CaWRKY30 положительно регулирует иммунитет к перцу, нацеливая CaWRKY40 против инокуляции Ralstonia Solanacearum посредством модуляции генов, связанных с защитой. Часть 2

2.5. CaWRKY30 Временная гиперэкспрессия, стимулированная HR-подобной гибелью клеток, продукцией H2O2 и активацией транскрипции маркерных генов, связанных с иммунитетом

Эксперименты VIGS показали, что CaWRKY30 положительно регулирует иммунитет перца к RSI. Временные эксперименты по сверхэкспрессии проводили путем инфильтрации клеток GV3101, несущих 35S:00 (EV) или 35S:CaWRKY30, в листья перца для дальнейшего подтверждения этого предположения. Мы изучили роль транзиентной сверхэкспрессии CaWRKY30 в индукции HR-подобной гибели клеток и накоплении H2O2 в растениях перца. Экспрессия CaWRKY30 в растениях перца была установлена ​​с помощью экспериментов по вестерн-блоттингу (фиг. 5А).

HR-подобную гибель клеток и накопление H2O2 подтверждали окрашиванием трипановым синим и DAB соответственно. Результаты показали, что кратковременная сверхэкспрессия CaWRKY30 вызывает HR-подобную гибель клеток и накопление H2O2 в листьях перца, проявляющееся более темным окрашиванием трипановым синим и темно-коричневым окрашиванием DAB (рис. 5B). Проводимость была проведена для изучения интенсивности некроза клеток, вызванного транзиторной гиперэкспрессией CaWRKY30, и результаты показали, что листья перца с транзиторной гиперэкспрессией CaWRKY30 показали большую утечку ионов через 24 и 48 ч после агроинфильтрации по сравнению с листьями перца с гиперэкспрессией. выражая пустой вектор (рис. 5C). Относительные уровни транскрипционной экспрессии связанных с защитой маркерных генов, таких как CaPR1, связанный с биосинтезом ET, CaNPR1, связанный с SA, ABA-чувствительный CaABR1 и ассоциированный с HR маркерный ген CaHIR1, были обнаружены с помощью анализа qRT-PCR.

Наши результаты показали, что временная сверхэкспрессия CaWRKY30 в листьях перца заметно усиливала накопление транскрипции CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 и CaHIR1 в перце по сравнению с временной сверхэкспрессией растений перца с пустым вектором при 48 днях на дюйм (рис. 5D). Эти результаты показывают, что CaWRKY30 действует как положительный регулятор растительной HR-подобной гибели клеток, продукции H2O2 и усиления транскрипции маркерных генов, связанных с иммунитетом.

Рисунок 5. Временная сверхэкспрессия CaWRKY30, вызывающая HR-подобную гибель клеток, накопление H2O2 и экспрессию маркерных генов, связанных с иммунитетом, в листьях перца. Успешная сверхэкспрессия CaWRKY30-Flag была подтверждена экспериментом по вестерн-блоттингу (A), HR-подобная гибель клеток, вызванная временной сверхэкспрессией 35S: CaWRKY30, подтвержденная определением фенотипа, воздействием УФ-света и Окрашивание DAB и трипановым синим при 48 л/с соответственно; Шкала шкалы=50 мкм (B), измерение утечки электролита (ионной проводимости) для оценки реакции гибели клеток в дисках листьев перца через 24 и 48 ч после агроинфильтрации соответственно (C), анализ qRT-PCR для проверьте уровни транскрипционной экспрессии маркерных генов, связанных с иммунитетом, включая CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 и CaHIR1 в листьях перца, экспрессированных 35S: CaWRKY30, при 48 dpi, соответственно (D). Относительный уровень экспрессии известных маркерных генов, связанных с защитой, в листьях перца, временно сверхэкспрессирующих пустой вектор, был установлен на «1». Данные, представляющие средние значения ± стандартная ошибка для четырех биологических повторов. Столбики погрешностей представляют собой стандартные ошибки средств. Различные буквы над столбцами указывают на существенные различия между средними значениями.

2.6. Взаимоотношения между CaWRKY30 и CaWRKY40

Сообщается, что разные WRKY TF образуют сети вместе, и мы ранее сообщали, что различные члены WRKY TF, т.е. CaWRKY6, CaWRKY22 и CaWRKY40, экспрессивно и функционально связаны друг с другом. Поэтому мы предполагаем, что CaWRKY30 может быть связан с другими членами семейства WRKY, включая CaWRKY40, который является положительным регулятором иммунитета перца против RSI. Анализ qRT-PCR был выполнен для дальнейшего изучения возможной регуляции CaWRKY40 по принципу обратной связи с помощью CaWRKY30, а также для изучения потенциальной модуляции CaWRKY30 с помощью анализа временной сверхэкспрессии CaWRKY40 или путем подавления CaWRKY40 с помощью VIGS.

