Глава 5 Изменения в активности фермента во время ферментации фермента

Глава 5 Изменения в активности фермента во время ферментации фермента

 

Протеаза, Липаза исупероксиддисмутаза (СОД)являются основными функциональными ферментамиМикробные ферменты здоровья пищиПолем Среди них,протеазаиграет роль вспособствуя гидролизу белка в пищев человеческом теле. Кроме того, он также может разложить некоторые умирающие клетки, удалять грязь на поверхности кожи и пор и играть роль в отшелушивании, поэтому она широко используется в продуктах для ванны. Липаза действует на сложную связь между жирными кислотами и глицерином, а подложка гидролиза, как правило, является натуральным маслом. Следовательно, это видно во многих продуктах для похудения и продуктах для здоровья. Многие женщины чрезвычайно обеспокоены темой похудения, поэтому ферменты быстро стали популярными во всем мире.Ферменты богаты липазой, что означает, что они имеют высокую исследовательскую стоимость и перспективы применения.ДЕРНявляется специальным металлическим ферментом, который катализирует реакцию смягчениясупероксидные анионные радикалы, тем самымудаление супероксидных анионных радикаловв теле. Это защитный барьер для организмов, поэтому он широко используется в медицинской сфере.
Эта глава принимает яблочный фермент в качестве примера. Начиная с начальной стадии ферментации,деятельность супероксиддисмутазы, амилаза, липаза, протеаза и целлюлаза в экспериментальной группе и контрольной группе измеряли каждые 15 дней, чтобы всесторонне и систематически отражать изменяющуюся тенденцию ферментативной активности в течение всего процесса ферментации.

Новые травы Cistanche

Нажмите, чтобы получить более подробную информацию

 

Поддерживающая служба Wecistanche-крупнейшего экспортера Cistanche в Китае:
Электронная почта: wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp/tel: +86 15292862950

 

 

 

 

 

 

5.1 Материалы и методы

5.1.1 Материалы

(1) Экспериментальные материалы

Вымойте свежие яблоки со стерильной водой в стерильных условиях, высушите их на стерильном рабочем столе, очистите их и нарежьте их для последующего использования. Добавьте белый сахар и яблоки в стерилизованную стеклянную банку при массовом соотношении 1: 1. Активируйте бактерии, необходимые для эксперимента, и прививайте их в фермент в соответствии с оптимальной схемой (этот шаг операции опущен для контрольной группы), запечатайте его и поместите в прохладное и сухое место. После 3 месяцев ферментации комнатной температуры, возьмите образец, чтобы получить всю ферментную жидкость, содержащую мякоть, и отфильтровать ее. Возьмите супернатант в качестве экспериментального образца. После того, как образец центрифугируется в 10, 000 об / мин в течение 15 минут в высокоскоростной центрифуге, он используется для измерения соответствующих данных. Стоит отметить, что в процессе создания ферментов, чтобы избежать ненужного загрязнения, все наши операции проводились в стерильных условиях.

(2) Основные инструменты
Инструменты, необходимые для эксперимента, такие же, как 3.1.1 (2).

 

5.1.2 Методы

(1) Определение активности супероксиддисмутазы (SOD) [66]
Раствор пирогаллола предварительно разогревали в водяной бане с постоянной температурой 25 градусов в течение определенного периода времени. Согласно таблице 5.1, в пробирку добавляли соответствующее количество буфера, дистиллированной воды и того же объема соляной кислоты или пирогаллолового раствора. Постоянная температурная водяная баня была установлена ​​на 25 градусов на 2 0 мин. После того, как смешанная жидкость была быстро встряхнута, ее немедленно вводили в кювету. Значение поглощения A0 образца измеряли каждые 30 секунд на длине волны 325 нм с использованием спектрофотометра.

Tab.5.1 Добавить количество смежного бензола три фенола -реагента для определения скорости автоокисления

 

Метод определения активности SOD в основном такой же, как вышеуказанная операция. Единственное отличие состоит в том, что перед добавлением пирогаллола, {{0}}. 5 мл раствора образца фермента различных концентраций необходимо добавить первым. В то же время добавляется тот же объем дистиллированной воды. Измеренная абсорбция - это asod. Скорость ингибирования и активность фермента SOD рассчитываются в соответствии с формулой 5.1 и формулой 5.2: скорость ингибирования (%)=(△ a 0- △ asod)/△ a 0 × 100 (5,1) Активность энзим (U/ML)=inbytion inbyction inbyction inbyme vecmy vextiction vise inbytition inbytition vize inbytic nhiby nhiby nhiby nhiby nhiby nhiby nhiby nhiby nhiby. (5.2) где: v1 - общий объем раствора, ML; V2 - это объем раствора образца фермента, ML; △ A0-это скорость автоокисления пирогаллола; △ ASOD - это скорость изменения значения поглощения образца; n-разбавление множественное (2) определение активности амилазы В этом исследовании использовался колориметрический метод йода-крахвала для определения активности амилазы. Конкретные этапы операции относятся к «процедуре национальной клинической лабораторной работы» [67]. В основном разделен на следующие два пункта:

 

① Подготовка решения
Решение буферированного крахмала ({{0}}. 4g/l): точно взвешивать 9 г хлорида натрия, 22,6 г грибового фосфата водорода, и 12,5 г яркого дихидрида -гидриума, растворяя их в 5 {15} {{16} {16} раствор кипит; Точно весите 0,4 г растворимого крахмала, растворите его в 10 мл дистиллированной воды, равномерно перемешайте и приспособитесь к пасте; Введите раствор крахмала, регулируемый в пасту в вышеуказанный кипящий раствор, и многократно промойте стакан, пока крахмал не будет полностью перенесен в раствор кипящей воды. После равномерного помешивания стеклянным стержнем, охлаждать до комнатной температуры, добавьте 5 мл 37% формальдегида и разбавьте до 1 л дистиллированной водой. Значение pH раствора составляет 7,0 ± 0,1, и оно помещается в холодильник для использования.
Йодиновое исходное решение (0. 1 моль/л): точно весит 1,7835 г йодата калия и йодид калия 22,5 г в чистых 500 мл
Слух, медленно и равномерно добавляю 4,5 мл концентрированной соляной кислоты, непрерывно перемешивая во время процесса добавления, разбавляйте по шкале дистиллированной водой и равномерно перемешивайте. Поместите его в холодильник для использования и храните его в бутылке коричневого реагента.
Решение приложения йода ({{0}}. 01MOL/L): возьмите определенное количество йодового исходного раствора (0,1 моль/л), разбавьте его 10 раз дистиллированной водой, поместите его в холодильник для использования и храните его до 1 месяца.

② Экспериментальные этапы работы
Возьмите раствор фермента и разбавьте его 10 раз с физиологическим раствором и работайте в соответствии с таблицей 5.2. Хорошо перемешайте, длина волны спектрофотометра составляет 660 нм, а легкий путь колориметрической чашки составляет 10 мм. Ноль с дистиллированной водой и считывайте поглощение каждой трубки. Рассчитайте активность амилазы на основе основной формулы расчета 5.3.

 

Tab.5.2.

 

(3) Определение активности липазы

Метод определения проводился в соответствии с QB/T {{0}} [68]. 2% тестового раствора фермента готовили с 0. 0 25 моль/л фосфатного буфера (рН 7,5), фенолфталеин использовали в качестве индикатора, а жирные кислоты титровали стандартным раствором гидроксида натрия. Активность липазы рассчитывали на основе объема гидроксида натрия, потребляемого в эксперименте. Правило: при рН 7,5 и температуре окружающей среды 40 градусов, 1 мл раствора жидкого фермента гидролизует липазу в течение 1 мин, образуя 1 мкмоль жирной кислоты, которая представляет собой единицу активности липазы, экспрессируемой в виде U/мл. Затем активность липазы рассчитывали в соответствии с формулой 5.4: Активность фермента (U/ML)=(BA) × C/0,05 × 50 × 1/15 × N=200/3 × (BA) × C × N (5,4), где: B является объемом GOLIUM Gydroxide Slander Solution Contrensed Solution, M; Ml; A - объем стандартного раствора гидроксида натрия, потребляемого в пустой контрольной группе, ML; C - концентрация стандартного раствора гидроксида натрия, моль/л; 0,05 является коэффициентом преобразования концентрации стандартного раствора гидроксида натрия; 50 - содержание жирных кислот в растворе гидроксида натрия; 15 минут - время реакции; n - это разбавление множество.

(4) Определение активности протеазы

См. GB/T 23527-2009 [69] с небольшими модификациями.
① Подготовка стандартной кривой
Возьмите 1 мл стандартного раствора тирозина с различными массовыми концентрациями, которые являются 0, 1 0, 20, 30, 40 и 50 мг/л и добавьте 5 мл раствора карбоната натрия 0,4 моль/л и 1 мл реагента Фалин. Реагируйте на 20 минут при температуре 40 градусов. После завершения реакции удалите реакционный раствор и измерьте значение поглощения раствора на длине волны 680 нм с помощью спектрофотометра. Нарисуйте стандартную кривую тирозина с концентрацией тирозина в качестве горизонтальной оси и значения поглощения в качестве вертикальной оси.

