Отложение амилоида Р в сыворотке крови является чувствительным и специфическим признаком мембраноподобной гломерулопатии со скрытыми каппа-отложениями IgG

Контактное лицо: emily.li@wecistanche.com

Кристофер П. Ларсен1, Шри Г. Шарма1, Тиффани Н. Каза1, Дэниел Дж. Кенан1, Аарон Дж. Стори2, Рики Д. Эдмондсон2, Кристиан Херцог2 и Джон М. Артур2

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА:гломерулонефрит; замаскированные депозиты; масс-спектрометрии; мембранозноподобная гломерулопатия; субэпителиальные отложения

Цистанхе может улучшить функцию почек

Мембранозноподобная гломерулопатия со скрытыми каппа-отложениями IgG (MGMID) представляет собой недавно описанный паттерн гломерулонефрита с уникальной гистопатологией. Паттерн характеризуется субэпителиальным и/или мезангиальнымиммунныйотложения, которые «замаскированы» для окрашивания иммуноглобулином с помощью обычной иммунофлуоресценции, но сильно окрашиваются для IgG и легкой каппа-цепи после расщепления протеазами. Пациенты с этим типом гломерулонефрита чаще всего молодые женщины с протеинурией и неясным анамнезом аутоиммунных заболеваний, таких как низкий титр антинуклеарных антител. Здесь мы сравнили профиль масс-спектрометрии микродиссекции клубочков, полученных лазерным захватом, из девяти биоптатов почек MGMID с восемью биоптатами, показывающими другие образцы мембранозной гломерулопатии. Белком, наиболее значительно увеличенным при MGMID, был сывороточный амилоид P. Иммуноокрашивание показало сывороточный амилоид P, локализованный совместно с IgG в клубочках MGMID, но не с PLA2R-ассоциированной мембранозной гломерулопатией. Сывороточный амилоид P был положительным в клубочках всех 32 биопсий MGMID, но отрицательным в биопсиях других типов мембранных гломерулопатий, таких как те, которые связаны с PLA2R и THSD7A. Среди 173 биопсий, которые не соответствовали критериям MGMID или амилоидоза, было четыре биоптата с окрашиванием гломерулярного сывороточного амилоида P. Все четыре из этих биопсий с положительным окрашиванием амилоида Р в сыворотке имели мембранозный паттерн гломерулопатии с каппа-отложениями IgG, который отличался от MGMID только отсутствием «маскировки». Таким образом, положительное окрашивание гломерулярных отложений на сывороточный амилоид P идентифицирует уникальную форму гломерулонефрита, вероятно, с общим патофизиологическим механизмом заболевания.

Мембранозноподобная гломерулопатия со скрытыми каппа-отложениями IgG (MGMID) представляет собой гистопатологический паттерн гломерулонефрита, описанный в 2014 г., который был первым описанием того, что было названо скрытыми гломерулярными отложениями.1 Характерная гистопатология этого заболевания включает наличие мезангиальных и субэпителиальных отложения с рестрикцией IgG каппа. Любопытно, что хотя окрашивание компонента комплемента 3 (С3) часто проявляется при обычной иммунофлуоресценции на замороженных тканях, окрашивание Ig часто маскирует, то есть показывает ложноотрицательное окрашивание при обычной иммунофлуоресценции, но положительное окрашивание при повторном окрашивании тканей, залитых парафином, после расщепления протеазами. Таким образом, если патологоанатом не будет поддерживать высокий индекс подозрения на эту сущность, она может быть ошибочно диагностирована как гломерулопатия С3. Другие состояния, которые были описаны, чтобы показать этот феномен маскировки в гломерулярных отложениях, включают мембранопролиферативный гломерулонефрит со скрытыми монотипическими отложениями Ig и криоглобулинемический гломерулонефрит.2,3

Пациенты, у которых при биопсии обнаружен MGMID, чаще всего молодые женщины.<40 years="" of="" age,="" and="" many="" have="" positive=""> serologic study results such as antinuclear antibodies, although few carry a diagnosis of any well-defined autoimmune disease such as lupus.4 Mean proteinuria in a recent case series of 41 patients was 3.5 g/24 h, and mean serum creatinine was found to be 1.4 mg/dl.4 The deposits of all reported cases that could be tested for IgG subclass were of the IgG1 kappa subclass. Despite this monotypic staining on biopsy, the vast majority of patients tested (>95 процентов) были отрицательными для моноклональных Ig при электрофорезе белков сыворотки, и не было замечено ни одного случая, связанного с основным гематологическим злокачественным новообразованием.