CaWRKY40 представляет собой транскрипционный фактор WRKY, участвующий в реакциях растений на различные биотические и абиотические стрессы. Исследования показали, что CaWRKY40 индуцируется в томатах и ​​может повышать устойчивость растений к засухе и низкотемпературным обработкам. Кроме того, исследование также показало, что сверхэкспрессия CaWRKY40 может улучшить засухоустойчивость томатов и ослабить ингибирование роста, вызванное солевым стрессом, но устойчивость к патогенам нуждается в дальнейшем изучении. Следовательно, CaWRKY40 играет важную роль в иммунном ответе растений и обладает определенным потенциалом для повышения урожайности сельскохозяйственных культур. В то же время мы также должны обратить внимание на наш иммунитет. Иммунитет нашего организма очень важен. Цистанхе оказывает значительное влияние на повышение иммунитета. Цистанхе богат различными антиоксидантными веществами, такими как витамин С, витамин С, каротиноиды и т. д. Эти ингредиенты могут удалять свободные радикалы, уменьшать окислительный стресс и повышать сопротивляемость иммунной системы.

Нажмите Цистанхе пустынная добавка

Наши результаты показали, что уровни транскрипции CaWRKY30 в листьях перца, временно сверхэкспрессирующих CaWRKY40, увеличились через 24 и 48 л. избыточная экспрессия CaWRKY30 по сравнению с растениями, временно избыточно экспрессирующими EV (фиг. 6B). Напротив, наши результаты показали, что накопление транскрипции CaWRKY40 было заметно снижено в растениях, инфицированных Ralstonia CaWRKY30-, с молчанием по сравнению с растениями без молчания (рис. 6C). Кроме того, транскрипционное накопление известных маркерных генов, связанных с иммунитетом, например, CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 и CaHIR1, было полностью или частично подавлено в растениях с молчанием CaWRKY30, которые были запущены CaWRK40 (рис. 6D).

Эти данные указывают на регуляцию транскрипции CaWRKY40 с помощью CaWRKY30 и наличие положительной регуляторной петли, включающей CaWRKY30 и CaWRKY40.

Рисунок 6. Взаимосвязь между CaWRKY30 и CaWRKY40. Транскрипционное выражение лев. Уровни CaWRKY40 в листьях перца, временно сверхэкспрессирующие CaWRKY30 во временном интервале 24 и 48 dpi (A), Уровни транскрипционной экспрессии CaWRKY30 в листьях перца, временно избыточно экспрессирующие CaWRKY40 во временном интервале 24 и 48 dpi (B), gRT-PCR анализ уровней транскрипционной экспрессии CaWRKY40 в CaWRKY30-молчащих и немолчащих растениях перца при 48 dpi (C)gRT-PCR анализ уровней транскрипции связанных с защитой маркерных генов в CaWRKY30-молчащих и немолчащих немолчащие растения перца с кратковременной сверхэкспрессией 35S: CaWRKY40-HA и 35S:00при 48 HPI (D). Данные означают плюс SE из четырех биологических повторов. Столбики погрешностей представляют собой стандартные ошибки средств. Разные буквы над столбцами показывают значительные различия между средними значениями.

2.7. Взаимоотношения между CaWRY30 и CaWRKY6, CaWRKY22 и CaWRKY27

В наших предыдущих исследованиях было обнаружено, что CaWRKY40 экспрессионно и функционально связан с различными TF WRKY, такими как CaWRKY6 и CaWRKY22. Связь между CaWRKY30 и CaWRKY40 указывает на то, что CaWRKY30, возможно, связан с различными TF WRKY, участвующими в иммунитете перца против RSI. Чтобы подтвердить это предположение, был проведен анализ qRT-PCR для изучения взаимосвязи между CaWRKY30 и различными TF WRKY, о которых ранее сообщалось, что они участвуют в иммунитете перца против RSI, включая CaWRKY6, CaWRKY22 и CaWRKY27. Наши результаты показали, что транскрипционное накопление CaWRKY30 было амплифицировано в растениях перца CaWRKY6, CaWRKY22 и CaWRKY27 с транзиторной гиперэкспрессией при 48 dpi (рис. 7А), в то время как транскрипционное накопление CaWRKY6, CaWRKY22 и CaWRKY27 также увеличивалось в листьях перца с транзиторной гиперэкспрессией. CaWRKY30 с разрешением 48 dpi (рис. 7B). Наши результаты анализа qRT-PCR подразумевают, что CaWRKY30 и CaWRKY6, CaWRKY22 и CaWRKY27 экспрессивно и функционально взаимосвязаны.

3. Обсуждение

Белок WRKY является одним из крупнейших семейств растительных транскрипционных факторов (ТФ). Известно, что группа членов семейства WRKY TF, обнаруженная в Arabidopsis thaliana и Oryza sativa, принимает участие и играет решающую роль в регуляции иммунитета растений. Сообщалось о значительных функциональных вариациях среди близких структурных гомологов WRKY [17,48], а функции WRKY TF в иммунитете немодельных растений, таких как перец, изучены недостаточно.

