Почему цистанха влияет на апоптоз клеток PC12?

Влияние цистанхи на апоптоз клеток PC12

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Тянь Цзиюй¹, Чэнь Цзяньцзун¹, Чэнь Сяоли², Ян Хао³

¹Кафедра традиционной китайской медицины,²Отделение фармации, больница Сицзин,³Институт нейробиологии НОАК, Четвертый военно-медицинский университет, Сиань 710033, Китай

Абстрактный

ЦЕЛЬ:Исследовать эффектыЦистанчена 1-метил-4-фенилпиридиний (MPP+)-индуцированныйАпоптоз клеток PC12.

МЕТОДИКА: Ячейки PC12подвергались воздействию 200 мкмоль/л только MPP+ или MPP+ в сочетании с различными концентрациямиЦистанчеиз новозеландской сыворотки Белого кролика. ПоследствияЦистанченаапоптоз клеток PC12были обнаружены с помощью проточной цитометрии, электронной микроскопии и флуоресцентной микроскопии.

РЕЗУЛЬТАТЫ:Сыворотки, собранные у кроликов, которых кормили эквивалентной дозировкойЦистанчеили на двукратной эквивалентной дозировкеЦистанчеоказывал явное защитное воздействие наЯчейки PC12ичастота апоптоза клеток PC12инкубированные с этими двумя сыворотками составили 2,8% и 10,2% соответственно, которые были явно ниже, чем уЯчейки PC12только при лечении MPP+ (18 , 6 %, P<0>

ЗАКЛЮЧЕНИЕ:Цистанчеможет защититьЯчейки PC12Отапоптозиндуцированный MPP+.

Ключевые слова:ЦистанчеПустынникола, 1-метил-4-фенилпири-диниум,Ячейки PC12,апоптоз

Знакомство

Патогенезом болезни Паркинсона (болезнь Паркинсона, БП) является повреждение и потеря черной субстанции дофаминергических нейронов, иапоптозможет быть важной причиной. Мы используем проточную цитометрию (FACS), просвечивающую электронную микроскопию и флуоресцентное окрашивание ядерного анализа формы и другие методы для обнаружения китайской медициныЦистанчеМедикаментозная сыворотка и нейротоксин 1-метил-4-фенилпиридиний (1-метил-4-фенилпиридиний, М РР+) обработаны клетками PC12, чтобы исследовать влияние Цистанхе на нейроны Защитный механизм действия.

ПоследствияЦистанчеоб апоптозе клеток PC12

1. Материалы и методы

1.1 Материалы

Ячейки PC12были приобретены у Японского фонда наук о жизни; Культуральная среда RP-MI1640, сыворотка для телят и коллаген крысиного хвоста были приобретены у Gibco; MPP+, Annexin V-FITC, PI, PBS, колбы для клеточных культур и культуральные пластины были приобретены у Sigma; Китайская медицинаЦистанчебыл куплен у Сианьской фабрики отваров; Новозеландский ушастый белый кролик (самец, масса тела 2,5 ~ 3 кг) был предоставлен центром школьных животных; Hoechst33342 был куплен у компании Biyuntian; Параформальдегид был домашним чистым; ЦЕНТРИФУГА LD4-Тип 2 (Пекинский завод медицинских центрифуг), Флуоресцентный микроскоп приборов (компания Laika), инвертированный микроскоп (компания Olympus), просвечивающий электронный микроскоп JEM-2000EX (Япония), инкубатор постоянной температуры CO2 (Here-cus HERAcell, Германия), проточный цитометр Coulter EPICS (Beck-man Coulter, США).

1.2 Метод

Ячейки PC12были выращены в клеточной культуральной среде RPMI1640, которая содержала 100 мл/л сыворотки для телят. Колбу для культивирования клеток и культуральную пластину перед использованием покрывали коллагеном крысиного хвоста 0,2 г/л. Культивируемые клетки помещали при 37 °C, в инкубаторе CO2 объемом 50 мл/л меняли среду в течение 3 дней. Когда монослойные культуральные клетки вот-вот сольются, переваривают с 1,25 г/л трипсина и субкультуры. Когда клетки субкультуры входят в фазу логарифмического роста, можно добавлять лекарственные препараты. В соответствии с массой тела кролика эквивалентная доза животного преобразуется в соответствии с площадью поверхности тела. Традиционная китайская медицинаЦистанчеготовят в виде лиофилизированного порошка, который при использовании разбавляют дистиллированной водой, а животному вводят дважды в день в течение 3 дней (Chinese Experimental Formula Chinese Journal of Science, 1998; 4:13-15), через 1 ч после последнего ig, каротидное кровопускание, на ночь при 4 °C, центрифугирование при 2500 об/мин в течение 25 мин, отделение сыворотки, инактивация при 56 °C, 30 мин и 0. Стерилизация с помощью фильтрующей мембраны 22 мкм и хранение при -20 °C. В тех же условиях готовили пустую контрольную сыворотку кролика, 1/2, 1 и 2 раза эквивалентную дозу сыворотки. Эксперимент был разделен на 5 групп: группа А представляла собой группу сыворотки для кроликов, группа В в 2 раза превышала эквивалентную дозу сыворотки + МПП + группа (доза цистанче сырого препарата 6,4 г/кг), группа С - эквивалентная доза сыворотки + МПП + группа (доза цистанче сырого препарата 3,2 г/кг), группа D представляет собой полуэквивалентную дозу сыворотки + МПП + группа (в дозе Цистанче сырой препарат 1,6 г/кг), группа Е - чистая кроличья сыворотка + МПП + группа. Субкультура в течение 12 ч. В дальнейшем наблюдают за клетками под инвертированным микроскопом и добавляют препарат перед слиянием. Содержание сыворотки в каждой группе составляет 10%. После культивирования в течение 3 дней МПП+ добавляют к конечной концентрации 200 мкмоль/л. Помещают при 37 °C, 50 мл/л CO2 культуры и проверяют ее после 24 часов инкубации.