Было высказано предположение, что общие клинико-патологические данные у пациентов с MGMID могут указывать на общий молекулярный патофизиологический механизм, управляющий их заболеванием. Нашей целью при первом сообщении об этом объекте было определение когорты для дальнейшего анализа. 1 Мы описываем здесь присутствие белкового сывороточного амилоидного p-компонента (SAP), обнаруженного уникальным образом в отложениях клубочков MGMID. Иммуноокрашивание на SAP в гломерулярных отложениях является чувствительным и специфичным методом диагностики MGMID, который также обеспечивает понимание патогенеза.

Рисунок 1|Сывороточный амилоидный Р-компонент (САР) значительно обогащен в микрорассеченных клубочках пациентов с мембраноподобной гломерулопатией со скрытыми отложениями каппа-IgG. Для статистического анализа использовали нормированные значения абсолютного количественного определения на основе интенсивности из MaxQuant (Институт биохимии Макса Планка, Планегг, Германия). Пунктирные линии изображают эвристические отсечки для изменения кратности и P-значения. ( а ) На графике вулкана, сравнивающем 3 рецептора фосфолипазы A2 (PLA2R) — положительные мембранные случаи с другими, идентифицируются 2 белка, которые являются явными выбросами в верхнем правом квадранте. (b) Вулканический график, сравнивающий 2 мембранных случая, содержащих домен тромбоспондина 1 типа 7A (THSD7A), с другими идентифицирует 2 белка, которые являются явными выбросами, при этом THSD7A демонстрирует наибольшее кратное изменение. (c) Вулканический график, сравнивающий образцы мембраноподобной гломерулопатии с замаскированными каппа-отложениями IgG со всеми другими типами мембранных случаев, идентифицирует 6 белков, которые являются явными выбросами в верхнем правом квадранте. C6, компонент комплемента 6; С7, компонент комплемента 7; CFHR1, белок 1, родственный фактору комплемента H; HP1BP3, гетерохроматиновый белок 1, связывающий белок 3; HPRT1, гипоксантинфосфорибозилтрансфераза 1; IGHG3, Ig тяжелая постоянная гамма 3.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Масс-спектрометрия микрорассеченных клубочков с лазерным захватом

Масс-спектрометрический анализ микродиссекции клубочков с лазерным захватом из 9 случаев MGMID сравнивали с 8 случаями мембранозной гломерулопатии (MG), включая 3 случая MG, положительных по рецептору фосфолипазы A2 (PLA2R), 2 случая домена 7A, содержащего домен тромбоспондина 1 типа ( THSD7A) – положительный MG и 3 случая волчаночного MG. Всего в этом анализе было идентифицировано 1695 белков. Был проведен проверочный анализ, чтобы проверить, могут ли белки, участвующие в патогенезе MG, быть обнаружены с помощью масс-спектрометрии. Для каждого известного типа мембран дифференциальное содержание белка сравнивали с остальными группами с использованием нормированных значений абсолютного количественного определения на основе интенсивности (iBAQ). Статистический анализ проводили с использованием t-критерия Уэлча, а результаты визуализировали на графике вулканов. PLA2R был значительно более распространен в случаях MG, связанного с PLA2R, и показал самое сильное кратное изменение (рис. 1а). THSD7A продемонстрировал самые сильные кратные изменения в MG, связанном с THSD7A, хотя и с большим значением P из-за небольшого размера выборки в этой группе (n=2; рисунок 1b). В целом, этот подтверждающий принцип анализ продемонстрировал, что масс-спектрометрия микрорассеченных клубочков с лазерным захватом может идентифицировать белки, важные для патогенеза заболевания при мембранозной гломерулопатии.

Затем мы попытались идентифицировать белки, потенциально участвующие в патогенезе MGMID, используя этот подход. В общей сложности 6 белков в образцах МГМИД было значительно больше, чем в других группах (табл. 1). Белком с наибольшим кратным изменением был SAP (рис. 1с). Остальные белки состояли из IgG-каппа, 3 белков комплемента и белка 3, связывающего белок гетерохроматина 1 (HP1BP3). SAP считался лучшим кандидатом, поскольку он был обнаружен во всех образцах MGMID и показал наибольшую разницу в численности по сравнению с образцами без MGMID. Все Ig, идентифицированные с помощью масс-спектрометрии в микрорассеченных клубочках с лазерным захватом в случаях мембраноподобной гломерулопатии с каппа-отложениями IgG, показаны в дополнительной таблице S1. Спектральные подсчеты путем отбора проб всех белков, которые показали увеличение численности на 1 log2 в образцах MGMID и значение P #0.1, показаны в дополнительной таблице S2.

Цистанхеможет улучшитьпочкафункция

Окрашивание САП при мембранозноподобной гломерулопатии

Поликлональные кроличьи антитела против белка SAP (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс) показали сильное положительное окрашивание вдоль базальных мембран клубочков в случаях с MGMID, которые локализовались совместно с IgG при конфокальном анализе. SAP не показал колокализации с IgG в клубочках от PLA2R-ассоциированного MG (рис. 2). Поликлональные кроличьи антитела против HP1BP3 были протестированы в 4 биоптатах с помощью MGMID и показали отрицательное окрашивание гломерулярных отложений во всех 4 случаях.

