Cistanche может защитить почки от ишемии-реперфузии

Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

Ян Х. Линдеман1, Леони Г. Вийермарс1, Сарантос Костидис2, Олег А. Майборода2, Эми С. Хармс3 и др.

Отсроченная функция трансплантатапроявление ишемически-реперфузионного поврежденияв связи с трансплантацией почки. В то время как сотни вмешательствуспешно уменьшить ишемически-реперфузионное повреждениев экспериментальных моделях все клинические вмешательства потерпели неудачу. В этой исследовательской клинической оценке изучалось возможное метаболическое происхождение клинического ишемического реперфузионного повреждения, объединяя данные 18 биопсий тканей до и после реперфузии с 36 последовательными заборами артериовенозной крови над трансплантатом в трех группах исследований. Эти группы включали живые и умершие донорские трансплантаты с отсроченной функцией трансплантата и без нее. Распределение по группам основывалось на клинических результатах. ЯМР под магическим углом использовался для анализа тканей, а платформы на основе масс-спектрометрии использовались для анализа плазмы. Всепочкифункционировали в течение одного года. Интеграция метаболомных данных идентифицировала дискриминационный профиль для распознавания будущей отсроченной функции трансплантата. Этот профиль характеризовался постреперфузионным катаболизмом АТФ/ГТФ (значительно нарушенным восстановлением фосфокреатина и значительной постоянной выработкой (гипо)ксантина) и значительным продолжающимся повреждением тканей. Неудачное восстановление высокоэнергетического фосфата произошло, несмотря на активированный гликолиз, окисление жирных кислот, глутаминолиз и аутофагию, и связано с дефектом на уровне оксоглутаратдегидрогеназного комплекса в цикле Кребса. Клиническая отсроченная функция трансплантата из-за ишемического реперфузионного повреждения, связанного с постреперфузионным метаболическим коллапсом. Таким образом, усилия по подавлению отсроченной функции трансплантата из-за ишемического реперфузионного повреждения должны быть сосредоточены на сохранении метаболической компетентности либо за счет сохранения целостности цикла Кребса, либо за счет задействования путей метаболического спасения. Kidney International (2020) 98, 1476–1488; https://doi.org/10.1016/j.kint.2020.07.026

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: АТФ; отсроченная функция трансплантата; гликолиз; ишемия-реперфузионное повреждение; метаболизм; окислительного фосфорилирования

эффекты цистанхе: предотвращениеишемически-реперфузионное повреждение

ишемическое реперфузионное повреждение (ИРИ)это феномен повышенного повреждения тканей после реперфузии ранее ишемизированной ткани.1,2 Он является основной причиной повреждения органов после инфаркта миокарда или головного мозга3 и повреждения трансплантата после трансплантации органов.4 Несмотря на то, что множество вмешательств подавляют ИРИ в доклинических моделях, клинический успех остается должно быть достигнуто.3,4 Таким образом, появляется поступательный разрыв между доклиническими моделями и клиническим контекстом.

Задержка функции трансплантата (ЗФТ) является проявлением ИРИ на фонепочкатрансплантации.5 DGF определяется как потребность в диализе в первую неделю или недели после трансплантации.6 Хотя DGF встречается крайне редко в контексте процедур трансплантации от живого донора, он затрагивает до 90 процентов трансплантаций умершего донора.6 Работа продемонстрировала связь между инцидентом DGF и нормоксическим гликолизом после реперфузии. 7 Это наблюдение подразумевает, что DGF связан с дефектом энергетического гомеостаза трансплантата в результате митохондриальной дисфункции в фазе реперфузии. 7 На этом основании мы предположили, что клинический DGF включает и может быть вызван метаболическим дефектом (или дефектами). Целью данного исследования было проведение углубленного анализа метаболических реакций наишемия-реперфузияс и без IRI (DGF). Эта исследовательская метаболическая оценка основана на интегрированном подходе с временным разрешением, который включает последовательную оценку различий артериовенозной концентрации (АВ) по сравнению с реперфузированными трансплантатами и параллельное профилирование биопсий трансплантатов (тканей). Были включены три группы исследования: трансплантаты от умерших доноров с последующей ИРИ и без нее и трансплантаты от живых доноров. Распределение трансплантатов умерших доноров по группам (þDGF и –DGF соответственно) проводилось ретроспективно на основании их клинических результатов. Трансплантаты живых доноров были включены в качестве эталона, поскольку эти трансплантаты связаны с мгновенным функциональным восстановлением после реперфузии. Чтобы охватить основные аспекты метаболического гомеостаза, основное внимание в этом исследовании было уделено следующим основным метаболическим кластерам: метаболизм нуклеотидтрифосфатов, окисление жирных кислот (b), гликолиз/глутаминолиз, аутофагия, цикл Кребса (дефекты) и повреждение клеток. Данные представлены соответственно.

(Переписка: Ян Х. Линдеман, отделение хирургии Медицинского центра Лейденского университета, а/я 9600, 2300 RC Лейден, Нидерланды. Электронная почта: Lindeman@lumc.nl Получено 20 января 2020 г.; исправлено 8 июня 2020 г.; принято 2 июля. 2020; опубликовано онлайн 8 августа 2020 г.)

эффекты цистанхе: предотвращениеишемически-реперфузионное повреждение

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

В выборку исследования вошли 53 пациента. Парные биопсии тканей были получены у 18 пациентов, а последовательная биопсия аорты была выполнена у 36 пациентов. У одного пациента были взяты обе биопсии и биопсия аорты. Клинические данные для 3 исследовательских групп показаны в дополнительной таблице S1A (биопсия тканей) и S1B (отбор АВ). Во всех случаях DGF потребовалось несколько диализов в течение как минимум 7 дней, и все они показали адекватное функциональное восстановление. Ни один из умерших доноров без DGF не нуждался в диализе после трансплантации. Годичная приживаемость трансплантата составила 100%.

