Исследование микробных ферментов, продуцируемых во время комбинированной бактериальной ферментации и их биологической активности ⅲ

Глава 3 Изучение антиоксидантной активности ферментов

 

Было доказано, что многие заболевания человека связаны сактивный кислород и свободные радикалы, такой каквоспаление, артериосклероз,старение, диабет, рак, и т. д.Чрезмерные свободные радикалыВ организме может вызвать денатурацию белка, повреждение клеток и смерть, а также даже патологические изменения в организме. Таким образом, многие исследования в домашних условиях и за рубежом ищут продукты, богатые натуральными антиоксидантными ингредиентами, для предотвращения и регулирования заболеваний, вызванных свободными радикалами, посредством диеты. Сегодня, с растущими стандартами жизни, люди постепенно смещают свое внимание на свои тела, поэтому все больше и больше продуктов для здоровья появляются в бесконечном потоке. Однако нелегко быть по -настоящему полезным. Ферменты - это своего рода еда, которая может быть сделана сами в жизни людей. Стоимость не очень высока, и есть много преимуществ.
Микробные ферменты имеют различные функции здоровья, такие как антибактериальные и противовоспалительные, способствующие метаболизму, улучшение иммунитета, отбеливание и антивозрастное, детоксикация и противораковое выражение. В настоящее время существует относительно мало исследований по антиоксидантным свойствам микробных ферментов дома и за рубежом, поэтому мы планируем провести углубленные исследования на них. Эта статья принимает яблочный фермент в качестве объекта исследования и использует общее содержание фенола, снижение мощности, DPPH · свободные радикалы, · ОН свободные радикалы, супероксид свободных радикалов и способность по удалению свободных радикалов ABTS в качестве определения индексов для проведения всеобъемлющего и систематического исследования энзирования Apple после ферментации в течение 3 месяцев. Были изучены состав и содержание антиоксидантных активных ингредиентов, и его антиоксидантная активность была понята.

Новые травы Cistanch с гораздо большей антиоксидийной мощностью, чем ферментация бактерий

Поддерживающая служба Wecistanche-крупнейшего экспортера Cistanche в Китае:
Электронная почта: wallence.suen@wecistanche.com
WhatsApp/tel: +86 15292862950

 

 

 

 

3.1 Материалы и методы

3.1.1 Материалы

(1) Экспериментальные материалы
Вымойте свежие яблоки со стерильной водой в стерильных условиях, высушите их в стерильном рабочем столе, очистите их и нарежьте их для последующего использования. Добавьте белый сахар и яблоки в стерилизованную стеклянную банку в массовом соотношении 1: 1. Активируйте бактерии, необходимые для эксперимента, и прививайте их в фермент в соответствии с оптимальной схемой (этот этап операции опущен в контрольной группе), запечатайте его и поместите в прохладное и сухое место. Через 3 месяца ферментации комнатной температуры, возьмите образец, чтобы получить всю ферментную жидкость, содержащую мякоть, и отфильтруйте ее. Возьмите супернатант в качестве экспериментальной выборки и центрифугируйте выборку при 10000 об / мин в течение 15 минут в высокоскоростной центрифуге, прежде чем определить соответствующие данные. Стоит отметить, что в процессе создания ферментов, чтобы избежать ненужного загрязнения, все наши операции выполняются в стерильных условиях.

(2) Основные инструменты
Спектрофотометр: v -1100, Шанхайский фабрика научных инструментов;
Постоянная температурная водяная баня: HH -2, Wuhan Litian Technology Technology Instrument Co., Ltd. Другие инструменты такие же, как 2.1.3.

3.1.2 Методы

(1) Определение общего содержания фенола [53]
① Подготовка стандартной кривой:
Точно взвесить {{0}}. 123 г галловой кислоты, растворить ее в небольшом количестве дистиллированной воды и перенесите ее на 5 0 0 ML Volumric Flask, чтобы составить объем. Возьмите 8 Clean 1 {{1 0}} ML Обломаные колбы, добавьте 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2 и 1,4 мл стандартного раствора галловой кислоты, соответственно, разбавлено до отметки с дистиллированной водой, добавить 1 мл из -запланового и 2 мл. 1 мин, прохладно и разбавляет до 20 мл и поместите при комнатной температуре в течение 30 минут. Используйте спектрофотометр для измерения поглощения A на длине волны 650 нм, и нарисуйте стандартную кривую с поглощением A в качестве горизонтальной оси и концентрации образца в качестве вертикальной оси. ② Обнаружение
Добавить дистиллированную воду до 100 мкл, 200 мкл, 300 мкл, 400 мкл и 500 мкл растворов для образцов до 46 мл, затем добавьте 1 мл реагента фолин-фенола, равномерно, реагировать на 3 минуты, затем добавьте 3 мл 20% NACO3, встряхните в постоянной температуре 25-градусной температуры в течение 2H, используйте дистиллированную воду в качестве контроля и поглощено в абиодовом, а также в абоненте, а также в абоненте, а также, а также, а также, а также, поглощайте,-это 76-с набором, а также в норве-на 76-с его абонентом, а также в абонентской-на 76-с набором. спектрофотометр. Общее содержание фенола выражается в виде эквивалентов галловой кислоты, а общее содержание фенола рассчитывается в соответствии со стандартным уравнением кривой.