CaWRKY30, ген WRKY группы III, был функционально охарактеризован в настоящем исследовании. Результаты показали, что CaWRKY30 положительно регулирует иммунитет перца против RSl и является жизненно важным компонентом сети WRKY, включающей CaWRKY6, CaWRKY22CaWRKY27 и CaWRKY40. Включение CaWRKY30 в иммунитет перца подтверждается чувствительными к патогенам цис-элементами, включая элемент TGA, TGACG-motifIATC-box, TATA-box и W-box, присутствующие в промоторной области CaWRKY30. Это предположение согласуется с повышением уровней транскрипции CaWRKY30 после и после экзогенно поставляемых ETH, ABA и SA [49,50].

Поскольку часто известно, что гены, запускаемые воздействием определенного стрессового фактора, участвуют в ответе на этот стресс [51], мы предположили, что CaWRKY30 может положительно регулировать иммунитет перца к RSI. Это предположение было подтверждено данными о молчании CaWRKY30 с помощью VIGS и анализом временной сверхэкспрессии CaWRKY30. Это ослабление иммунитета из-за потери функции CaWRKY30 сопровождалось усиленным ростом RSI и подавлением связанных с иммунитетом маркерных генов, таких как SA-зависимый CaPR1 (52CaNPR1 [53], JA-родственный CaDEF1 (54), ABA-ассоциированный CaABR1 [55]. ] и HR-ассоциированный CaHIR1 (561. С другой стороны, HR-подобная гибель клеток и секреция HO были вызваны временной сверхэкспрессией CaWRKY30, сопровождаемой активацией транскрипции связанных с иммунитетом маркерных генов, таких как CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 и CaHIR1. Это предполагает роль CaWRKY30 в качестве положительного регулятора HR-подобной гибели клеток и иммунитета перца против RSI. Аналогичным образом, в предыдущих исследованиях наблюдалось, что AtWRKY30, гомолог CaWRKY30 у арабидопсиса, положительно регулирует иммиграцию растений. -мунитв против биотических и абиотических стрессов 157.581 Можно предположить, что CaWRKY30 активируется при заражении Ralstonia, что приводит к снижению уязвимости перца к заражению бактериальными патогенами.

Фитогормоны, такие как ЭТ, АБК и СК, являются важными сигнальными молекулами, участвующими в реакции растений на атаки патогенов и высокотемпературный стресс. Они также участвуют в перекрестных помехах между реакциями растений на биотические и абиотические стрессы [59]. СК вызывает устойчивость к биотрофным патогенам, в то время как ЭТ играет жизненно важную роль в иммунитете растений против некротрофных патогенов [60]. Как правило, синтез SA, ET и JA связан с иммунитетом, запускаемым PAMP (PTI), или иммунитетом, запускаемым эффектором (ETI). Эти фитогормоны могут играть свою роль как синергически, так и антагонистически в зависимости от их концентрации во время передачи защитных сигналов [61]. Синергическая ассоциация между этими тремя сигнальными элементами была обнаружена при PTI, тогда как компенсаторная ассоциация была обнаружена при ETI [62]. CaWRKY30 постоянно индуцировался экзогенно доставляемыми фитогормонами. Известные маркерные гены SA, ET и ABA-зависимого иммунитета, такие как CaPR1, CaNPR1, CaDEF1 и CaABR1, подавлялись за счет молчания CaWRK30; тем не менее, они были активизированы временной сверхэкспрессией CaWRKY30 в растениях перца, показывая, что CaWRKY30 принимает участие в синергетически опосредованной передаче сигналов защиты с помощью SA, ET и ABA, что приводит к PTI.

Полногеномный анализ показал участие нескольких ТФ WRKY в иммунитете растений [63–65]. По исследованиям функциональной геномики, WRKY1 [66], -11 [67], -17 [67], -18 [68], -22 [69], {{13} } [70], -28 [71], -33 [72], -38 [73], -40 [68], -45 [74], -46 [75], -53 [76], -54 [75], -60 [68], -62 [77], -70 [75] и -75 [78] были функционально охарактеризованы в иммунитете арабидопсиса, регулирующие иммунитет положительно или отрицательно. Было высказано предположение, что эти WRKY TF организуются в транскрипционную сеть WRKY, состоящую из плюсовых и минусовых петель обратной связи и модулей прямой связи [12]. Однако конфигурация этих сетей WRKY остается малоизученной.