Сначала мы исследовали предполагаемые различия в метаболических сигнатурах для 3 групп доноров (трансплантаты живых [эталонных] доноров, трансплантаты умерших доноров -DGF и трансплантаты мертвых доноров þDGF [IRI]) путем картирования метаболома плазмы (различия AV) для { {1}} минут после реперфузии (рис. 1а) итканевый метаболом(биопсия ткани) в течение 40- минут после реперфузии (рис. 1b). Эти временные точки были выбраны, чтобы избежать помех от вымывания метаболитов, которые накапливались во время ишемии или хранения в холодильнике, или которые были составляющими консервирующей жидкости (например, вымывание гистидина из живых донорских трансплантатов; на дополнительном рисунке S1 показано селективное использование H [гистидина] Жидкость для сохранения ТК в этих трансплантатах)7. Результаты (z-показатели) для этих временных точек суммированы на тепловых картах на рис. 1а (различия AV) и 1b (ткань). Группировка данных была выполнена в соответствии с 6 кластерами, которые охватывают все метаболические данные: (i) катаболизм нуклеозидтрифосфатов, (ii) b-окисление, (iii) гликолиз/глутаминолиз, (iv) аутофагия, (v) дефекты цикла Кребса, и (vi) повреждение клеток.

Тепловые карты для различий AV указывают на параллельные метаболические сигнатуры для трансплантатов живого донора и -DGF и четко отличительные сигнатуры для трансплантатов þDGF (рис. 1а). Аналогичная, хотя и менее выраженная картина наблюдалась для тканевых метаболитов (рис. 1б). Эксклюзивное картирование трансплантатов –DGF и þDGF (без трансплантата живого донора) привело к аналогичным выводам (не показано), что указывает на то, что включение данных живого донора (эталон) в анализ не повлияло на выводы анализа. В совокупности данные обеспечивают общий метаболический признак почечной ИРИ.

Для ясности данные по отдельным метаболитам представлены в виде 6 метаболических кластеров. Чтобы избежать помех от начального вымывания метаболитов, которые накопились во время хранения в холодильнике в течение первых минут реперфузии, оценки чистого постперфузионного высвобождения или поглощения основаны на интегрировании различий АВ для 10--{{3 }}минутные интервалы времени после реперфузии (площадь между кривыми).

Первый кластер метаболитов («катаболизм нуклеозидтрифосфатов») сигнализирует остойкая постреперфузионнаяметаболическая недостаточность («отключение питания») в трансплантатах с более поздним DGF (þDGF). Этот вывод основан на нарушении постреперфузионного восстановления высокоэнергетического фосфатно-буферного фосфокреатина в трансплантатах þDGF (P < 0.001;="" рис.="" -="" реперфузионный="" катаболизм="" аденозинтрифосфата/гуанозинтрифосфата="" (атф/гтф).="" последнее="" отражается="" в="" продолжающемся="" высвобождении="" (av="" различия)="" гипоксантина="" и="" ксантина="" (рис.="" 2b="" и="" c,="" p="">< 0,0001="" и="" 0,02="" соответственно),="" конечных="" продуктов="" деградации="" атф="" и="" гтф="" из="" этих="" трансплантатов.="" данные="" для="" биопсии="" ткани="" до="" реперфузии="" показали="" градуированную="" степень="" накопления="" инозина="" и="" гипоксантина="" в="" конце="" периода="" ишемического="" хранения,="" с="" самым="" низким="" содержанием,="" обнаруженным="" в="" живых,="" и="" самым="" высоким="" в="" трансплантатах="" умерших="" доноров="" (рис.="" 2d="" и="" e).="" после="" реперфузии="" (t="40" мин)="" содержание="" гипоксантина="" и="" инозина="" в="" тканях="" было="" одинаковым="" и="" низким="" во="" всех="" трех="" группах="" доноров="" (рис.="" 2d="" и="">

Катаболизм АТФ после реперфузии в трансплантатах þDGF происходил, несмотря на очевидное постреперфузионное восстановление b-окисления жирных кислот (дополнительная фигура S2), активированного гликолиза/глутаминолиза (рисунок 3) и аутофагии (рисунок 4). Все 3 типа трансплантатов показали равномерное восстановление содержания b-гидроксибутирата в ткани (дополнительный рисунок S2A) и селективный клиренс (поглощение) жирных кислот со средней длиной цепи (C8–C12) из ​​кровотока (дополнительные рисунки S1 и S2B–E), что указывает на равномерное восстановление b-окисления. Однако накопление ацетилкарнитина в тканях трансплантатов умерших доноров -DGF и þDGF (дополнительный рисунок S2F) и вымывание (различия AV) ацетилкарнитина из трансплантатов þDGF (дополнительный рисунок S2G, P <0,03) подразумевают="" градуированные="" дефекты="" утилизации="" ацетильных="" групп,="" образующихся="" в="">