(2) Анализ сокращения [54]
Add 100μL, 200μL, 300μL, 400μL, and 500μL of sample to 2.5mL of phosphate buffer with a concentration of 0.2mol/L and a pH value of 6.6, then add 2.5mL of potassium ferricyanide (w/v) with a mass concentration of 1%, and react at 50 Степень 30 минут. Затем добавьте 2,5 мл трихлоруксусной кислоты (мас./Об.) С массовой концентрацией 10%и центрифуги при 3000 об/мин в течение 10 минут в высокоскоростной центрифуге. Сразу же после выхода, возьмите 2,5 мл супернатанта в объемную колбу, добавьте 2,5 мл дистиллированной воды и 0,5 мл хлорида железа (мас./Об.) С массовой концентрацией 0,1%. Используйте дистиллированную воду в качестве пустого управления и измерьте поглощение A на длине волны 700 нм, используя спектрофотометр. Сила снижения власти может быть оценена по значению поглощения. Чем выше значение поглощения, тем сильнее уменьшающая сила.

 

(3) Определение эффекта поглощения свободных радикалов супероксида [55]

Возьмите 4,5 мл 0. 0 5 моль/л рН 8,2 буфера Tris-HCl и предварите его в водяной бане 25 градусов для 2 0 мин. Добавьте 1 мл раствора образца фермента с концентрациями 10%, 20%, 30%, 40%и 50%и 0,4 мл от 25 ммоль/л пирогаллольного раствора соответственно. Хорошо перемешайте и отреагируйте в водяной бане 25 градусов в течение 5 минут. Добавить 1,0 мл 8 моль/л HCl, чтобы прекратить реакцию. Используйте буфер TRIS-HCL в качестве эталона и используйте спектрофотометр для измерения поглощения A на длине волны 299 нм для расчета скорости поглощения. Для пустой контрольной группы вместо образца использовалось 1 мл растворителя. Скорость поглощения o 2- была рассчитана в соответствии с формулой 3.1: o 2- Скорость массовой информации (%)=(a 1- a2)/a1 × 100 (3.1), где: a1 является абсорбцией чистой трубы; A2 является поглощением образца.

(4) Определение эффекта удаления гидроксильных радикалов [56]

1 0 0 мкл, 200 мкл, 300 мкл, 400 мкл, 500 мкл раствора для образца добавляли с водой до 2 мл, затем добавляли к 1,4 мл перекиси водорода с молярной массовой концентрацией 6моль/л, а затем добавляют 0,6 мл салицилата на ноде с молярной массовой концентрацией 20моля/L и 2mlation с более воздушным концентрацией с 2 ​​-ммль с более воздушным концентрацией. 1,5 ммоль/л и нагревается в постоянной температурной водяной бане при 37 градусов в течение 1 часа. Приспособитесь к нулю с помощью дистиллированной воды и измерьте поглощение A на длине волны 562 Нм, используя спектрофотометр. Выполните 3 повторения для каждого лечения. Рассчитайте скорость поглощения гидроксильных радикалов в соответствии с формулой 3.2: Скорость поглощения гидроксильных радикалов (%)=[(a 1- a2)/a1] × 100 (3.2) где: A1 - среднее поглощение пробела; A2 - это средняя поглощение раствора образца. (5) Определение эффекта очистки свободных радикалов DPPH [57]

Новые травы Cistanch с гораздо большей антиоксидийной мощностью, чем ферментация бактерий

 

