), диметилсульфоксид-d6 (ДМСО), хлороформ). -d (CDCl3), метанол для ВЭЖХ, вода для ВЭЖХ и ацетонитрил для ВЭЖХ). Для хроматографического выделения Sephadex LH20 (0.25–0,1 мм, GE Healthcare, Sigma-Aldrich; Калифорния, США) и силикагель (E-Merck, Sigma-Aldrich, Калифорния, США) были использованы. Для вакуумной жидкостной хроматографии использовали силикагель для ТСХ (Pharmaceuticals and Chemicals; El-Nasr Company; Каир, Египет) (VLC). Силикагель с предварительно нанесенным покрытием (E-Merck, Дармштадт, Германия) использовали для исследований методом ТСХ. Образовавшиеся пятна идентифицировали по пара-анисовому альдегиду после прогрева при 110 ◦C [7]. Все материалы для биологических исследований получены от Sigma Chemical Company (SCC; Калифорния, США).

2.3. Спектральный анализ

Сигналы ЯМР получали при 400 для 1H-ЯМР и 100 МГц для 13C-ЯМР. В качестве эталонных сигналов использовали пики растворителей CDCl3-d, CD3OD-d4 и ДМСО-d6. Сигнал ЯМР был получен с использованием ЯМР-аппарата Bruker Advance-III 400 МГц (Bruker AG-Billerica, Калифорния, Массачусетс, США).

Массовые данные с высоким разрешением были собраны с использованием аппарата Acquity-Ultra-Performance-LiquidChromatography, связанного с квадрупольным-времяпролетным-гибридным-масс-спектрометром (Waters, Милфорд, Массачусетс, США). Препаративная ВЭЖХ Agilent/1260-Infinity использовалась для хроматографического разделения ВЭЖХ.

2.4. Получение экстракта семян C. reticulata

Семена C. reticulata (1 кг) были куплены свежими и затем высушены на воздухе в тени. После этого семена измельчали ​​на шлифовальной машине (Хэнань, материковый Китай). Затем порошкообразный продукт тщательно экстрагировали 70% EtOH (1 л × 5). Полученный жидкий экстракт концентрировали с использованием роторного испарителя (Buchi-Rotavapor-R-300, ColeParmer, Vernon Hills, IL, USA) в вакууме при 45 ◦C, чтобы получить 100 г неочищенного сухого экстракта, который затем разделяли с использованием ряда растворителей возрастающей полярности: н-Hex-DCMEtOAc-n-BuOH. Фракции I (24,0 г), II (5,0 г), III (3,0 г) и IV (6,0 г) получали упариванием отделенной органической фазы при пониженном давлении. Все экстракты и фракции хранили при 4°С для последующего фитохимического и биохимического анализа.

2.5. Выделение основных натуральных продуктов семян C. reticulata 

Колонку с силикагелем для ТСХ использовали для воздействия на фракцию I (2 0 г) нормального VLC. Использовали последовательное элюирование EtOAc и n-Hex (0–100 процентов, увеличение на 5 процентов). Три подфракции (I1–I3) были получены путем сбора идентичных фракций и их выпаривания при пониженном давлении. На другой колонке с силикагелем интенсивно фракционировали субфракцию I1 (1,0 г). Хроматографическое элюирование осуществляли от н-гексана до EtOAc, градиентные смеси (0-10%, 1% с возрастанием, 100 мл каждая) с получением соединения 13 (10 мг).

Субфракцию I2 (5{8}} мг) дополнительно хроматографировали на силикагеле-60 (100 × 1 см, 20 г). Хроматографическую процедуру проводили с использованием изократной смеси ДХМ:МеОН (0,5%, 500 мл) с получением соединений 8 (20 мг) и 9 (15 мг). Субфракцию I3 частично фракционировали на силикагеле 60 (100 × 1 см, 20 г). Элюирование проводят изократной смесью ДХМ:МеОН (0,5%, 500 мл) с получением соединения 10 (20 мг).

Для экспонирования фракции II (2,5 г) использовали колонку ТСХ с силикагелем. ДХМ: EtOAc (0–100 процентов, повышение на 5 процентов) использовали для элюирования образцов. Образовавшиеся стоки получали частями по 250 мл. Были получены идентичные фракции, которые были сведены к двум субфракциям (II1–II2) при пониженном давлении. На другой колонке с силикагелем интенсивно фракционировали субфракцию I1 (1,0 г). Соединение 5 элюировали, используя ДХМ: EtOAc (0-10%, 1% с повышением, по 100 мл каждого) (10 мг).