Окрашивание SAP было выполнено в общей сложности на 211почкабиопсиипри гломерулонефрите (табл. 2). Всего 36 случаев с депозитами иммунного типа, положительными на SAP. Все случаи с положительным окрашиванием имели определенные гистопатологические признаки, включая наличие мезангиальных и субэпителиальных отложений с ограничением IgG каппа и отсутствие эндокапиллярных или мембранопролиферативных изменений при световой микроскопии. SAP был отрицательным во всех случаях со скрытыми отложениями, которые не были MGMID, включая 3 случая криоглобулинемического гломерулонефрита и 3 случая маскированного мембранопролиферативного гломерулонефрита. Он также был отрицательным во всех 19 случаях пролиферативного гломерулонефрита с моноклональными отложениями Ig (PGNMID), включая случаи с IgG1 каппа (4 случая), IgG2 лямбда (1 случай), IgG 3 каппа (8 случаев) и IgG3 лямбда (6 случаев). ). Все 30 случаев поликлональной мембранозной гломерулопатии (PLA2R, THSD7A, волчанка и сегментарная) были отрицательными для SAP. Дополнительные формы гломерулонефрита также изучались и были отрицательными. Среди случаев гломерулонефрита, ассоциированного с инфекцией, было 7 случаев с положительным окрашиванием IgG и 6 случаев с признаками субэпителиальных отложений горба. Как и ожидалось, во всех 6 случаях амилоидоза наблюдалось положительное окрашивание амилоидных отложений. Однако нечеткий рисунок отложений резко контрастировал с зернистым окрашиванием, присутствующим в случаях MGMID. Репрезентативные микрофотографии клубочков, окрашенных SAP при различных почечных заболеваниях, показаны на дополнительном рисунке S1.

Все 32 случая, ранее идентифицированные как MGMID, были положительными для SAP. Кроме того, в 4 из 25 случаев мембранозной гломерулопатии с монотипным отложением IgG, которое не маскируется обычными методами, было выявлено положительное окрашивание на САП в клубочках.

иммунофлуоресценции, включая 4 из 13 случаев с каппа-IgG1, 0 из 2 случаев с лямбда-IgG1, 0 из 5 случаев с каппа-IgG2, 0 из 4 случаев с каппа-IgG3 и {{ 12}} из 1 случая с IgG4 каппа. В целом, 32 из 36 (89 процентов) SAP-позитивной гломерулопатии были замаскированы и соответствовали категории MGMID, тогда как остальные 4 из 36 (11 процентов) были разоблачены и диагностированы как MG с отложениями IgG1 каппа. Пациенты с монотипной мембранозной гломерулопатией, которые не маскировали, но были положительными для SAP, имели средний возраст 33 года с соотношением женщин и мужчин 4:0. Случаи с монотипной мембранозной гломерулопатией, которые не маскировали, но были отрицательными для SAP, имели средний возраст 59,3 года с соотношением женщин и мужчин 15: 4.

Таблица 1|Белки значительно повышены в клубочках больных смембранозноподобная гломерулопатиясо скрытыми каппа-отложениями IgG, как показала масс-спектрометрия

Реактивность сыворотки на SAP

Сыворотки от 22 пациентов с MGMID, 12 с PLA2R-положительной мембранозной гломерулопатией и 6 нормальных контролей были протестированы на реактивность IgG к SAP с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Хотя среди пациентов в каждой группе существовала некоторая вариабельность, не было существенной разницы в реактивности IgG к SAP между группами (дополнительная фигура S2).

Рисунок 2|Колокализация IgG и Р-компонента амилоида сыворотки (SAP). (a–c) Иммунофлуоресцентные эксперименты, проведенные на образце биопсии почки от пациента с диагнозом мембраноподобная гломерулопатия со скрытыми каппа-отложениями IgG, показывают зернистое окрашивание базальной мембраны клубочков для (a) SAP и (b) IgG. (c) Существует сильная совместная локализация SAP и IgG в отложениях базальной мембраны клубочков. ( d – f ) Иммунофлуоресцентные эксперименты, проведенные на образце биопсии почки пациента с мембранными гломерулопатиями, положительными по рецептору 3 фосфолипаз A2, показывают ( d ) отрицательное окрашивание базальной мембраны клубочков на SAP и ( e ) положительное окрашивание базальной мембраны зернистых клубочков на IgG. ( f ) У этого пациента с мембранными гломерулопатиями, связанными с рецептором 3 фосфолипаз A2, отсутствует колокализация. Чтобы оптимизировать просмотр этого изображения, см. онлайн-версию этой статьи в таблице 2|Результаты окрашивания сывороточного амилоидного p-компонента (SAP) в почечных биоптатах

АА, амилоид А; AL, легкая цепь амилоида; C3, компонент комплемента 3; GBM, базальная мембрана клубочков; MG, мембранозная гломерулопатия; MGMID, мембраноподобная гломерулопатия со скрытыми каппа-отложениями IgG; МПГН, мембранопролиферативный; гломерулонефрит; PGMNID, пролиферативный гломерулонефрит с отложениями моноклональных каппа-IgG; PLA2R, рецептор фосфолипазы А2; THSD7A, 7A, содержащий домен тромбоспондина 1 типа.