1.2.1 Наблюдение за флуоресцентным окрашиванием клеток PC12

Добавить Hoechst33342 к культуреЯчейки PC12при конечной концентрации 10 мг/л инкубировать при 37 °С в течение 30 мин, смешивать 40 г/л параформальдегида и культуральной среды при 13: для получения конечной концентрации параформальдегида 10 г/л после фиксации в течение 5-10 мин, выбрасывать надосадочный материал, промывать PBS и наблюдать под флуоресцентным микроскопом.

1.2.2 Наблюдение с помощью просвечивающего электронного микроскопа

После 24 часов лечения препаратом клетки собирали и переносили в центрифужную трубку, центрифугировали при 1500 об/мин, 4 °C в течение 5 мин и дважды промывали 10 ммоль/л PBS. Центрифугу при 1500 об/мин, 4 °C в течение 5 мин, отбросили супернатант, медленно добавляют 25 мл/л глутарового альдегида вдоль стенки трубки и фиксируют при 4 °C в течение 2 ч, отслаивают комочки клеток прямой пипеткой, промывают 3 раза PBS, 5 мин каждый раз, фиксируют в течение 1 ч после осмиевой кислоты при 4 °C Постградиентное обезвоживание ацетона, Замачивание и встраивание эпоксидной смолы, нарезанное ультратонким микротомом LKB-2188, окрашенное цитратом уранилацетата-свинца, наблюдаемое просвечивающим электронным микроскопом и фотографируемое.

1.2.3 Обнаружение проточной цитометрии

М ПП + курс лечения в течение 24 ч, переваривание 106 адгезивЯчейки PC12с 1,25 г/л трипсина дважды промыть PBS, добавить 490 мкл связывающего буфера, тщательно перемешать клетки и добавить 5 мкл Annexin V-FI TC Mix 10 мкл растворенного PI в клеточной суспензии, аккуратно перемешать, поместить пробирку при 4 °C, инкубировать в течение 10 мин в темноте и выполнить обнаружение на проточном цитометре. Каждая группа имеет 4 реплицированные скважины.

Статистическая обработка: данные представлены x ±s, сравнение между несколькими группами выполняется тестом Крускала-Уоллиса, а попарное сравнение выполняется тестом Манна-Уитни и P<0.05 is="" considered="" as="" a="" significant="">

Влияние цистанхи на апоптоз клеток PC12

2. Результаты

2.1 Флуоресцентный микроскоп наблюдения за клетками PC12

Нормально выращиваетсяЯчейки PC12может излучать равномерную флуоресценцию после окрашивания Hoechst33342, а плотно окрашенная зернистая массовая флуоресценция и пунктирная белая флуоресценция могут быть замечены в ядре апоптотической клетки. Ядро большинства клеток в нормальной группе относительно однородно. Синяя флуоресценция, слабо видимая точечная конденсированная точечная флуоресценция, ее конденсированная точечная флуоресценция слабее, чем MPP + контрольные ячейки. Нормально выращенные клетки показывают равномерную синюю флуоресценцию после окрашивания Хёхста, а морфология ядра является регулярной (рис. 1А); После MPP+ ядерный хроматин выглядит концентрированным или сильно конденсированным, демонстрируя неправильную точечную флуоресценцию, или маргинализованным; ядра поздних клеток расщепляются на фрагменты (рис. 1В). Эквивалентная доза и 2-кратная эквивалентная доза В клеткахЦистанчемедикаментозная сыворотка + М РР + группа были близки к норме (рис. 1С, Д).

Рис 1Ячейки PC12окрашен с помощью Hoechst33342(Ho)

A : Контроль: Хроматин равномерно распределяется и окрашивается регулярно; B : MPP+ обработанный: Конденсация и маргинализация хроматина на ядерной мембране; C : ЭквивалентЦистанче+ MPP+ обработано ed;D: Двукратный эквивалент Cistanche + MPP+ обработан, хроматин в норме.