Точная пипетка 2 мл раствора для образца фермента с концентрациями 1 0%, 20%, 30%, 40%и 50%в объемную колбу 10 мл, затем добавьте 2 мл 80%водной водной водной водной водного раствора DPPH. Молярная массовая концентрация составляет 2 × 10-4 моль/л. После смешивания дайте ему стоять при комнатной температуре в течение 30 минут. Используя 80% раствор этанола в качестве эталона, измерьте поглощение образца на длине волны 517 нм, которая регистрируется как A1. Смешайте 2 мл раствора DPPH и 2 мл раствора этанола с массовой концентрацией 80% и измеряйте их поглощение на той же длине волны, которая регистрируется как A0. Смешайте 2 мл раствора фермента и 2 мл раствора этанола с массовой концентрацией 80% и измеряйте их поглощение на той же длине волны, которая регистрируется как A2. Рассчитайте скорость очистки свободных радикалов DPPH в соответствии с формулой 3.3:
DPPH Скорость массового расщепления DPPH (%) {{0}} [1- (a 1- a2)/a 0] × 100 (3.3) где: A1 - это абсорбция 2 мл DPPH 80% ethanol -quebourse -quebourse -quess -rolegous и 2 ml -ini -ni -ni -ni -ni -ni -nemi -reslememememememememe Shayme Shalle -Solеничный решение и 2 MLIME SHAMERE SHAMERESE ROLES -SOLE -SOLE -IIM. A2 представляет собой поглощение смешанного раствора 2 мл раствора фермента и 2 мл 80% этанола с помощью массовой концентрации; A0 представляет собой поглощение смешанного раствора 2 мл раствора DPPH и 2 мл 80% этанола с помощью массовой концентрации.

(6) Способность Free Radical Abts [58]
Добавьте определенное количество сульфата калия в раствор ABTS 7 ммоль/л, пока конечная концентрация смешанного раствора не составит 2,45 ммоль/л. Поместите смешанный раствор в прохладное и сухое место при комнатной температуре в течение 12-16 часов. 1 мкл, 3 мкл, 5 мкл, 7 мкл и 9 мкл раствора образца добавляли до 10 мкл с 5моль/л -фосфатным буфером, а затем смешивали с 10 мл вышеуказанного калия сульфата и смешанного раствора ABTS и позволяли реагировать при температуре реакции 30 градусов и периода реакции 5min. Ноль с дистиллированной водой и измерьте поглощение A на длине волны 734 нм с помощью спектрофотометра. Рассчитайте скорость поглощения свободных радикалов ABTS в соответствии с формулой 3.4:
ABTS Скорость массовой информации Free Radical (%)=[(a 1- a2)/a1] × 100 (3.4) где: a1 - поглощение пустой контрольной группы; A2 является поглощением экспериментальной группы

 

3.2 Результаты и анализ

3.2.1 Общее содержание фенола

(1) Стандартная кривая
Стандартная кривая общего содержания фенола была нарисована с концентрацией галловой кислоты в качестве горизонтальной оси и значения поглощения A в качестве вертикальной оси, как показано на рисунке 3.1.

 

Рис.3.1 Стандартная кривая общего содержания фенола

Из фиг.3.1 мы видим, что стандартное уравнение кривой - y =11. 375x +0. 2593 (x - концентрация образца, y - абсорбция), r 2=0. 9981.

(2) Определение образцов

Результаты общего определения содержания фенола ферментов яблока в контрольной группе и экспериментальной группы в разных концентрациях показаны на фиг.3.2.

 

 

 

Рис.3.2 Кривая общего фенольного содержания

Как показано на фиг.3.2, ферменты яблока как в контрольной группе, так и в экспериментальной группе имеют высокое общее содержание фенола, и оба увеличиваются с увеличением количества добавленного раствора образца. В том же градиенте концентрации общее содержание фенольного фермента яблочного фермента в контрольной группе увеличивалось с 0. 673 мг до 2,8 0 7 мг, а общее содержание фенола в экспериментальной группе увеличилось с 0,961 мг до 4,185 мг. Общее содержание фенола в экспериментальной группе намного выше, чем в контрольной группе, и тенденция к повышению более очевидна. Согласно общему содержанию фенола, общая антиоксидантная активность экспериментальной группы больше, чем у контрольной группы.

 

3.2.2 Снижение мощности

Результаты определения мощности яблочных ферментов в контрольной группе и экспериментальной группе в разных концентрациях показаны на рисунке 3.3.

 

Как показано на рисунке 3.3, изменяющаяся тенденция снижения мощности ферментов яблочных ферментов аналогична изменяющейся тенденции общего содержания фенола. Снижающая мощность экспериментальной группы выше, чем у контрольной группы, и является ли это экспериментальной группой или контрольной группой, в пределах диапазона концентраций, представленных в эксперименте, снижающая мощность показывает тенденцию к увеличению с увеличением количества добавленного решения для образца. Экспериментальные данные также подтвердили, что с точки зрения снижения мощности антиоксидантная активность экспериментальной группы больше, чем у контрольной группы.

 

 

3.2.3 Способность по удалению супероксидных анионов.

Результаты способности экологически чистки яблочных ферментов супероксидных анионов в контрольной группе и экспериментальной группы в разных концентрациях показаны на рисунке 3.4.