Цистанхе трава

Картирование сетей гликолиза/глутаминолиза (рис. 3) показало равные уровни глюкозы в тканях (рис. 4а) и подтвердило стойкий нормоксический гликолиз после реперфузии как исключительную особенность донорских трансплантатов þDGF (а именно, постоянное высвобождение лактата и пирувата (рис. 3b и с, P).<0.0001 and=""><0.04, respectively)="" and="" release="" of="" the="" transamination="" products="" alanine="" and="" aspartate="" (figure="" 3e="" and="" f,="" p="" <="" 0.02="" and="" <="" 0.0001,="" respectively).="" serine="" (figure="" 4b)="" and="" phosphoserine="" (supplementary="" figure="" 3d)="" released="" from="" þdgf="" grafts="" may="" (partially)="" reflflect="" transamination="" of="" the="" glycolysis="" intermediate="" phosphoglycerate.="" persistent="" post-reperfusion="" glutamate="" release="" (figure="" 3k,="" p="" <="" 0.002),="" selective="" release="" of="" the="" transamination="" products="" alanine="" and="" aspartate="" (figure="" 3e="" and="" f),="" and="" exhaustion="" of="" the="" tissue="" asparagine="" pool="" (figure="" 3j,="" p="" <="" 0.03)="" in="" þdgf="" grafts="" imply="" continued="" post-reperfusion="" glutaminolysis="" (alanine)="" and="" glutamine="" shuttling="" (asparagine="" aspartate)8="" in="" the="" post-reperfusion="" phase="" of="" these="" grafts.="" moreover,="" the="" exclusive="" release="" of="" serine,="" methionine,="" and="" tyrosine="" (figure="" 4a–c,="" all="" ps="" <="" 0.0005),="" along="" with="" disposal="" of="" butyryl="" carnitine="" and="" isovaleryl="" carnitine="" (figure="" 4d="" and="" e,="" p=""><0.006 and=""><0.003, respectively),="" deamination="" products="" of="" the="" branched-chain="" amino="" acids9,10="" from="" þdgf="" grafts,="" but="" not="" from="" the="" other="" graft="" types="" (figure="" 4a–e),="" implies="">после реперфузииаутофагия в этих трансплантатах.11.

Рисунок 1|Кластерные тепловые карты для различий концентрации артериально-венозных метаболитов по сравнению с донорским трансплантатом через 30 минут и содержанием тканевых метаболитов через 40 минут после реперфузии. (а) Кластерная тепловая карта концентраций артериально-венозных метаболитов при t=30 минут после реперфузии. Столбцы представляют 3 группы доноров (живые донорские трансплантаты [контрольная группа, n=10]; умершие донорские трансплантаты без более поздней отсроченной функции трансплантата [DGF {–DGF, n=10}] и умершие донорские трансплантаты с более поздним DGF [+DGF, п=16]). Соединения сгруппированы в соответствии с 5 метаболическими кластерами и внутри каждого кластера ранжированы на основе z-показателя группы живых доноров. Зеленый цвет отражает поглощение сетки трансплантатом, а красный цвет отражает высвобождение сетки из трансплантата. (продолжение)

Рисунок 1 (продолжение) (b) Кластерная тепловая карта для тканевых метаболитов, идентифицированных в магнитно-резонансном ядерном магнитно-резонансном анализе биопсий трансплантатов, взятых через 40 минут после реперфузии.. Столбцы представляют 3 группы доноров (группа живых доноров [контрольная группа, n=6, трансплантаты умерших доноров без более позднего DGF [–DGF, n=6] и трансплантаты умерших доноров с более поздним DGF [+DGF, n=6]). Красный цвет отражает содержание ткани выше, а зеленый цвет отражает содержание ткани ниже среднего геометрического трех групп.

Постреперфузионное накопление ацетилкарнитина (ткань) в трансплантатах –DGF и þDGF (рис. 2f), а также начальное (живой донор и трансплантаты –DGF) и продолжающееся (графты þDGF) высвобождение ацетилкарнитина (P < 0.{{10="" }}="" 3)="" указывают="" на="" временное="" (трансплантаты="" -dgf)="" или="" стойкое="" (трансплантаты="" þdgf)="" нарушение="" утилизации="" ацетил-коэнзима="" а="" после="" реперфузии="" (дополнительная="" фигура="" 2g).="" хотя="" это="" накопление="" может="" быть="" результатом="" чрезмерного="" гликолиза="" и="" бета-окисления,="" оно="" также="" может="" указывать="" на="" нарушение="" утилизации="" ацетила="" в="" результате="" дефектов="" цикла="" кребса.="" для="" трансплантатов="" þdgf="" последний="" механизм="" поддерживается="" селективным="" и="" стойким="" высвобождением="" интермедиата="" цикла="" кребса="" α-кетоглутарата="" (рис.="" 5c,="" p=""><0,0005) в="" качестве="" исключительного="" признака="" этих="" трансплантатов="" и="" нарушением="" восстановления="" тканевого="" сукцината="" в="" трансплантатах="" þdgf.="" (рисунок="">

Последний кластер дискриминационных метаболитов связан с продолжающимся повреждением клеток. В этот кластер входятпосле реперфузиивысвобождение урацила, установленного маркера повреждения клеток12,13 (дополнительная фигура S3A, P <0.0001), и="" производных="" аминокислот,="" которые="" связаны="" с="" гидролиз="" плазмалогенов="" (а="" именно="" фосфоэтаноламин,="" этаноламин="" и="" фосфосерин;="" дополнительная="" фигура="" s3bd,="" p=""><0. 0="" 01;="" дополнительная="" фигура="" s1).="" хотя="" различий="" в="" av="" для="" холина="" в="" группе="" þdgf="" не="" было="" (p="0,60)," это="" наблюдение="" контрастирует="" с="" чистым="" поглощением="" холина="" в="" группе="" живого="" донора="" и="" -dgf="" (p="">< 0,0001="" и="" 0,02="" соответственно).="" следовательно,="" в="" трансплантатах="" þdgf="" гидролиз="" холиновых="" плазмалогенов="" может="" быть="" замаскирован="" поглощением="" холина.="" такой="" механизм="" поддерживается="" избирательным="" и="" прогрессивным="" высвобождением="" бетаина,="" продукта="" окисления="" холина14="" в="" группе="" þdgf="" (дополнительные="" рисунки="" s3g,="" p=""><>