В более ранних исследованиях мы обнаружили, что CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 и CaWRKY40 являются положительными регуляторами иммунитета перца к RSI [9,44,45], тогда как CaWRKY58 является отрицательным регулятором [46]. Текущее исследование показывает, что CaWRKY30 действует как положительный регулятор HR-подобной гибели клеток перца и реакции перца на инфекцию R. solanacearum. Уровни транскрипционной экспрессии CaWRKY30 повышались при временной сверхэкспрессии CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 и CaWRKY40. Наоборот, временная сверхэкспрессия CaWRKY30 повышала накопление транскрипции CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 и CaWRKY40, указывая на наличие сетей WRKY TF и ​​плюс пять петель обратной связи среди CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 и CaWRKY40. Предполагается, что в иммунитете растений участвуют одинаковые плюс-пяти петли обратной связи [47]. Такая же петля положительной обратной связи присутствует у CaWRKY40 и CaWRKY6, CaWRKY40 и CabZIP63, CaWRKY40 и CaCDPK15. В предыдущих исследованиях также было обнаружено, что CaWRKY6 [44] и CabZIP63 [16] непосредственно и транскрипционно участвуют в регуляции экспрессии CaWRKY40 против RSI. Учитывая эти результаты, можно предположить, что CaWRKY40 может координироваться различными ТФ. В заключение, экспрессия CaWRKY40 совместно регулируется CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY30 и CabZIP63 при RSI, а экспрессия CaWRKY40 регулируется CaWRKY6 и CabZIP63, но не CaWRKY30 в перце после воздействия высокой температуры.

4. Материалы и методы

4.1. Растительные материалы и условия роста

Семена сортов перца «Мекси» и Nicotiana benthamiana были получены из Института сельскохозяйственных исследований Аюба, Фейсалабад, Пакистан. Семена перца и N. benthamiana высаживали в пластиковые горшки с почвенной смесью [торфяной мох и перлит; 2/1 (об./об.)] и хранили в комнате для выращивания в контролируемых условиях, т. е. при температуре 25 ◦ C, интенсивности света 60–70 мкмоль фотонов м-2 с-1 и относительной влажности 70% при 16-часовом освещении/8. ч темный фотопериод.

4.2. Генерация векторов

Для создания векторов использовался метод шлюзового клонирования. Для конструирования сателлитных векторов полноразмерную ORF CaWRKY30 (с терминальным кодоном или без терминального кодона) клонировали во входной вектор pDONR207 с использованием реакции BP. После этого эту конструкцию переносили в векторы назначения pMDC83, CD3687 (HA-метка), CD3688 (флаг-метка) и Pk7WG2 путем проведения реакции LR для создания векторов для субклеточной локализации и сверхэкспрессии соответственно.

Для конструирования векторов для VIGS был выбран фрагмент 364 п.н. в 30 -нетранслируемой области (UTR) CaWRKY30, и специфичность была подтверждена с помощью BLAST в отношении последовательности генома в базе данных CM334 (http://peppergenome.snu. ac.kr/ (по состоянию на 29 октября 2021 г.)) и Zunla-1 (http://peppersequence.genomics.cn/page/species/blast.jsp (по состоянию на 29 октября 2021 г.)). Затем проводили реакцию BP для клонирования этого фрагмента в pDONR207/201, после чего эту конструкцию переносили в вектор PYL279 путем проведения реакции LR.

4.3. Процедуры выращивания патогенов и инокуляции

Мы выделили совместимый вирулентный штамм R. solanacearum из растений перца, зараженных Ralstonia, из Дера Гази Хан, Пакистан. Метод хлорида тетразолия использовали для очистки экссудатов надземной части сосудистой ткани пораженных патогеном растений [9,45]. Выделенный R. solanacearum культивировали в среде SPA в терморегулируемом шейкере (200 г картофеля, 20 г сахарозы, 3 г говяжьего экстракта, 5 г триптона и 1 л бидистиллированной воды) при 200 об/мин и 28 ◦C в течение с ночевкой. Далее культивируемый штамм R. solanacearum центрифугировали при 6500 мкм и 28°С в течение 10 мин. Жидкий супернатант после центрифугирования сливали, а осадки на дне центрифужной пробирки разводили стерилизованным 10 мМ раствором MgCl2. Плотность бактериальных клеток доводили до 108 КОЕ мл-1 (OD600=0,8).

Для изучения влияния RSI на уровни транскрипции CaWRKY30 и на устойчивость растений перца к атаке R. solanacearum верхний третий лист растений перца инфильтрировали 10 мкл раствора R. solanacearum с помощью шприца без иглы. Образцы листьев, обработанных патогенами, собирали в определенные моменты времени для экспериментов по гистохимическому окрашиванию (например, окрашиванию DAB или окрашиванию трипановым синим), электропроводности, КОЕ и экстракции РНК для дополнительных экспериментов. Для эксперимента по фенотипированию CaWRKY30-молчащих и немолчащих растений корни повреждали с помощью стеклянной палочки и инфильтрировали совместимым вирулентным R. solanacearum. Растения содержали в ростовой камере в контрольных условиях при температуре 28 ± 2 ◦C, интенсивности света 60–70 мкмоль фотонов м–2 с–1, относительной влажности 70 % и при 16-освещении/{{12} }}h темный фотопериод после инокуляции R. solanacearum. Изображения фенотипа были получены после RSI через определенные промежутки времени.