Как показано на рисунке 3.4, существует большая разница в способности по удалению свободных радикалов супероксида между экспериментальной группой и контрольной группой. В пределах диапазона концентраций, представленных в эксперименте, способность массового массового удаления супероксидных анионов в экспериментальной группе наиболее значительно изменяется, когда концентрация образца составляет от 10%до 20%, а изменение не очевидно после того, как концентрация превышает 20%; Когда концентрация составляет 50%, способность по удалению супероксидных анионов составляет 85,4%. Способность по удалению супероксидных радикалов, показанная контрольной группой, может быть четко видно из таблицы трендов. По мере увеличения концентрации ферментов эта способность к массовому массову свободных радикалов также увеличивается, медленно изменяется и постепенно имеет тенденцию к стабильному состоянию. Способность по удалению достигает максимум 42,6%. Экспериментальная группа почти в два раза выше контрольной группы.

 

 

3.2.4 Способность к удалению гидроксильных радикалов

Изменения в способности по удалению гидроксильных радикалов ферментов яблочных ферментов в контрольной группе и экспериментальной группе в разных концентрациях показаны на рис. 3.5.

 

 

Рис.3.5 Кривая уборки гидроксилового свободного радикала

 

Из рис. 3.5 видно, что в диапазоне концентраций, представленных в эксперименте, способность ферментов в экспериментальной группе в экспериментальной группе в экспериментальной группе, а контрольная группа увеличилась с увеличением дополнительного количества. Способность экспериментальной группы в экспериментальной группе в экспериментальной группе в экспериментальной группе была ниже, чем в контрольной группе, и она очень плохо работала при низких концентрациях. При высоких концентрациях способность по удалению свободных радикалов гидроксила значительно увеличилась. Причина может заключаться в том, что во время процесса ферментации типы и содержание микроорганизмов в ферментах яблони в экспериментальной группе и контрольной группе были различными, и содержимое вторичных метаболитов и компонентов каждого продукта, полученного с ферментацией

 

3.2.5 DPPH · Способность по удалению свободных радикалов

По сравнению с другими методами обнаружения, способность DPPH · свободных радикалов широко используется для оценки антиоксидантной активности в течение короткого периода времени [59]. Способность DPPH · свободных радикалов по удалению в различных концентрациях была построена в соответствии с результатами контрольной группы и экспериментальной группы яблочных ферментов, как показано на рисунке 3.6.

Как показано на рисунке 3.6, когда концентрация фермента яблочного фермента контрольной группы была ниже 30%, способность DPPH · свободных радикалов составляла менее 50%, но экспериментальная группа яблочного фермента также показала более высокую способность к массовому утилизации DPPH · в низких концентрациях. Экспериментальные результаты показывают, что добавление Aspergillus oryzae, дрожжей, термофильного стрептококка и болгарского лактобацилла полезно для способности к масштабированию свободных радикалов на ферменте. Когда концентрация фермента составляет 50%, эта способность достигает 91,4%, что намного выше, чем 69,8%контрольной группы при той же концентрации.

 

3.2.6 ABTS радикальная способность поглощения

Результаты способности по удалению радикалов ABTS в яблочных ферментах в контрольной группе и экспериментальной группе в разных концентрациях показаны на рис. 3.7.

Рис.3.7 Кривая способности поглощения радикалов ABTS
Из рис. 3.7 видно, что скорость очистки ферментов яблочных ферментов в экспериментальной группе выше, когда количество добавления фермента превышает 5 мкл. Исследование Erel et al. показали, что способность поглощения радикалов ABTS в значительной степени зависит от более высокой концентрации фенольных веществ [60]. Результаты общего определения содержания фенола показали, что общее содержание фенола в экспериментальной группе было выше, чем у контрольной группы. Экспериментальные результаты на рис. 3.7 только что подтвердили, что способность по удалению радикалов ABTS больше, чем у контрольной группы.

 

3.3 Резюме этой главы

В этой главе рассказывается о взаимосвязи между антиоксидантной активностью ферментов яблока, продуцируемых ферментацией с четырьмя выбранными штаммами яблок, концентрацией образцов ферментов и сравнением антиоксидантных активных компонентов и способности по удалению свободных радикалов между экспериментальной группой и контрольной группой. Экспериментальные результаты показывают, что общее содержание фенола фермента яблока в контрольной группе ниже, чем в экспериментальной группе, и его снижение мощности, свободные радикалы супероксидных анионов, свободные радикалы DPPH и способность массового удаления свободных радикалов ABTS, лучше, чем в контрольной группе; Фермент в контрольной группе обладает особенно хорошей способностью по удалению гидроксильных радикалов.
В целом, экспериментальная группа показала более высокую антиоксидантную активность, которая дополнительно подтвердила осуществимость искусственного добавления штаммов для изготовления микробных ферментов. Таким образом, продукты микробного фермента имеют больше веществ, полезных для здоровья человека на основе первоначальной естественной ферментации и могут лучше развиваться в том направлении, ожидаемом людьми.