Новые травы Cistanche с сильной антиоксидантной силой

② Определение активности протеазы
Экспериментальная группа: взять 1 мл раствора казеина с концентрацией 10 г/л и равномерно смешайте с 1 мл из образца раствора, который будет протестирован, и реагируйте на 10 минут при температуре окружающей среды 40 градусов; Отфильтруйте и получите фильтрат после стояния, возьмите 1 мл фильтрата, 5 мл раствора карбоната натрия и 1 мл реагента фолина, равномерно перемешайте и отреагируйте на 20 минут при температуре окружающей среды 40 градусов; Используйте спектрофотометр для измерения значения поглощения раствора на длине волны 680 нм.
Пустое контрольная группа: возьмите 1 мл из образца раствора, который будет протестирован, добавьте трихлоуксусную кислоту, полностью реагируйте на инактивацию протеазы, а другие методы работы такие же, как и экспериментальная группа.

Рассчитайте активность протеазы в соответствии с формулой 5.5:
Активность протеазы (U/ML)=AK × 4/10 (5,5) где: A - поглощение раствора фермента в экспериментальной группе; K - это количество тирозина, когда поглощение равна 1; 4 - общий объем реакционного раствора, ML; 10 - время реакции, мин.

(5) Определение активности целлюлазы [70]

Активность целлюлазы в ферментах, как правило, экспрессируется количеством глюкозы, высвобождаемой определенным количеством раствора фермента на единицу времени. Принцип использования метода фильтровальной бумаги для измерения активности целлюлазы заключается в том, что целлюлаза может разложить целлюлозу в фильтровальной бумаге с образованием вторичных метаболитов, таких как глюкоза, а глюкоза может реагировать с 3, 5- динитросалицициловой кислотой с образованием желтого комплекса. Цвет этой реакции относительно яркий, что может хорошо определить количество полученных глюкозы и других полученных сахаров.

 

①3, 5- динитросалициловая кислота колориметрический агент
Точно весите 1 0 g 3, 5- динитросалициловая кислота с температурой плавления 168-169 градуса, растворите ее дистиллированной водой, добавьте 20 г гидроксида натрия и 200 г тартрата натрия, продолжая нагревать до 200ml с добавлением. Из безводного сульфита натрия непрерывно перемешайте во время процесса добавления до тех пор, пока он не будет полностью растворится, остановите нагрев после равномерного перемешивания, охлаждайте до комнатной температуры, переносит все в объемную колбу 1000 мл, разбавляйте до отметки с дистиллированной водой, поместите при комнатной температуре в течение одной недели, отфильтруйте, получайте супернатант и храните в коричневой реакционной бутылке.②enzymatic Hydrolysis
Точная пипетка {{0}}, 0. 5, 1. 0, 1,5, 2,0 мл раствора образца фермента в 2 мл актеологического ацетатного раствора ацетата уксусного кислоты со значением pH 4,5. Через 5 минут постоянной температуры водяной бани при 40 градусов добавьте 6 кусочков хроматографической фильтрованной бумаги с площадью 1 × 1 см2 соответственно, и немедленно запустите время, чтобы время реакции точным до 60 минут. Немедленно перенеситесь в ванну с кипящей водой для реакции в течение 10 минут, и целлюлаза теряет свою активность.

 

 

③ Цветовая реакция
Возьмите раствор для образца фермента, добавьте 3 мл 3, 5- колориметрический агент динитросалициловой кислоты, приготовленный в ①, нагревать в ванной кипящей воде в течение 15 минут, вынуть, охладить до комнатной температуры, добавьте 10 мл дистиллированной воды, смешивайте равномерно, используйте спектрофотометр на длине волны 550 Нм, отрегулируйте пустую контрольную группу, чтобы поглотить его поглощение.
④ Рисование стандартной кривой глюкозы
Приготовьте стандартное решение глюкозы с точной концентрацией 1 мг/мл, и используйте дистиллированную воду, чтобы сделать стандартное решение глюкозы с томом 0, 0. 2, 0. 4, {{6}. 6, 0. 8, 1, 1, 1, 1 и 1,4 и 1 -й. из 3, 5- колориметрический агент динитросалициловой кислоты, приготовленный в ① для выполнения реакции развития цвета. Постройте стандартную кривую с концентрацией глюкозы в качестве горизонтальной оси и поглощения в качестве вертикальной оси.
⑤calculation
Используйте значение поглощения A после развития цвета с помощью раствора фермента, а затем вычислите количество высвобождения глюкозы в соответствии со стандартной кривой глюкозы и вычислите в соответствии с формулой 5.6:
Активность целлюлазы (U/ ML)=M/ (t · M) (5.6) Где: m - количество высвобождения глюкозы, UG; t - время ферментативного гидролиза, мин; M - содержание фермента в реакции, UC/мл.