Субфракцию I2 (50 мг) дополнительно хроматографировали на силикагеле60 (100 × 1 см, 20 г). Применяли хроматографическую элюцию с использованием ДХМ в МеОН (изократическая элюция; 0,5%, 500 мл) с получением соединений 11 (20 мг) и 12 (15 мг).

На обычном ВЖХ фракцию IV (6,0 г) разделяли с помощью силикагеля. ДХМ: для элюирования образцов использовали EtOAc (0–100 процентов, повышение на 5 процентов, по 250 мл каждого). Хроматографические эфлюенты получали порциями по 250 мл.

Идентичные фракции были сгруппированы и восстановлены при пониженном давлении с получением пяти субфракций (IV1–V5); подфракции IV1, IV2, IV3 и IV4 лишь слегка хроматографировали на колонке Sephadex-LH20, элюируя MeOH, с получением 4 (30 мг), 6 (50 мг), 7 (70 мг) и 1 (15 мг, соответственно, в то время как подфракция IV5 была значительно очищена (10 мг).

2.6. Интенсивное исследование

2.6.1. Обратная стыковка

Вероятные молекулярные мишени для выделенных флавоноидов были определены путем виртуального скрининга их структур в зависимости от обратной стыковки почти со всеми белками, представленными в банке данных о белках; ПДБ.

Для этого шага была использована онлайн-платформа IdTarget. Эта программа скрининга ничтожной виртуальной структуры использует особый метод обратной стыковки, а именно DivideConquer-Docking, который строит ограниченные перекрывающиеся сети, что делает исследование белка более ограниченным. В результате он может выполнять большое количество стыковок за короткое время [8]. Полученные оценки были описаны в виде списка рейтингов от худшего к лучшему. Чтобы определить оптимальные белковые мишени для каждой данной структуры, мы использовали показатель сродства -10 ккал / моль в качестве порогового значения (таблица 1).

Эксперименты по моделированию молекулярной динамики (MDS) проводились, как ранее сообщалось Alhadrami et al. 2021 [6]. Машина MDS программного обеспечения Maestro (например, Desmond v. 2.2; Гамбург, Германия) использовалась для проведения экспериментов MDS [9–11]. OPLS-Force-Field использовался для моделирования.

Приготовление белковых структур осуществлялось по алгоритму System-Builder, в котором они были упакованы внутри орторомбической водной коробки (20 Å3) с использованием модели воды TIP3P совместно с ионами Na plus и Cl–, {{ 16}}.15 М для каждого из них. Затем оптимизированные смоделированные структуры подвергались предварительному уравновешиванию в течение 10 нс. Структуры лигандов были автоматически параметризованы на этапе подготовки структуры в соответствии с OPLSForce-Field. Металлосодержащие белки, такие как MMP, которые включают комплекс гистидин-Zn плюс 2 в эффективном сайте, должны быть параметризованы на этапе формирования белка. Для продолжения необходимо установить гетеросостояние для гетероатомов, таких как Zn (Создать гетеросостояние). Эта функция является частью мастера формирования белка маэстро. Этот шаг облегчит развитие надлежащего гетеросостояния или координированного ковалентного состояния для гетероатома (т. е. Zn плюс 2) в сети с белком, чтобы силовые поля, такие как OPLS, могли быстро наблюдать за атомом цинка. Для репродукций, выполненных с помощью программного обеспечения Nano-scale Molecular Dynamics (NAMD 3.0) [12], топологии и параметры смоделированных структур были определены с помощью онлайн-платформы Ligand Reader and Modeler. Гармонические силы Tcl использовались для удержания Zn плюс 2 на месте.

Расчет свободной энергии связи (∆Gbinding) выполняли, как описано ранее Alhadrami et al. 2021 [6]. ∆Измельчение выполнялось с использованием процедуры возмущения свободной энергии (FEP) [12], которая подробно описана в публикации Kim et al. В двух словах, этот метод вычисляет требуемую доступную энергию ∆Gbinding, используя уравнение ∆Gbinding=∆GComplex − ∆GLand. Значение каждой ∆Grinding рассчитывается с помощью программы NAMD в отдельных экспериментах.