4.4. Некорневая подкормка фитогормонов

Для изучения действия фитогормонов здоровые растения перца опрыскивали 100 мкМ ЭТГ, 100 мкМ АБК и 1 мМ СК на стадии четырех листьев. Имитационные (контрольные) растения обрабатывали стерильной ddH2O. Образцы, обработанные фитогормонами, собирали в нужные моменты времени для выделения РНК и дальнейшего исследования.

4.5. Исследование субклеточной локализации CaWRKY30

Клетки Agrobacterium, имеющие 35S:CaWRKY30-GFP или 35S:GFP (контроль), культивировали в течение ночи в среде LB, содержащей соответствующие антибиотики. Среду для культивирования центрифугировали при 6500 об/мин, сливали жидкий супернатант, а осадок на дне разводили в индукционной среде (10 мМ MES, 10 мМ MgCl2, pH 5,7 и 150 мкМ ацетосирингона) и устанавливали на OD{{ 10}}.8. Агробактерии, содержащие 35S:CaWRKY30-GFP и 35S:GFP, вводили в листья N. benthamiana с помощью шприца без иглы. Ранее описанный метод был использован для окрашивания 4,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) [9]. При 48 лс наблюдали сигналы флуоресценции GFP и DAPI, а изображения получали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа (TCS SP8, Leica, Solms, Германия) с длиной волны возбуждения 488 нм и полосой пропускания 505–530 нм. фильтр.

4.6. Гистохимическое окрашивание

Гистохимическое окрашивание (трипановый синий и 3, 30 -диаминобензидин) проводили, как описано ранее [9,11,79]. Для окрашивания трипановым синим листья перца кипятили в растворе трипанового синего (10 мл молочной кислоты, 10 мл глицерина, 10 мл фенола, 40 мл этанола, 10 мл ddH2O, 1 мл трипанового синего) в течение 30 мин. Затем листья выдерживали при комнатной температуре в течение 8 ч, затем погружали в раствор хлоралгидрата (2,5 г хлоралгидрата растворяют в 1 мл дистиллированной воды) и обесцвечивали кипячением в течение 30 мин. Раствор хлоралгидрата несколько раз меняли для снижения фона, а затем образцы помещали в 70-процентный глицерин. Листья помещали в раствор DAB с концентрацией 1 мг/мл на ночь для анализа окрашивания DAB. Окрашенные DAB листья кипятили в смеси молочная кислота:глицерин:абсолютный этанол [1:1:3 (об./об./об.)] и затем обесцвечивали в абсолютном этаноле в течение ночи [80]. Снимки листьев, окрашенных трипановым синим и DAB, были сделаны с помощью камеры и светового микроскопа (Leica, Wetzlar, Германия).

4.7. Замалчивание CaWRKY30 с помощью вирус-индуцированного замалчивания генов (VIGS)

Ранее описанная система вирус-индуцированного подавления генов (VIGS) на основе вируса табачного погремушки (TRV) была применена для подавления CaWRKY30 в растениях перца [47,81,82]. Agrobacterium GV3101, содержащие конструкции PYL192, PYL279-CaWRKY30, PYL279 и PYL279-PDS (OD600=0.8), смешивали в соотношении 1:1. Эту смесь вводили в семядоли 2-недельных растений перца с помощью шприца без иглы. Инфильтрованные растения инкубировали в камере для выращивания в течение 56 ч в темноте при температуре 16 ◦C и относительной влажности 45%, а затем перемещали в камеру для выращивания в контролируемых условиях при 25 ± 2 ◦C, 60–70 мкмоль фотонов/м2. с-1 и относительной влажности 70 процентов при фотопериоде 16 часов света/8 часов темноты.

4.8. CaWRKY30 Преходящая гиперэкспрессия в листьях перца

Клетки Agrobacterium GV3101, содержащие CaWRKY30-Flag и EV, культивировали в среде LB в терморегулируемом шейкере с соответствующими антибиотиками в течение ночи до OD600=1.0. После этого эти Agrobacterium GV3101 центрифугировали при 6000 мкм и 28°С в течение 10 мин. После центрифугирования жидкий супернатант удаляли, а твердый осадок на дне разбавляли до OD600=0,8 в индукционной среде (10 мМ MES, pH 5,4, 10 мМ MgCl2, 200 мкМ ацетосирингона). Эту смесь вводили в листья с помощью шприца без иглы. Эти временно сверхэкспрессированные листья наблюдали на предмет гибели клеток, подобной HR, или образцы собирали для проведения экспериментов по окрашиванию DAB и трипановым синим, а также для выделения РНК для дополнительных экспериментов.