Предыдущие наблюдения связывают инцидент IRI с постояннымпосле реперфузииКатаболизм АТФ и продолжающееся повреждение клеток в контексте митохондриальной недостаточности и активации гликолитических и липолитических путей (рис. 6). Принимая во внимание жизненно важную роль АТФ в клеточном гомеостазе и выживании, было высказано предположение, что привлечение вспомогательных путей регенерации АТФ (а именно, независимых от митохондриального дыхания) будет полезным. В этом контексте мы рассмотрели инозин, нуклеозид, который может генерировать АТФ нетрадиционными путями. Как показано на рис. 7, ни превентивная, ни экстренная доставка инозина (в концентрациях до 10 ммоль/л) не восстанавливала истощение АТФ после химически индуцированного метаболического паралича.

Рисунок 3|Постреперфузионный гликолиз и глутаминолиз. Кривые артериально-венозной разницы (красная кривая — артериальная, синяя — венозная). Биопсия тканей (гистограммы): белые столбцы представляют биопсии до реперфузии; серые столбцы представляют биопсии после реперфузии (t=40 мин после реперфузии). *Р < 0,05.="" (а)="" содержание="" глюкозы="" в="" тканях.="" (b–i)="" промежуточные="" продукты="" гликолиза:="" лактат,="" пируват,="" аланин,="" аспартат="" и="" аспарагин.="" (к,="" л).="" промежуточные="" продукты="" глутаминолиза="" –="" глутамин="" и="" глутамат.="" тканевый="" ядерный="" магнитный="" резонанс="" (ямр;="" n="6" на="" группу):="" (а)="" восстановление="" уровня="" глюкозы="" в="" тканях="" у="" живого="" донора.="" (г,="" е,="" з)="" содержание="" стабильного="" лактата,="" аланина="" и="" аспартата="" в="" ткани="" отражает="" вымывание="" этих="" интермедиатов="">

Рисунок 3 (продолжение) из почки. (j) Тканевой аспарагин, не поддающийся измерению, в постреперфузионных биопсиях с отсроченной функцией трансплантата (DFG). Артериально-венозные (AV) различия концентраций (n=10, 10 и 16 в группах живых, -DGF и þDGF соответственно): (b,c) стойкий постреперфузионный лактат (P < 0.0001)="" и="" высвобождение="" пирувата="" (p=""><0,04) из="" этих="" трансплантатов.="" (e)="" аланин="" (p=""><0,02), (g)="" аспарагиновая="" кислота="" (p=""><0,0001) и="" (þk)="" высвобождение="" глутамата="" (замедленная="" функция="" трансплантата="" (трансплантаты="" dgf="" указывают="" на="" нормоксический="" гликолиз="" при="" p=""><0,002) из="" ​​трансплантатов="" þdgf="" указывают="" на="" продолжающееся="" окисление="" глутамина="" в="" для="" глутамина="" (i)="" не="" наблюдалось="" существенных="" различий="">

эффекты цистанхе: предотвращениезаболевания почек

ОБСУЖДЕНИЕ

Из этого исследования, проведенного в контексте клинической трансплантации почки, вырисовывается картина IRI (DGF), являющаяся следствием почти мгновенного и стойкого постреперфузионного отказа окислительного фосфорилирования и активированного нормоксического гликолиза, который не способен поддерживать энергетический гомеостаз. В свою очередь, пулы высокоэнергетических фосфатов постепенно истощаются, и клеточная целостность не может быть сохранена, что приводит к продолжающемуся повреждению тканей.

Это клиническое исследование основано на объединении метаболических данных, полученных при биопсии ткани, взятой непосредственно до и через 40 минут после реперфузии, а также на последовательной оценке различий АВ над реперфузированным трансплантатом. Эти различия AV не только указывают на скорость и продолжительность метаболической (неправильной) адаптации, но также позволяют направлять тенденции, наблюдаемые в парных биопсиях тканей, и оценивать клиренс метаболитов (например, лактата) или поглощение из (например, среды). жирные кислоты со средней длиной цепи) кровообращение.15,16 Разрешение AV-подхода ясно иллюстрируется данными по ацилкарнитину, которые не только показывают избирательное поглощение жирных кислот со средней длиной цепи, но также предполагают, что ненасыщенные виды C14-карнитина тетрадеценоил и тетрадекадиенилкарнитин ведут себя аналогично жирным кислотам со средней длиной цепи (дополнительные данные S1) и могут не полагаться на определенные переносчики жирных кислот.17 Фактически, в процессе анализа данных было замечено, что единственная опора на биопсии тканей могла бы скрыть большинство выводов в этом исследовании. потому что большинство образовавшихся метаболитов эффективно выводятся в кровоток. Стабильные концентрации в артериальной крови показывают, что гомеостаз крови сохраняется, и, следовательно, высвобождаемые или абсорбируемые метаболиты эффективно утилизируются или пополняются в другом месте.15,16 Наблюдаемое стабильное содержание в тканях, но четкие различия AV ставят под сомнение достоверность тканевых метаболомных оценок. Обратите внимание, что в контексте почек умерших доноров и временных рамок исследования клиренс с мочой не является мешающим фактором, поскольку все трансплантаты умерших доноров были анурическими в течение 40- минутного интервала измерения.