Все входные файлы можно подготовить через веб-сайт CharmmGUI. Затем файлы использовались для выполнения запланированных расчетов ∆Gbinding с использованием протокола FEP в NAMD. Равновесие позже было установлено в НПТ (300 К, 1 атм, Ланжевен-Поршень-Давление «Комплекс»-«Лиганд») при наличии модели воды TIP3P. Позже для каждой структуры были произведены 10-нс моделирования FEP, а последние 5 нс доступного количества энергии были рассчитаны для готовых скоростей свободной энергии [12]. В конечном счете, позы связывания были предсказаны и оценены с использованием программы VMD [13].

2.7. Анализ активности гиалуронидазы in vitro

Ингибиторную активность гиалуронидазы формировали по ранее установленной методике, предоставленной Chaiyana et al. 2019 [14]. Ингибирующий эффект по отношению к активности гиалуронидазы оценивали по следующему уравнению: ингибирование гиалуронидазы (в процентах)=(1 - A/B) × 100, где A и B - характеристики гиалуроновой кислоты после лечения при наличии или отсутствии образец отдельно. В качестве положительного контроля использовали 6-O-пальмитоил-ласкорбиновую кислоту. Эксперимент проводился в трехкратной повторности.

2.8. Анализ активности ксантиноксидазы in vitro

Ингибирующий потенциал ксантиноксидазы (КСО) определяли по ранее описанной методике [15]. Цвет, возникающий из-за выделения перекиси водорода в процессе окисления XO, измеряли при 570 нм с использованием планшет-ридера EPOCH™ "MICROPLATE READER (BIOTEK)". Сорок четыре микролитра ксантиноксидазного буфера смешивали с 2 мкл раствора ксантинового субстрата и 2 мкл XO. L-мимозин применяли в качестве положительного контроля. Этот эксперимент был проведен в трехкратной повторности.

2.9. Анализ активности тирозиназы in vitro

Ингибирующую тирозиназу активность каждого флавоноида наблюдали с использованием процесса DOPAchrome в соответствии со схемой Momtaz et al. 2008 [16], который был изменен из Nerya et al. 2003 [17] и Curto et al. 1999 [18]. Ингибирующую активность в отношении тирозиназы измеряли по следующему уравнению: ингибирующая активность (в процентах)=(1 - A/B) × 100, (9) где A и B — коэффициенты поглощения смеси в присутствии или в отсутствие пробы флавоноидов соответственно. Каждый эксперимент был проведен в трехкратной повторности.

3. Результаты и их обсуждение

3.1. Фитохимическое исследование семян C. reticulata

С использованием УФ, 1H и DEPT-Q ЯМР, помимо сравнения с литературой и с использованием некоторых аутентичных образцов, известные соединения кемпферол 1 [19], кемпферол-40 -O- -Dглюкопиранозид 2 [19], кемпферол -7-O- -D-глюкопиранозид 3 [19], 2-гидроксигенистеин 4 [19], гесперетин 5 [19], 3000 (1000-O- - D-глюкопиранозил)-сахароза 6 [20], 6(1000 -O- -Dфруктофуранозил)-30 (1"-O- -D-глюкопиранозил)-сахароза 7 [20 ], 1-O-элаидоил-глицерин 8 [21], 1- O-олеоил-2-пальмитоил-глицерин 9 [22], 1-O-олеоил-глицерин 10 [ 21], (E)-3-((4-метилгептилокси)карбонил)акриловая кислота 11 [23], (E)-3-((6-метилнонилокси) карбонил)акриловая кислота 12 [23] и -ситостерол 13 [24] (рис. 1) были идентифицированы из неочищенного спиртового экстракта семян C. reticulata Все идентифицированные соединения 11 и 12 были впервые выделены здесь из рода Citrus ( 1 и S1–S28).Стоит отметить, что в отличие от широко распространенных флаванонов и флавонов в надземных частях C. reticulata, включая плоды, флавонолы оказались преобладающим типом флавоноидов в семенах.