ОБСУЖДЕНИЕ

MGMID представляет собой недавно описанный уникальный паттерн гломерулопатии, характеризующийся субэпителиальными и мезангиальными отложениями, которые окрашиваются на IgG-каппа с помощью парафинового IF (рис. 3). Пациенты с этим типом гломерулопатии, как правило, молодые женщины (возраст<40 years)="" and="" often="" have="" vague="" autoimmune="" phenomena.="" we="" report="" here="" the="" discovery="" by="" mass="" spectrometry="" of="" increased="" sap="" in="" the="" glomeruli="" of="" these="" patients="" and="" show="" positive="" staining="" for="" this="" protein="" in="" the="" glomerular="" deposits="" of="" 100%="" of="" cases="" diagnosed="" as="" mgmid.="" positive="" staining="" for="" sap="" was="" also="" tested="" in="" a="" wide="" variety="" of="" igmediated="" glomerulonephritis="" types="" and="" found="" to="" be="" present="" in="" 4="" of="" the="" 173="" cases="" tested="" that="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" or="" amyloidosis.="" all="" of="" these="" cases="" that="" stained="" positive="" for="" sap="" but="" were="" not="" diagnosed="" as="" mgmid="" shared="" histopathologic="" fifindings="" with="" mgmid,="" including="" the="" pattern="" of="" immune="" deposition="" and="" igg1="" kappa="" restriction,="" only="" differing="" by="" the="" fact="" that="" they="" did="" not="" mask="" by="" routine="" immunofluorescence.="" additionally,="" these="" patients="" were="" demographically="" similar="" to="" mgmid="" patients="" in="" that="" they="" tended="" to="" be="" young="">

SAP представляет собой пентамерный белок 25-kDa в семействе пентраксинов, который кодируется геном APCS и широко распространен в сыворотке крови и является компонентом базальной мембраны клубочков.5 Хотя точная функция SAP неясна, она известна. взаимодействовать в плазме с широким спектром белков, включая компоненты комплемента, аполипопротеины, регуляторы коагуляции и протеолиза.6 Он образует стабильные кальций-зависимые взаимодействия со своими лигандами, включая белки, липопротеины и ДНК, защищая их от деградации. SAP служит растворимой молекулой распознавания образов, участвующей во врожденном иммунном ответе, распознавая различные молекулярные структуры, связанные с патогенами и повреждениями, включая микробные компоненты и остатки апоптотических клеток.7 Взаимодействие SAP с молекулярными молекулами, связанными с патогенами или повреждениями способствует опосредованному комплементом очищению от апоптотических клеточных дебрисов путем прямого связывания с компонентом комплемента 1q (C1q) и активации классического пути комплемента. Известно, что, несмотря на активацию комплемента, САП обеспечивает иммунорегуляцию, снижая нейтрофильную активность.воспалениев тканях за счет снижения адгезии эндотелия8, снижения функции эластазы9 и уменьшения возвращения к тканям.10 Также известно, что SAP является основным связывающим белком для ДНК и хроматина в плазме.11

При болезни САП наиболее известен тем, что входит в состав отложений амилоидоза. Хотя он менее изучен, есть также свидетельства того, что он может играть роль в моделях аутоиммунных заболеваний человека и животных. Антитела к SAP были выявлены у пациентов саутоиммунныйболезни, и было показано, что сниженная экспрессия SAP способствуетаутоиммунитетв мышиных моделях. Антитела к САП выявляются у 44% пациентов с системной красной волчанкой, при этом титры антител коррелируют с активностью заболевания. предрасположенных мышей 129/Sv при скрещивании с мышами C57BL/6 (129/Sv x C57BL/6 F2)13, но не только в штамме 129/Sv, что позволяет предположить, что основная генетическая предрасположенность может быть необходима для дефицита САП для индукции аутоиммунитета.14 мыши демонстрируют выработку антинуклеарных антител, антител против одноцепочечной ДНК, антител против двухцепочечной ДНК и ревматоидных факторов. У них развивается пролиферативныйиммунныйкомплексно-опосредованный гломерулонефрит, чаще у женщин. 13 В мышиной модели волчаночного нефрита, где гломерулонефрит индуцируется инъекцией активированной собственной ДНК в сыворотке, генная терапия SAP с помощью плазмидного вектора снижала выработку антител против двухцепочечной ДНК. , отложение иммунных комплексов и воспаление почек, а также предотвращало возникновение волчаночного нефрита.15