Картирование данных идентифицирует метаболический след, который полностью дискриминирует ИРИ. В частности, фаза реперфузии трансплантатов с будущим DGF однородно и отчетливо характеризуется тяжелым нарушением окислительного фосфорилирования (гистотоксической гипоксией)18 и компенсаторным нормоксическим гликолизом, который не способен поддерживать регенерацию АТФ. Последнее заключение основано на неполном восстановлении высокоэнергетического фосфатного буфера фосфокреатина19 и на стойком катаболизме АТФ/ГТФ после реперфузии, отражающемся в продолжающемся высвобождении (гипо)ксантина. Фактически, аппроксимация потерь аденозина для трансплантатов þDGF на основе высвобождения гипоксантина (различия AV) через 30 минут после реперфузиипочечная тканьмасса21 и содержание АТФ в почках22) свидетельствует о близком истощении пула АТФ трансплантата 30 минутпосле реперфузии. Критическое истощение пула АТФ может привести к катаболической блокировке, которая делает клетку невосприимчивой к восстановлению протонно-движущих сил, управляющих выработкой АТФ, что делает клетку невосприимчивой к стратегиям спасения.

Постреперфузионный дефицит АТФ и гистотоксическая гипоксия в трансплантатах βDGF могут лежать в основе селективного высвобождения аминокислот, связанного с гидролизом фосфолипидов (плазмалогенов) в трансплантатах βDGF. Экспериментальные исследования идентифицировали гидролиз плазмалогенов и фосфолипидов как раннюю характеристику тканевой гипоксии, 23 а гидролиз плазмалогенов был описан в контексте ишемического повреждения почек. 24 Механически это явление было связано с транслокацией мембраны и активацией цитозольной кальциевой независимая фосфолипаза A2, возникающая в результате вызванного гипоксией образования комплекса между фосфолипазой и регуляторным элементом фосфофруктокиназы. 25,26 Реверсия гипоксии или лечения АТФ диссоциирует комплекс фосфолипаза-фосфофруктокиназа и отменяет активность фосфолипазы. Следует отметить, что динамика постреперфузионного прекращения высвобождения (фосфо-)этаноламина из трансплантатов живого донора и -DGF, а также стойкое высвобождение в трансплантатах þDGF может отражать разную степень и скорость метаболического восстановления. Однако, в то время как более ранние сообщения подразумевают роль цитозольной кальций-независимой фосфолипазы A2,25,26, наблюдаемые различия AV для бетаина и (фосфо-)этаноламина подразумевают более полную активацию фосфолипаз, которая также включает фосфолипазы типа C (фосфоэтаноламин). и D-фосфолипазы (этаноламин/холин). Точно так же истощение тканевого аспарагина (рис. 4j) и высвобождение аспартата (рис. 4g) из трансплантатов þDGF может отражать нарушение активности аспарагинсинтазы из-за истощения АТФ.

Рисунок 4|Активированная постреперфузионная аутофагия в трансплантатах D с отсроченной функцией трансплантата (DGF). Кривые артериально-венозной разницы (красная кривая – артериальная, синяя – венозная). Биопсия тканей (гистограммы): белые столбцы представляют биопсии до реперфузии; серые столбцы представляют биопсии после реперфузии (t=40 мин после реперфузии). *Р < 0,05.="" (a–c)="" постреперфузионное="" высвобождение="" метионина,="" серина="" и="" тирозина="">

Рисунок 5|Дефект цикла Кребса после реперфузии в трансплантатах с будущей отсроченной функцией трансплантата (DGF). Кривые разницы артериально-венозной концентрации (АВ) (красная кривая — артериальная, синяя — венозная). Биопсия тканей (гистограммы): белые столбцы представляют биопсии до реперфузии; серые столбцы представляют биопсии после реперфузии (t=40 мин после реперфузии). *P < {{10}}.05.="" (a–h)="" различия="" av="" для="" промежуточных="" продуктов="" цикла="" кребса="" (n="10," 10="" и="" 16="" в="" группах="" живых,="" –dgf="" и="" βdgf="" соответственно):="" постоянное="" высвобождение="" α-кетоглутарата="" (из="" трансплантатов="" βdgf;="" p=""><0,001) .="" (="" e,="" g="" )="" отсутствие="" восстановления="" сукцината="" ткани="" после="" реперфузии="" в="" трансплантатах="" þdgf="" (p=""><>

Постреперфузионный катаболизм АТФ в трансплантатах þDGF происходил, несмотря на комплексную активацию катаболических путей: гликолиз, b-окисление жирных кислот со средней длиной цепи (равномерно активируется во всех типах трансплантатов), глутаминолиз (также временно активируется при реперфузии в трансплантатах живого донора и -DGF). ) и активировали аутофагию. Фактически постреперфузионное высвобождение изовалерил- и бутирилкарнитина, продуктов дезаминирования аминокислот с разветвленной цепью изолейцина и лейцина11 было идентифицировано как дискриминационные биомаркеры для будущего DGF.

Постоянное высвобождение ацетилкарнитина и пирувата из трансплантатов þDGF показывает, что потоки, создаваемые активированными катаболическими путями, превышают окислительную способность. Высвобождение кетоглутарата после реперфузии, чистое поглощение цитрата и изоцитрата его предшественника из кровотока и недостаточное восстановление тканями сукцината предполагают, что нарушение окислительного фосфорилирования связано с дефектом на уровне оксоглутаратдегидрогеназного комплекса. В частности, наблюдаемый метаболический след и временные рамки метаболических нарушений не указывают на роль обратной направленности цикла Кребса27,28 в устойчивой метаболической дисрегуляции, что является дополнительным доказательством того, что наблюдаемый механизм ИРИ у грызунов28 не полностью переносится на человеческий организм. контекст.29.