4.9. Экстракция РНК и количественная ОТ-ПЦР в реальном времени

Метод реагента TRIzol (Invitrogen) использовали для выделения тотальной РНК из образцов листьев обработанных растений перца и из образцов проростков. После этого для обратной транскрипции выделенной РНК использовали набор Prime Script RT-PCR (TaKaRa, Далянь, Китай). Для изучения относительных уровней транскрипции генов-мишеней-маркеров был проведен анализ qRT-PCR в реальном времени. Обработка данных проводилась в соответствии с ранее описанными методами [45,82] со специфическими праймерами (дополнительная таблица S3), с использованием инструкций производителя системы ПЦР в реальном времени Bio-Rad (Bio-Rad, Фостер-Сити, Калифорния, США) и Система премиксов SYBR Ex Taq II (TaKaRa Perfect Real Time).

4.10. Оценка ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ПРОВОДИМОСТИ

Электропроводность (утечка ионов) рассчитывалась с использованием описанного ранее метода с небольшими изменениями [44,83]. С помощью дырокола было получено шесть листовых дисков (шириной 4 мм). Диски трижды промывали стерильной ddH2O и мгновенно инкубировали в 10 мл ddH2O. После этого эти листовые диски выдерживали в качалке при слабом встряхивании (60 об/мин) при комнатной температуре в течение 1 часа. Кондуктометр (Mettler Toledo 326 Mettler, Цюрих, Швейцария) использовали для записи данных по электропроводности.

4.11. Иммуно-блоттинг

Для экстракции белка из листьев перца использовали ранее описанную процедуру буфера для экстракции белка [3]. Экстрагированный белок инкубировали в течение ночи с антиНА-агарозой при 4°C (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Для сбора шариков использовали магнитную трещину, которую трижды промывали трис-буферным солевым раствором (TBS) и твином 20 (0,05%). Элюированный белок наблюдали с помощью иммуноблоттинга и анти-НА-пероксидазы (Abcam, Кембридж, Великобритания).

5. Выводы

В заключение мы считаем, что CaWRKY30 транскрипционно активирует иммунитет перца против RSI. Замалчивание CaWRKY30 с помощью VIGS снижало иммунитет растений перца к инфекции бактериальными патогенами, тогда как временная сверхэкспрессия CaWRKY30 индуцировала устойчивость к R. solanacearum. В совокупности формирование петли положительной обратной связи и ее параллельное функционирование с другими ТФ является убедительным доказательством ее активации при биотическом стрессе. Кроме того, мы предлагаем создание стабильных трансгенных растений перца CaWRKY30 и целевого белка CaWRKY30, чтобы всесторонне объяснить роль этого гена в борьбе с бактериальными патогенами, а также в различных метаболических путях.

Вклад автора:

Концептуализация, АХ, МИК, МА, БСА, ЗЛ и АТКЗ; Курирование данных, AH, MIK и AME-S.; Формальный анализ, ZL и SF; Приобретение финансирования, AH, MIK, MAAA, MA, BSA, AME-S. и АТКЗ; Администрация проекта, AH и MIK; Ресурсы, Ач; Валидация, СМ; Визуализация, СМ и СФ; Написание — первоначальный вариант, АХ и МИК; Написание — рецензирование и редактирование, IRN, MAAA, MA, BSA, AME-S., ZL, SF и ATKZ Все авторы прочитали и согласились с опубликованной версией рукописи.

Финансирование:

Главный автор выражает огромную благодарность Комиссии по высшему образованию Пакистана за финансовую помощь в проведении этого исследования в рамках гранта SRGP № 21-2651/SRGP/HRD/HEC/2020. Текущая работа финансировалась Исследователями Таифского университета, номер проекта поддержки (TURSP2020/245), Таифский университет, Таиф, Саудовская Аравия. Исследование также было поддержано проектом Фонда развития Фуцзяньского университета сельского и лесного хозяйства (CXZX2018114, CXZX2020008A и CXZX2019024G).

Заявление Институционального контрольного совета: неприменимо.

Заявление об информированном согласии: неприменимо.

Заявление о доступности данных: все данные содержатся в рукописи и ее дополнительных файлах.4

Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Рекомендации

1. Ариф М.; Атта, С .; Башир, Массачусетс; Хан, Мичиган; Хуссейн, А .; Шахджахан, М .; Альвахиби, MS; Эльших М.С. Влияние сроков внесения фосетилалюминия на подавление головни карнала и экономическую отдачу мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.). PLoS ONE 2021, 16, e0244931.