Рисунок 3|Результаты биопсии почек при мембранозноподобной гломерулопатии со скрытыми каппа-отложениями IgG. Здесь показаны микрофотографии биопсии, показанной на рисунке 2. ( а ) Сегментарные спайки присутствуют вдоль базальных мембран клубочков, окрашивание метенамином серебра по Джонсу (исходное увеличение × 400). (b) Электронная микроскопия выявляет субэпителиальные отложения вдоль базальной мембраны клубочков (исходное увеличение × 12,000). ( c ) окрашивание клубочков отрицательное на IgG с помощью обычной иммунофлуоресценции на свежей ткани (прямая иммунофлуоресценция; исходное увеличение × 400). ( d ) Клубочки из того же случая положительно окрашиваются на ткани, залитой парафином, после расщепления протеазой (прямая иммунофлуоресценция; исходное увеличение × 400). (e) Клубочки показывают окрашивание каппа и (f) не лямбда на расщепленной протеазой ткани, залитой парафином (прямая иммунофлуоресценция; исходное увеличение × 400). Чтобы оптимизировать просмотр этого изображения, ознакомьтесь с онлайн-версией этой статьи на сайте www.почка-international.org.

Несмотря на рестрикцию легких цепей, наблюдаемую при биопсии, в настоящее время нет доказательств того, что это состояние связано с лежащими в основе лимфопролиферативными заболеваниями или циркулирующими моноклональными Ig. время. Роль аутоантител SAP также неясна. В отличие от других форм мембранозной гломерулопатии с белком, специфически присутствующим в иммунных отложениях, таких как заболевание, связанное с PLA2R,16 MGMID, по-видимому, не управляется аутоантителами, направленными против SAP, поскольку нам не удалось обнаружить реактивность сывороточных антител против SAP у пациентов с MGMID. . Альтернативное объяснение заключается в том, что IgG каппа присутствует в результате нормального взаимодействия между этими двумя белками, а не аутоиммунного взаимодействия антиген-антитело, поскольку известно, что каппа-цепь Ig является частью нормального интерактома сывороточного SAP.6 Следовательно, хотя и полезно для тканевой диагностики этого объекта, тестирование на антитела к SAP в сыворотке в настоящее время не служит неинвазивной диагностикой, и основная причина этого заболевания остается загадкой.

Клинические исходы при MGMID чрезвычайно вариабельны: от спонтанной ремиссии до прогрессирования и терминальной стадии.почкаболезньс рецидивом в трансплантате. Ретроспективный анализ не смог показать какой-либо связи между используемым лечением и клиническим исходом.4 Открытие участия SAP в этом заболевании потенциально может иметь значение для терапии. Терапия, непосредственно направленная на SAP, показала ранние перспективы в лечении амилоидоза. в MGMID клубочки связаны с комплементом. Необходимы дополнительные исследования для выявления биомаркеров активности этого заболевания, а также методов лечения.

Причина маскировки иммунных отложений в биоптатах MGMID при рутинной иммунофлуоресценции остается загадкой. Присутствие SAP в отложениях вызывает новые возможные объяснения этого явления в случаях MGMID. Например, известно, что взаимодействия белка SAP в значительной степени зависят от Ca2+,6 и многие транспортные среды и буферы, используемые при обработке ткани почечной биопсии для иммунофлуоресценции, лишены Ca2+. Это отсутствие Са2+ in vitro может привести к разрушению иммунных отложений, так что они больше не будут доступны для обнаружения с помощью иммунофлуоресценции на замороженной ткани. Однако отложения иммунных комплексов остаются доступными для обнаружения в ткани, фиксированной формалином, в результате индуцированных формалином ковалентных химических связей между белками в ткани.

Здесь мы впервые описываем уникальное присутствие SAP в гломерулярных отложениях MGMID. Кроме того, мы показываем, что окрашиваниепочкабиопсиидля SAP выявляет случаи с клинико-патологическими признаками, аналогичными таковым при MGMID, без маскирования, с помощью обычной иммунофлуоресценции. Учитывая эти результаты, мы считаем, что положительное окрашивание гломерулярных отложений на САП идентифицирует уникальную форму гломерулонефрита, которая имеет общий патофизиологический механизм заболевания. До недавнего описания MGMID эти случаи были диагностированы по многочисленным разрозненным категориям, начиная от гломерулопатии С3 и заканчивая гломерулонефритом, ассоциированным с инфекцией, и атипичной мембранозной гломерулопатией. Быстрая эволюция диагностических критериев и наше понимание этой формы гломерулонефрита подчеркивают силу массы. спектрометрия для обеспечения патофизиологического понимания иммуноопосредованного гломерулонефрита.