Нарушение активности оксоглутаратдегидрогеназы может быть вызвано повреждением комплекса, связанным с ишемией,30 но также может включать или усугубляться нарушениемпосле реперфузииНарушение активности оксоглутаратдегидрогеназы может быть вызвано связанным с ишемией повреждением комплекса30, но также может включать или усугубляться нарушением постреперфузионной доступности его кофакторов ацетил-коэнзима А, FAD+ и NAD+. 31 Для трансплантатов þDGF такой дефицит может возникать из-за постреперфузионного вымывания ацетил-коэнзима А и нарушенного клеточного окислительно-восстановительного статуса (редуктивный стресс с нарушением доступности NADþ), мнение, поддерживаемое низким соотношением лактата и пирувата в трансплантатах þDGF. 32.

Этот метаболический подход не позволяет оценить участие дыхательной цепи. Однако ранее мы идентифицировали дефекты, связанные с реперфузией ишемии, в обоих дыхательных комплексах I и II. вызывая) повреждение(я) митохондриального цикла Кребса-окислительно-восстановительного челнока, которое происходит до или в течение первых минут реперфузии. Неспособность восстановить уровни АТФ приводит к устойчивой и всеобъемлющей активации катаболических путей, что увековечивает энергетический кризис, постепенно истощая клеточный пул НАД+ и ФАД+ (редуктивный стресс).33 . В отличие от аденозина,34 инозин стабилен в плазме; он был идентифицирован как альтернативный источник АТФ в облигатных гликолитических клетках (т.е. клетках без митохондрий), таких как эритроциты35 и в гипоксических почечных клетках36, и истощается после реперфузии. К сожалению, добавки инозина не спасли от истощения клеточного АТФ после вынужденного отключения метаболизма, оставив мало места для метаболических спасательных стратегий, направленных на подавление ИРИ, подчеркивая зависимость от превентивных стратегий ограничения ИРИ.

Тонизирующий почечный цистанхе

У этого исследования есть ограничения. Из-за большого количества сравнений высока вероятность значимых результатов из-за случайного случая в условиях множественных сравнений. Хотя наши выводы подтверждаются надежными биологическими взаимосвязями, результаты могут быть искажены проблемами, связанными с множественными сравнениями.

Еще одним ограничением является то, что исследование основано на клинических образцах; как таковое, клэмп-замораживание, необходимое для прямой оценки АТФ и окислительно-восстановительного статуса, было невозможно. Поскольку наблюдаемый метаболом явно отличается от того, о котором сообщается в моделях на животных, и отражает системный сбой, мы не смогли выполнить более подробные оценки в моделях на животных или в системах ex vivo, таких как система респирометрии. Результаты этого исследования относятся кпочка; таким образом, выводы для других органов могут быть иными. Относительно высокий возраст доноров в этом исследовании является отражением популяции доноров в Нидерландах. Важно отметить, что 10-годовые результаты трансплантации в Нидерландах, по крайней мере, такие же, как в странах с более молодыми донорами, таких как Соединенные Штаты.37 Как и ожидалось, большинство случаев þDGF были трансплантатами DCD. Мы заметили подобноеметаболические профилидля трансплантатов DBD и DCD; однако мощность этого исследовательского исследования явно слишком мала для обнаружения тонких различий между этими двумя типами доноров.

Рисунок 7|Как профилактическое, так и спасательное лечение инозином не восстанавливают уровень аденозинтрифосфата (АТФ).. Линию почечных клеток PK-1 стабильно трансфицировали флуоресцентным биосенсором PercevalHR на соотношение АТФ и аденозиндифосфата (АДФ).

Химически индуцированный метаболический паралич индуцировали добавлением ротенона/актиномицина/2-дезоксиглюкозы и контролировали отношение АТФ к АДФ (относительная флуоресценция). Браун, контроль; черный, контроль метаболического паралича; зеленый, профилактическое лечение инозином (10 ммоль/л); красный, инозин спасают при t=15 минут после индукции метаболического паралича.

В заключение, это исследование показывает, что клинической ИРИ почек предшествует почти мгновенный метаболический коллапс и сопутствующий высокоэнергетический фосфатный кризис. Этот глубокий и стойкий метаболический дефицит и его мгновенный характер (и, как следствие, минимальное окно терапевтических возможностей) будут мешать любому фармацевтическому вмешательству, основанному на доступности АТФ. Это может объяснить плохую переносимость доклинических данных в клинические условия.2–4 Наблюдаемый метаболом клинического DGF резко контрастирует с зарегистрированными метаболическими реакциями крыс,28 мышей,38 и свиней,39,40, которые все указывают на восстановление окислительного фосфорилирования в организме. минут реперфузии. Это может быть связано с фундаментальными различиями в митохондриальной или метаболической физиологии между грызунами и более крупными млекопитающими (например, индуцированное ишемией накопление сукцината не происходит в почках человека-донора)29. В этом контексте важно отметить, что все трансплантированные почки подвергаются воздействию креперфузия ишемиии что только подгруппа трансплантатов развивается IRI (DGF). Распределение по группам (þDGF или –DGF) в этом исследовании было выполнено ретроспективно, и, таким образом, оно различает реперфузию ишемии и ИРИ. Нельзя исключать, что реперфузии ишемии в экспериментальных моделях [28, 38–40] недостаточно для запуска ИРИ.