2. Халофах, А.; Хан, Мичиган; Ариф, М .; Хуссейн, А .; Улла, Р.; Ирфан, М .; Махпара, С.; Шах, RU; Ансари, МДж; Кинтл, А. Глубокое внесение азотных удобрений повышает урожайность, эффективность использования азота и экономическую отдачу от пересаженного мелкого риса. PLoS ONE 2021, 16, e0247529. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

3. Номан, А.; Хуссейн, А .; Аднан, М.; Хан, Мичиган; Ашраф, М.Ф.; Зайнаб, М.; Хан, К.А.; Грэм, HA; Он, С. Новый фактор транскрипции MYB CaPHL8 дает представление об эволюции иммунитета перца против почвенного патогена. микроб. Патог. 2019, 137, 103758. [CrossRef] [PubMed]

4. Хусейн, А.; Номан, А .; Хан, Мичиган; Зайнаб, М.; Акил, М .; Анвар, М .; Ашраф, М.Ф.; Лю, З .; Раза, А .; Махпара, С. Молекулярная регуляция врожденного иммунитета и стрессоустойчивости перца: обзор WRKY TF. микроб. Патог. 2019, 135, 103610. [CrossRef] [PubMed]

5. Реболедо, Г.; Агорио, объявление; Виньяле, Л.; Батиста-Гарсия, РА; де Леон, И.П. Транскрипционное профилирование выявляет консервативные и видоспецифичные защитные реакции растений во время взаимодействия Physcomitrium patens с Botrytis cinerea. Завод Мол. биол. 2021, 1–21. [Перекрестная ссылка]

6. Аэртс, Н.; Мендес, член парламента; van Wees, SC Множественные уровни перекрестных помех в гормональных сетях, регулирующих защиту растений. Плант Дж. 2021, 105, 489–504. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

7. Лю З.; Ши, Л.; Венг, Ю .; Цзоу, Х .; Ли, Х .; Ян, С .; Цю, С .; Хуанг, X .; Хуанг, Дж.; Hussain, A. ChiIV3 действует как новая мишень WRKY40 для опосредования иммунитета перца против инфекции Ralstonia solanacearum. Мол. Взаимодействие растений и микробов. 2019, 32, 1121–1133. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

8. ул Хак, Мичиган; Макбул, мм; Али, А .; Фарук, С.; Хан, С .; Саддик, MS; Хан, К.А.; Али, С .; Хан, Мичиган; Хуссейн, А. Оптимизация геометрии посадки для системы совмещения ячменя и египетского клевера в полузасушливом субтропическом климате. PLoS ONE 2020, 15, e0233171.

9. Хуссейн, А.; Ли, Х .; Венг, Ю .; Лю, З .; Ашраф, М.Ф.; Номан, А .; Ян, С .; Ифнан, М .; Цю, С .; Yang, Y. CaWRKY22 действует как положительный регулятор реакции перца на Ralstonia solanacearum, образуя сети с CaWRKY6, CaWRKY27, CaWRKY40 и CaWRKY58. Междунар. Дж. Мол. науч. 2018, 19, 1426. [CrossRef] [PubMed]

10. Мухтар М.С.; Лю, Х .; Somssich, IE Выяснение роли WRKY27 в мужском бесплодии у арабидопсиса. Сигнал завода. Поведение 2018, 13, e1363945. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

11. Хан, М.И.; Чжан, Ю .; Лю, З .; Ху, Дж.; Лю, К.; Ян, С .; Хуссейн, А .; Ашраф, М.Ф.; Номан, А .; Shen, L. CaWRKY40b в перце действует как негативный регулятор в ответ на Ralstonia solanacearum, напрямую модулируя защитные гены, включая CaWRKY40. Междунар. Дж. Мол. науч. 2018, 19, 1403. [CrossRef] [PubMed]

12. Юльгем Т.; Somssich, IE Сети факторов транскрипции WRKY в передаче сигналов защиты. Курс. мнение биол. растений 2007, 10, 366–371. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

13. Бакши М.; Эльмюллер, Р. Факторы транскрипции WRKY: Мастер на многие руки в растениях. Сигнал завода. Поведение 2014, 9, е27700. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

14. Сюй Ю.-П.; Сюй, Х .; Ван, Б.; Вс, X.-Д. Кристаллические структуры N-концевых факторов транскрипции WRKY и ДНК-комплексов. Белковая клетка 2020, 11, 208–213. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

15. Чен, X.; Ли, К .; Ван, Х .; Guo, Z. Факторы транскрипции WRKY: эволюция, связывание и действие. фитопат. Рез. 2019, 1, 13. [Перекрестная ссылка]

16. Шен, Л.; Лю, З .; Ян, С .; Ян, Т .; Лян, Дж.; Вен, Дж.; Лю, Ю.; Ли, Дж.; Ши, Л.; Tang, Q. Pepper CabZIP63 действует как положительный регулятор во время Ralstonia solanacearum или воздействия высокой температуры и высокой влажности в петле положительной обратной связи с CaWRKY40. Дж. Эксп. Бот. 2016, 67, 2439–2451. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

17. Шлуттенхофер, К.; Юань, Л. Регулирование специализированного метаболизма факторами транскрипции WRKY. Завод Физиол. 2015, 167, 295–306. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

18. Цзян, Дж.; Ма, С .; Е, Н .; Цзян, М .; Цао, Дж.; Чжан, Дж. Факторы транскрипции WRKY в реакциях растений на стрессы. Дж. Интегр. биол. растений 2017, 59, 86–101. [Перекрестная ссылка]