МЕТОДЫ

Методы обработки биопсии почки

Использовались стандартные методы обработки почечной биопсии, включая световую, иммунофлуоресцентную и электронную микроскопию.19,20 Все образцы световой микроскопии окрашивали гематоксилином и эозином, метенаминовым серебром Джонса, трихромом Массона и реагентом Шиффа-периодной кислоты. Все срезы прямой иммунофлуоресценции вырезали на 4 мм и реагировали с поликлональными кроличьими античеловеческими антителами, меченными флуоресцеином, к IgG, IgA, IgM, C3, C1q, фибриногену и легким цепям k- и l (Dako, Carpenteria, CA). на 1 час и промыть; покровное стекло наносили с использованием водной заливочной среды. Отдельные случаи были окрашены на меченные флуоресцеином поликлональные мышиные античеловеческие антитела к IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури). Иммунофлюоресценция в парафине выполнялась после расщепления протеазой, как описано ранее.2,3 Всего для масс-спектрометрического анализа было отобрано 9 биоптатов MGMID и 8 контрольных биопсий с мембранозной гломерулопатией других типов. Протокол исследования был одобрен Институциональным наблюдательным советом по решениям и соответствовал принципам Хельсинкской декларации.

Цистанхе можеттонизироватьпочка

Масс-спектрометрия микрорассеченных клубочков с лазерным захватом

Ткань биопсии почки из фиксированной формалином ткани, залитой в парафин, вырезали толщиной 10 мм на предметных стеклах с рамкой ПЭТ-мембраны Leica (Leica, Wetzlar, Germany). Затем эти слайды окрашивали гематоксилином. Клубочки были микродиссекции в микроцентрифужные пробирки с использованием микроскопа Leica DM60{{20}}0B. Микрорассеченные клубочки лизировали в 2-процентном растворе додецилсульфата натрия и 0,1 М дитиотреитоле при 99°С в течение 1 часа и обрабатывали методом пробоподготовки с помощью фильтрации (FASP).21 Осветленный лизат переносили в концентраторы Vivacon 500 (MWCO 30 кДа; Sartorius , Гёттинген, Германия). Додецилсульфат натрия удаляли повторными промываниями 8 М мочевиной в 0,1 М трис(гидроксиметил)-аминометан/Cl, рН 8,5; затем образцы алкилировали 0,05 М иодацетамидом. Йодоацетамид удаляли 3 промывками 8 М мочевиной/0,1 М трис(гидроксиметил)аминометаном/Cl, рН 8,5, с последующими 3 промываниями 0,05 М бикарбонатом аммония. Белки расщепляли трипсином (класс для секвенирования, Promega, Madison, WI) в весовом соотношении 40:1 при 37°С в течение 16 часов. Пептиды собирали центрифугированием и обессоливали на наконечниках C18-Stage (Thermo Scientific, Waltham, MA).

Расщепленные пептиды анализировали с помощью масс-спектрометрии NanoLC-tandem с использованием масс-спектрометра Thermo Orbitrap Fusion Lumos (Thermo Scientific). Пептиды загружали в колонку с обращенно-фазовой ловушкой (Integra-frit, New Objective, Woburn, MA), содержащую 2,5 мм заряженную гибридную смолу Waters XSelect (Waters Corp., Милфорд, Массачусетс), соединенную с 15{5}} мм X 0.0Аналитическая колонка 75 мм, содержащая ту же обращенно-фазовую смолу, которая используется в ловушке. Затем была использована система сверхэффективной жидкостной хроматографии nanoAcquity (Waters Corp.) для создания 60-минутного градиента от 98:2 до 6{16}}:40 соотношения буфера A: B (буфер A=0,1% муравьиной кислоты). 0,5 % ацетонитрила, буфер B=0,1 % муравьиной кислоты, 99,9 % ацетонитрила).

Пептиды элюировали из колонки со встроенным распылительным наконечником (Picofrit, New Objective) и ионизировали электрораспылением (2,0 кВ) с последующим анализом тандемной масс-спектрометрии с использованием диссоциации, индуцированной столкновением с более высокой энергией (HCD). Обзорное сканирование предшественников пептидов выполняли с разрешением 240K (при 400 m/z) с мишенью для подсчета ионов 5×10⁵. Тандемную масс-спектрометрию проводили путем выделения при 1,6 Th с квадруполем, фрагментации HCD с нормализованной энергией столкновения 30 и масс-спектрометрического анализа с быстрым сканированием в ионной ловушке. Полученные данные тандемной масс-спектрометрии были сопоставлены с самой последней базой данных людей Uniprot, содержащей записи Swiss Prot и TREMBLE, с использованием