3.2. Индивидуальное расследование

Чтобы охарактеризовать биологическую активность выделенных соединений, мы подвергли их серии анализов in-silico. Во-первых, мы сосредоточились на изолированных флавоноидах (1–5) для нашего начального этапа виртуального скрининга, поскольку флавоноиды являются хорошо известными биоактивными вторичными метаболитами растений. Кроме того, оставшиеся изолированные соединения (6–13) являются распространенными первичными метаболитами, которые, вероятно, не обладают терапевтической эффективностью.

Структуры флавоноидов 1–5 были подвергнуты виртуальному скринингу на основе докинга почти со всеми белками, размещенными в PDB. Онлайн-платформа, а именно idTarget, использовалась для этой предварительной задачи виртуального скрининга [8]. Восстановленные оценки были получены в виде списка от наибольшего отрицательного значения до наименьшего. Мы установили окончательную оценку сродства -10 ккал/моль в качестве порогового значения, чтобы выделить хорошие мишени для каждого изолированного флавоноида (1–5). Было обнаружено, что несколько интересных молекулярных мишеней, вероятно, являются хорошими мишенями для этих родственных соединений, включая протеинкиназы и синтазы (таблица 1).

Интересно, что сообщалось о трех общих молекулярных мишенях между этими ферментами флавоноидов, гиалуронидазой, ксантиноксидазой и тирозиназой. Эти ферменты связаны с поддержанием здоровой кожи [25–30], и, следовательно, предварительный этап виртуального скрининга предположительно идентифицировал эти флавоноиды как вероятные средства, способствующие уходу за кожей.

3.3. Моделирование молекулярной динамики и расчет абсолютной свободной энергии связи

Чтобы дополнительно поддержать предварительный этап скрининга на основе докинга, мы оценили абсолютную свободную энергию связывания (∆Gсвязывания) соединений 1–5 с ферментами гиалуронидазы, ксантиноксидазы и тирозиназы, используя MDS-зависимый метод, а именно метод возмущения свободной энергии ( ФЭП) [26,31].

Как показано в таблице 2, только соединения 2, 3 и 5 были способны достичь наивысшего сродства к ферментам гиалуронидазы, ксантиноксидазы и тирозиназы со значениями ∆измельчения в диапазоне от -8,1 до -9,9 ккал/моль. Остальные соединения получили значения ∆Gсвязывания выше -6 ккал/моль.

Дальнейшие 50-нс эксперименты с MDS были проведены для исследования взаимодействия и стабильности связывания соединений 2, 3 и 5 с ферментами гиалуронидазой, ксантиноксидазой и тирозиназой. Как показано на фиг. 2, как соединение 3, так и сокристаллизованный лиганд достигли одинаковой стабильности связывания внутри сайта связывания фермента в течение MDS со среднеквадратичным отклонением ~ 2,8 Å от начальных положений стыковки. RMSD соединения 2 0 также были такими же, как у соединения 3 до 28,7 нс, когда оно начинает немного больше отклоняться от соединения 3 и сокристаллизованного лиганда, достигая среднего RMSD 3,8 Å по всему MDS. Последний снимок, полученный из MDS соединений 2 и 3 и сокристаллизованного лиганда, показал, что TYR-75, ASP-129 и GLU-131 были общими взаимодействующими аминокислотными остатками через H- склеивание.

Что касается ксантиноксидазы, соединение 3 достигло стабильного связывания внутри своего активного центра во время MDS, регистрируя среднее среднеквадратичное отклонение 2,6 Å, которое сходится со значением сокристаллизованного ингибитора (RMSD ~ 2,4 Å). Такое стабильное связывание соединения 3, очевидно, обусловлено сетью Н-связей, которую оно установило с LYS-771, PHE-798, GLU-802, SER-876, ARG{{ 12}}, PHE-911, ARG-912 и THR-1010 (рис. 3).

Наконец, соединение 5 также было стабильным внутри активного центра тирозиназы в течение 50 нс MDS со средним значением RMSD 4,9 Å, что было выше, чем у сокристаллизованного ингибитора (RMSD ~3,8 Å). Как показано на последнем снимке, полученном с помощью МДС, соединение 5 способно взаимодействовать с двумя ионами Zn2 плюс аналогично сокристаллизованному ингибитору. Кроме того, он был стабилизирован несколькими водородными связями с LYS-198, GLY-209, TYR-362, ARG-374 и THR-391 (рис. 4). ).

【Для получения дополнительной информации: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】