Несмотря на серьезное повреждение, все трансплантаты þDGF в конечном итоге выздоровели, что подразумевает значительный потенциал восстановления при условии, что доступны промежуточные вмешательства (например, диализ). Следует отметить, что хотя сходные метаболомы DGF в трансплантатах, полученных от доноров, умерших после смерти мозга или сердечной смерти, предполагают единый механизм, существует противоположное влияние DGF на долгосрочную выживаемость трансплантатов для двух типов доноров.41 На самом деле, хотя DGF явно влияет на выживаемость трансплантатов от доноров, умерших после смерти мозга, но не на такие трансплантаты от доноров сердца. Этот контраст, по-видимому, отражает превосходный потенциал восстановления трансплантатов от доноров, умерших от сердечного приступа.41

МЕТОДЫ

Комитет по медицинской этике Медицинского центра Лейденского университета одобрил протокол исследования. От каждого пациента было получено письменное информированное согласие. В это одноцентровое исследование были включены 53 пациента, перенесшихпочкатрансплантация: 37 человек перенесли процедуру трансплантации от умершего донора и 16 - процедуру живого донора. На основании клинического исхода (DGF) реципиенты трансплантатов умерших доноров были распределены в группу þDGF (n=16) или группу -DGF (n=10). DGF определяли по необходимости диализа в первую неделю после трансплантации.6

Исследование основано на интеграции данных метаболомики, полученных при последовательном заборе артериовенозной (АВ) крови в течение первых получаса реперфузии, а также при парных биопсиях тканей, собранных непосредственно до и через 40 минут после реперфузии.

реперфузия.

Последовательный забор крови из аорты над трансплантатом был выполнен у 36 пациентов (дополнительная таблица S1A). Образцы крови из почечной вены были собраны через 30 с, 3, 5, 10, 20 и 30 минут, а образцы артериальной крови - через 0, 10 и 30 минут после реперфузии. биопсии были получены непосредственно до и через 40 минут после реперфузии от 6 живых и 12 умерших донорских трансплантатов (дополнительная таблица S1B; у 1 пациента были взяты образцы как биопсии, так и АВ).

Целевые метаболические анализы проводились с использованием стандартных операционных процедур с использованием установленных платформ на основе масс-спектрометрии или ядерно-магнитного резонанса под магическим углом (биопсия тканей). 43 Метаболиты, охватываемые платформами, обобщены в дополнительной таблице S1.

Способность инозина восстанавливать метаболический дефицит во время метаболического коллапса была проверена на клеточной линии проксимальных канальцев (LLC PK1), стабильно трансфицированной флуоресцентным АТФ-аденозиндифосфатным биосенсором PercevalHR.44.

Что касается статистики, то тепловые карты были построены на основе z-показателей для каждогометаболит. Внутригрупповые изменения содержания метаболитов в тканях оценивали по критерию Манна-Уитни, а межгрупповые различия - по критерию Уилкоксона. Различия AV были оценены с использованием линейной смешанной модели. Поправка на множественное тестирование не проводилась, поскольку все наблюдения были частью теоретических сетей. Подробная информация о пациентах и ​​методах представлена ​​в дополнительных методах.

экстракт цистанхе

РАСКРЫТИЕ

Все авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Основной центр магнитного резонанса финансируется медицинским факультетом NTNU Trondheim, Норвегия. Это исследование частично финансировалось Голландским почечным фондом (метаболические стратегии спасения для улучшения результатов трансплантации, проект 17O/11).

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ

Дополнительный файл (PDF)

Дополнительные пациенты и методы.

Таблица S1. Характеристики пациента и трансплантата процедур, в которых были собраны парные биопсии ткани (A) и в которых был выполнен забор AV (B).

Таблица S2. Платформы и их метаболиты используются для образцов AV.

Рисунок S1. Полные метаболические данные.

Рисунок S2. Восстановление b-окисления (среднецепочечные жирные кислоты) после реперфузии.

Рисунок S3. Селективное и стойкое постреперфузионное вымывание урацила и фосфолипидных (плазмалоген)-ассоциированных аминокислот из трансплантатов с будущим DGF.

Приложение к данным 1. Необработанные данные AV для платформ ацетилкарнитина, органических кислот и аминокислот.

Приложение к данным 2. Необработанные данные AV для пуриновой и пиримидиновой платформы.

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Gutteridge JMC, Halliwell B. Реактивные виды при болезнях: друзья или враги? В: Halliwell B, Gutteridge JMC, ред. Свободные радикалы в биологии и медицине. Оксфорд, Великобритания: Издательство Оксфордского университета; 2015: 511–638.

2. Дэвидсон С.М., Фердинанди П., Андреу И. и др. Многоцелевые стратегии для уменьшения ишемии/реперфузии миокарда: обзорная тема недели JACC. J Am Coll Кардиол. 2019;73:89–99.

3. Лефер Д.Дж., Болли Р. Создание консорциума NIH для доклинической оценки кардиозащитной терапии (CAESAR): изменение парадигмы в исследованиях ограничения размера инфаркта. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 2011;16:332–339.

4. Кавайе-Колл М., Бала С., Велидедоглу Э. и др. Резюме семинара FDA по ишемическому реперфузионному повреждению при трансплантации почки. Ам Джей Трансплант. 2013;13:1134–1148.

5. Schröppel B, Legendre C. Отсроченная функция почечного трансплантата: от механизма до трансляции. почки инт. 2014; 86: 251–258.

6. Мэллон Д.Х., Саммерс Д.М., Брэдли Дж.А. и др. Определение отсроченной функции трансплантата после трансплантации почки: самое простое — лучшее. Трансплантация. 2013; 96: 885–889.