MaxQuant (Институт биохимии им. Макса Планка, Планегг, Германия). Визуализацию данных проводили с помощью Scaffold v4.6 (Proteome Software, Портленд, штат Орегон). Уровень ложных открытий был установлен на уровне 1 процента для совпадений пептидов со спектрами. Для количественного анализа использовали нормализованные значения iBAQ от MaxQuant. Распределения iBAQ для каждого образца были скорректированы по медиане, чтобы контролировать различия в нагрузке. Значения iBAQ, равные нулю, были удалены из набора данных. Для проверки статистической гипотезы 2-выборочный t-критерий Уэлча был выполнен для каждого белка с использованием нормализованных значений iBAQ для 2 групп. Если белок был обнаружен только в одной группе, выполнялся 1-выборочный t-критерий Уэлча с использованием наименьшего обнаруженного значения iBAQ в качестве нулевой гипотезы.

Окрашивание SAP

Фиксированные формалином и залитые парафином срезы толщиной 3 мм депарафинизировали и проводили выделение антигена при температуре 99°С. Срезы реагировали с кроличьим поликлональным анти-SAP поликлональным антителом (1:400; ThermoFisher, Уолтем, Массачусетс), а затем с конъюгированным с родамином красным Х-конъюгированным козьим антикроличьим вторичным антителом, которое адсорбировали в твердой фазе, чтобы гарантировать минимальную перекрестную реакцию с человеческим IgG (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). В каждом случае использовали положительный и отрицательный контроль. Окрашивание оценивали с помощью стандартной иммунофлуоресцентной микроскопии. Он считался положительным, если в клубочках имелось положительное окрашивание зернистых капиллярных петель, и отрицательным, если капиллярная петля отсутствовала.

окрашивание в клубочках. Колокализацию IgG и SAP в базальных мембранах клубочков исследовали с помощью конфокальной микроскопии с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа Zeiss LSM 880 (Zeiss Microscopy, Йена, Германия). Для этого анализа поликлональные (конъюгированные с флуоресцеин-изотиоцианатом) кроличьи антитела к человеческому IgG (1:40; Agilent, Санта-Клара, Калифорния) реагировали с извлеченной при нагревании тканью после окрашивания на SAP, как описано выше. Отрицательные контроли были выполнены для обеспечения специфичности антител путем исключения первичных антител. Четыре случая MGMID были проверены на наличие HP1BP3 (1:100; Thermo Fisher, Waltham, MA) с помощью окрашивания иммунопероксидазой.

Тестирование на сывороточные антитела к SAP

Белок SAP (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота; {{0}}SAB-050) разбавляли до 3 нг/мл в карбонатно-бикарбонатном буфере (pH 9,6) и наносили на {{ 6}}луночный планшет Immulon H2 (Thermo Scientific) в течение ночи при 4 градусах. Планшеты трижды промывали с использованием 200 мл промывочного буфера (1× фосфатно-солевой буфер и 0,05% твин) и блокировали на 2 часа блокирующим буфером (1× фосфатно-солевой буфер, 0,05% твин, 1 процент рыбьего желатина). Затем планшеты промывали 3 раза 200 мл промывочного буфера. В каждую лунку добавляли 20 мкл разведенной сыворотки (1:100 в промывочном буфере) и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Планшеты промывали 7 раз 200 мл промывочного буфера с последующим добавлением детектирующего антитела против человеческого IgG-HRP (Jackson ImmunoResearchLaboratories; 309-035-003). Планшеты промывали 7 раз 200 мл промывочного буфера. Затем субстрат 3,3',5,5'-тетраметилбензидинпероксидазы и субстрат пероксидазы Sol B смешивали в соотношении 1:1 и добавляли 100 мл в планшет. Реакцию останавливали добавлением 100 мл 2М H2SO4, оставляли на столе на 20 минут перед измерением при 450 нм. Для контроля, чтобы убедиться, что белок SAP связан с планшетом, мы использовали кроличьи анти-SAP (Invitrogen, Carlsbad, CA; PA1-28361) в серийных разведениях, а затем анти-кроличьи IgG-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories). ; 111-035-144). Контроль показал хорошую корреляцию между разбавлением антитела и абсорбцией со средним значением R-квадрата 0,95.

Цистанхе для улучшенияпочкафункция

РАСКРЫТИЕ

Все авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ

МАТЕРИАЛ Дополнительный файл (PDF)

Рисунок S1. Репрезентативные изображения окрашивания гломерулярного SAP при различных почечных заболеваниях.

Рисунок S2. Исследования серореактивности против SAP методом иммуноферментного анализа.

Таблица S1. Все Ig идентифицированы с помощью масс-спектрометрии в микрорассеченных клубочках с лазерным захватом в случаях мембраноподобной гломерулопатии с отложениями каппа-IgG.

Таблица S2. Спектральные подсчеты путем выборки всех белков показали увеличение содержания на $1 log2 в образцах MGMID и значение P # 0.1.