19. Ю, К.; Питерс, см; Баккер, Пенсильвания; Берендсен Р.Л. Полезные микробы уходят в подполье корневого иммунитета. Окружающая среда растительной клетки. 2019, 42, 2860–2870. [Перекрестная ссылка]

20. Номан, А.; Лю, З .; Ян, С .; Шен, Л.; Хуссейн, А .; Ашраф, М.Ф.; Хан, Мичиган; Он, С. Экспрессия и функциональная оценка CaZNF830 во время реакции перца на Ralstonia solanacearum или высокую температуру и влажность. микроб. Патог. 2018, 118, 336–346. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

21. Номан, А.; Хуссейн, А .; Ашраф, М.Ф.; Хан, Мичиган; Лю, З .; Он, S. CabZIP53, является мишенью CaWRKY40 и действует как положительный регулятор защиты перца от Ralstonia solanacearum и термотолерантности. Окружающая среда. Эксп. Бот. 2019, 159, 138–148. [Перекрестная ссылка]

22. Ашраф, М.Ф.; Ян, С .; Ву, Р .; Ван, Ю.; Хуссейн, А .; Номан, А .; Хан, Мичиган; Лю, З .; Цю, А .; Гуань, Д .; и другие. Capsicum annuum HsfB2a положительно регулирует реакцию на инфекцию Ralstonia solanacearum или высокую температуру и высокую влажность, формируя транскрипционный каскад с помощью CaWRKY6 и CaWRKY40. Физиология клеток растений. 2018, 59, 2608–2623. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

23. Ван, Л.; Досса, К.; Вы, Дж .; Чжан, Ю .; Ли, Д.; Чжоу, Р .; Ю, Дж.; Вэй, X .; Чжу, X .; Цзян, С.; и другие. Секвенирование временного транскриптома с высоким разрешением раскрывает ERF и WRKY как главных игроков в регуляторных сетях, лежащих в основе реакции кунжута на заболачивание и восстановление. Геномика 2021, 113, 276–290. [Перекрестная ссылка]

24. Ян, X.; Чжоу, З .; Фу, М.; Хан, М .; Лю, З .; Чжу, К.; Ван, Л.; Чжэн, Дж .; Ляо, Ю .; Чжан, В .; и другие. Полнотранскриптомная идентификация генов семейства WRKY и профилирование их экспрессии по отношению к салициловой кислоте у Camellia japonica. Сигнал завода. Поведение 2021, 16, 1844508. [CrossRef] [PubMed]

25. Первез М.; Бабар, М.; Икбал, Дж.; Хаснаин, М .; Аббас, С.; Шах, С.; Ашраф, М. Структурный и функциональный анализ In Silico генов Wrky1 и Wrky3 в выбранных зерновых культурах. Дж. Аним. Plant Sci.-JAPS 2021, 31, 322–341.

26. Лю, З.-К.; Лю, Ю.-Ю.; Ши, Л.-П.; Ян, С .; Шен, Л.; Ю, Х.-Х.; Ван, Р.-З.; Вэнь, Дж.-Ю.; Тан, Q .; Хуссейн, А .; и другие. SGT1 необходим для PcINF1/SRC2-1-индуцированного защитного ответа перца путем взаимодействия с SRC2-1. науч. Отчет 2016, 6, 21651. [CrossRef] [PubMed]

27. Сринивасан, К. Биологическая активность красного перца (Capsicum annuum) и его острый принцип капсаицин: обзор. крит. Преподобный Food Sci. Нутр. 2016, 56, 1488–1500. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

28. Лю З.; Ши, Л.; Ян, С .; Лин, Ю.; Венг, Ю .; Ли, Х .; Хуссейн, А .; Номан, А .; Он, С. Функциональный и промоторный анализ ChiIV3, хитиназы растения перца, в ответ на инфекцию Phytophthora capsici. Междунар. Дж. Мол. науч. 2017, 18, 1661. [CrossRef] [PubMed]

29. Али, М.; Луо, Д.-Х.; Хан, А .; Хак, SU; Гай, В.-Х.; Чжан, Х.-Х.; Ченг, Г.-Х.; Мухаммад, И.; Гонг, З.-Х. Классификация и полногеномный анализ семейства генов хитин-связывающих белков у перца (Capsicum annuum L.) и транскрипционная регуляция Phytophthora capsici, абиотических стрессов и гормональных воздействий. Междунар. Дж. Мол. науч. 2018, 19, 2216. [CrossRef] [PubMed]

30. Номан, А.; Лю, З .; Акил, М .; Зайнаб, М.; Хан, Мичиган; Хуссейн, А .; Ашраф, М.Ф.; Ли, Х .; Венг, Ю .; Он, С. Основные факторы транскрипции домена лейциновой молнии: авангард иммунитета растений. Биотехнолог. лат. 2017, 39, 1779–1791. [Перекрестная ссылка] [PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com