7. Wijermars LG, Schaapherder AF, de Vries DK, et al. Нарушение метаболического восстановления после реперфузии напрямую связано с задержкой функции трансплантата. почки инт. 2016;90:181–191.

8. Чжан Дж., Фань Дж., Веннети С. и др. Аспарагин играет важную роль в регуляции клеточной адаптации к истощению глутамина. Мол Ячейка. 2014; 56: 205–218.

9. Холечек М. Связь между глютамином, аминокислотами с разветвленной цепью и белковым обменом. Питание. 2002; 18: 130–133.

10. Newgard CB, An J, Bain JR, et al. Метаболический признак, связанный с аминокислотами с разветвленной цепью, который отличает людей с ожирением от худых и способствует резистентности к инсулину. Клеточный метаб. 2009; 9: 311–326.

11. Дрейк К.Дж., Сидоров В.Ю., МакГиннесс О.П. и соавт. Аминокислоты как метаболические субстраты при ишемии сердца. Exp Biol Med (Мейвуд). 2012; 237: 1369–1378.

12. Де Йонг Дж.В., Хайзер Т., Янссен М. и др. Высокоэнергетические фосфаты и их катаболиты. В: Piper HM, Preusse CJ, ред. Ишемия-реперфузия в кардиохирургии. Дордрехт, Нидерланды: Springer; 1993: 295–315.

13. ван Ос С., де Абреу Р., Хопман Дж. и соавт. Метаболизм пуринов и пиримидинов и электрокорковая активность головного мозга при гипоксемии у доношенных ягнят. Педиатр Рез. 2004; 55:1018–1025.

14. Блом Х.Дж., Де Вриз А.С. Почему при почечной недостаточности повышается уровень гомоцистеина? Метаболический подход. J Lab Clin Med. 2002; 139: 262–268.

15. Иванишевич Дж., Элиас Д., Дегучи Х. и соавт. Метаболомика артериовенозной крови: оценка внутритканевого метаболизма. Научный доклад 2015; 5:12757.

16. Jang C, Hui S, Zeng X и др. Метаболитный обмен между органами млекопитающих, количественно оцененный на свиньях. Клеточный метаб. 2019;30:594–606.

17. Бремер Дж. Карнитин-метаболизм и функции. Physiol Rev. 1983; 63: 1420–1466.

18. Зиггаард-Андерсен О., Фог-Андерсен Н., Гётген И.Х., Ларсен В.Х. Кислородный статус артериальной и смешанной венозной крови. Крит Уход Мед. 1995; 23:1284–1293.

19. Стойка СК. Высокоэнергетические фосфаты и донорское сердце человека. Трансплантация легкого сердца J. 2004; 23:S244–S246.

20. Лисик В., Гонтарчик Г., Косирадский М. и соавт. Интраоперационные измерения кровотока в аллотрансплантатах органов могут предсказать послеоперационную функцию. Пересадка Proc. 2007; 39: 371–372.

21. Молина Д.К., ДиМайо В.Дж. Нормальные массы органов у мужчин: II часть — головной мозг, легкие, печень, селезенка, почки. Am J Forensic Med Pathol. 2012;33:368–372.

22. Хемс Д.А., Броснан Дж.Т. Влияние ишемии на содержание метаболитов в печени и почках крыс in vivo. Биохим Дж. 1970; 120:105–111.

23. De Medio GE, Goracci G, Horrocks LA, et al. Влияние транзиторной ишемии на метаболизм жирных кислот и липидов в мозге песчанок. Ital J Biochem. 1980; 29: 412–432.

24. Рао С., Уолтерс К.Б., Уилсон Л. и др. Ранние изменения липидов при остром повреждении почек с использованием липидомики SWATH в сочетании с визуализацией тканей MALDI. Am J Physiol Renal Physiol. 2016; 310:F1136–F1147.

25. Портилья Д., Шах С.В., Леман П.А. и др. Роль цитозольной кальций-независимой плазмалоген-селективной фосфолипазы А2 в гипоксическом повреждении проксимальных канальцев кролика. Джей Клин Инвест. 1994; 93: 1609–1615.

26. Хазен С.Л., Вольф М.Дж., Форд Д.А., Гросс Р.В. Быстрая и обратимая ассоциация фосфофруктокиназы с мембранами миокарда при ишемии миокарда. ФЭБС лат. 1994; 339: 213–216.

27. Чинопулос С. В какую сторону поворачивается цикл лимонной кислоты при гипоксии? Критическая роль комплекса а-кетоглутаратдегидрогеназы. J Neurosci Res. 2013;91:1030–1043.

28. Chouchani ET, Pell VR, Gaude E, et al. Ишемическое накопление сукцината контролирует реперфузионное повреждение посредством митохондриальных АФК. Природа. 2014; 515:431–435.

29. Wijermars LG, Schaapherder AF, Kostidis S, et al. Накопление сукцината и ишемически-реперфузионное повреждение: на мышах, но не у мужчин, исследование почечной ишемии-реперфузии. Ам Джей Трансплант. 2016;16:2741–2746.

30. Треттер Л., Адам-Визи В. Альфа-кетоглутаратдегидрогеназа: цель и генератор окислительного стресса. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2005; 360: 2335–2345.

31. Хайкал АА. Внутриклеточные коферменты как естественные биомаркеры метаболической активности и митохондриальных аномалий. Биомарк Мед. 2010;4:241–263.

32. Сунь Ф., Дай С., Се Дж. и др. Биохимические вопросы оценки соотношения свободного НАД/НАДН в цитозоле. ПЛОС Один. 2012;7:e34525.

    ---