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Ларсен С.П., Амбруз Дж.М., Бонсиб С.М. и соавт. Мембранозноподобная гломерулопатия со скрытыми отложениями каппа-IgG.ПочкаМеждунар. 2014; 86: 154–161.

2. Мессиас Н.К., Уокер П.Д., Ларсен К.П. Парафиновая иммунофлуоресценция в лаборатории почечной патологии: больше, чем метод спасения. Мод Патол. 2015;28:854–860.

3. Ларсен С.П., Мессиас Н.К., Уокер П.Д. и соавт. Мембранопролиферативный гломерулонефрит со скрытыми монотипическими отложениями иммуноглобулинов. почки инт. 2015;88:867–873.

4. Ларсен С.П., Бойлс С.Л., Косси Л.Н. и соавт. Клинико-патологические особенности мембраноподобной гломерулопатии со скрытыми каппа-отложениями IgG. Kidney Int Rep. 2016; 1: 299–305.

5. Эмсли Дж., Уайт Х.Э., О'Хара Б.П. и др. Структура пентамерного амилоидного Р-компонента сыворотки крови человека. Природа. 1994; 367: 338–345.

6. Poulsen ET, Pedersen KW, Marzeda AM, et al. Интерактом сывороточного амилоидного компонента P (SAP) в плазме человека, содержащий физиологические уровни кальция. Биохимия. 2017; 56: 896–902.

7. Агравал А., Сингх П.П., Боттацци Б. и др. Распознавание образов пентраксинами. Adv Exp Med Biol. 2009; 653: 98–116.

8. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, et al. Пентраксины PTX3 и SAP во врожденном иммунитете, регуляции воспаления и ремоделировании тканей. J Гепатол. 2016;64:1416–1427.

9. Ли Дж.Дж., МакАдам К.П. Компонент амилоида Р человека: ингибитор эластазы. Сканд Дж. Иммунол. 1984; 20: 219–226.

10. Кокс Н., Пиллинг Д., Гомер Р.Х. Сывороточный амилоид P: системный регулятор врожденного иммунного ответа. Дж. Лейкок Биол. 2014;96:739–743.

11. Kravitz MS, Pitashny M, Shoenfeld Y. Защитные молекулы — C-реактивный белок (CRP), сывороточный амилоид P (SAP), пентраксин3 (PTX3), маннозо-связывающий лектин (MBL) и аполипопротеин A1 (Apo A1), и их аутоантитела: распространенность и клиническое значение при аутоиммунитете. Дж. Клин Иммунол. 2005; 25: 582–591.

12. Зандман-Годдард Г., Бланк М., Лангевитц П. и др. Антитела к амилоидному компоненту Р у пациентов с системной красной волчанкой коррелируют с активностью заболевания. Энн Реум Дис. 2005; 64: 1698–1702.

13. Bickerstaff MC, Botto M, Hutchinson WL, et al. Компонент сывороточного амилоида P контролирует деградацию хроматина и предотвращает антиядерный аутоиммунитет. Нат Мед. 1999; 5: 694–697.

14. Гиллмор Дж.Д., Хатчинсон В.Л., Герберт Дж. и соавт. Аутоиммунитет и гломерулонефрит у мышей с направленной делецией гена компонента Р амилоида сыворотки: недостаточность САП или комбинация штаммов? Иммунология. 2004; 112: 255–264.

15. Чжан В., Ву Дж., Цяо Б. и др. Улучшение люпус-нефрита с помощью генной терапии сывороточного амилоида P-компонента с различными механизмами варьировалось от разных стадий заболевания. Плос Один. 2011;6:e22659.

16. Бек Л.Х., Бонегио Р.Г., Ламбо Г. и соавт. Рецептор фосфолипазы А2 М-типа как антиген-мишень при идиопатической мембранозной нефропатии. N Engl J Med. 2009; 361:11–21.

17. Ричардс Д.Б., Куксон Л.М., Берджес А.С. и соавт. Терапевтический клиренс амилоида антителами к Р-компоненту сыворотки. N Engl J Med. 2015; 373:1106–1114.

18. Ричардс Д.Б., Куксон Л.М., Бартон С.В. и др. Повторные дозы антител к компоненту Р амилоида сыворотки очищают от амилоидных отложений у пациентов с системным амилоидозом. Sci Transl Med. 2018;10.

19. Уокер П.Д., Кавалло Т., Бонсиб С.М. Практические рекомендации по биопсии почки. Мод Патол. 2004; 17: 1555–1563.

20. Уокер, полиция. Биопсия почки. Arch Pathol Lab Med. 2009; 133:181–188.

21. Вишневски Дж. Р., Зоугман А., Нагарадж Н. и соавт. Универсальный метод пробоподготовки для анализа протеома. Нат Методы. 2009;6: 359–362.