2.2 Наблюдение с помощью проекционного электронного микроскопа

Обычно культивируетсяЯчейки PC12имеют однородный ядерный хроматин, прозрачную и полную ядерную мембрану, обильные цитоплазматические митохондрии и полные органеллы (рис. 2А). После обработки MPP+ клетки PC12 значительно изменились, клеточная мембрана неповреждена, поверхность микроворсинок исчезла, а цитоплазма сконцентрирована, хроматин конденсируется, разрушается, сильно конденсируется и собирается на внутренней поверхности ядерной мембраны, показывая характеристикиапоптоз, преимущественно в ранних и средних стадиях апоптотических клеток (рис. 2В, С). Апоптотические клетки в каждой группе, содержащейЦистанчеСыворотки очевидны Уменьшение, ядерный хроматин равномерно распределен, ядерная мембрана четкая и полная, а органеллы неповреждены, близко к клетке, показанной на рис. 2А.

2.3 Результаты испытаний проточной цитометрии

Фосфатидилсерин (PS), расположенный на внутренней стороне клеточной мембраны, мигрировал на внешнюю сторону клеточной мембраны на ранней стадииапоптоз. Апоптотические показатели каждой группы составили (2,3 ± 0,11)%, (2,8 ± 0,21)%, (10,2 ± 0,60)%, (16,0 ± 0,87)% и (18,6 ± 0,67)%. Ранговый тестовый анализ группы B, C, D в сравнении с группой E P<0.05. there="" is="" a="" significant="" difference="" between="" serum-containing="" chinese="" medicine="" and="" the="" blank="" serum="">

Рис 2Ячейки PC12ультраструктура EM ×6000

A: Без MPP + равномерно диспергированный хроматин слегка электронно-плотной цитоплазмой, нормальной структурой органелл и интактной клеточной мембраной; B, C: Подвергается воздействию 200 мкмоль/л M PP +. Ранняя апоптотическая фаза, периферическая конденсация хроматина, почти нормальная структура цитоплазмы (B). Поздняя пост-от-ic фаза, дальнейшая конденсация хроматина, повышение плотности цитоплазматического электрона, отсутствие нормальной структуры органелл и нарушение целостности клеточной мембраны (C).

3. Обсуждение

Нейротоксичность M PP+ представляет собой сложный процесс многокомпонентного действия, включая эффект препятствования замене митохондрий и синаптических везикул дофамином для производства активных форм кислорода [1]. В настоящее время считается, что большинство из них связаны с митохондриальными клетками.апоптозНейротоксический эффект дофамина приводит к апоптозу, связанному с [,2] В процессе наблюдения за апоптозом субстанции nigra дофаминовой клеточной линии SN4741 по M PP+ происходит активация Caspase-1 и Caspase-3 [3].1 мкмоль/L MPP+ действует на SH-SY5Y клетки нейробластомы надпочечников и может увеличить экспрессию связанного с апоптозом белка Bcl-2 через несколько дней [4].Цистанче— сухой чешуйчатый лист семейства Цистанхе (Cistanche) семейства ЦистанхеЦистанче. Мясистый стебель цистанчи обладает хорошим лечебным эффектом при лечении болезни Альцгеймера и БП. Общие гликозиды цистанхе могут эффективно поглощать различные активные свободные радикалы кислорода и могут защитить окисление ДНК, вызванное ОН. [5]. Sheng et al. [6] исследования подтвердили, что экстракт цистанче тубулкозид В может ослаблять MPP+-индуцированную цитотоксичность, ослаблять накопление активных форм кислорода в клетке и оказывать антагонистическое действие на MPP+-индуцированныйапоптози окислительный стресс. Мы заметили, чтоЦистанчеоказывает антагонистическое действие на MPP+-индуцированный PC12 Действие клеткиапоптоз, и защитный эффектЯчейки PC12увеличивается с увеличением дозы.

Влияние цистанхи на апоптоз клеток PC12

Ссылка

[1] Лотариус Дж., О Малли КЛ . Вызывающий паркинсонизм препарат 1-метил-4-фенилпиридиний вызывает внутриклеточное окисление дофамина. Новый механизм токсичности [J]. J Biol Chem, 2000;275 (49):38581-38588 .

[2] Маруяма В., Наои М. Гибель клеток при болезни Паркинсона [J]. J Neurol, 2002;249(S Suppl 2):6-10.

[3] Chun HS, Gibson GE, DeGiorgio LA, et a l. Дофаминергическая гибель клеток, индуцированная MPP(+), окислителем и специфическими нейротоксикантами, имеет общий молекулярный механизм [J]. J Neurochem, 2001;76(4): 1010-1021.

[4] Veech GA, Dennis J, Keeney PM, et al. Нарушенная функция переноса электронов митохондрий увеличивает экспрессию антиапоптотического белка Bcl-2 и Bcl-XL в нейробластоме SH-SY5Y и цибридных клетках болезни Паркинсона через окислительный стресс [J]. J Neu- rosti Res, 2000;6(1):693-700.

[5] Ван Сяовэнь, Цзян Сяоянь, У Лия и др. In vitro очистка свободных радикалов и защитное воздействие на ОН·индуцированное повреждение ДНК, вызванное общими гликозидамиЦистанче[J]. Китайский фармацевтический журнал, 2001; 36(1): 29-32. Wang XW , Ji ang XY, Wu LY, et a l. Исследование общих гликозидов cist дюймов, устраняющих свободные радикалы и защищающих поврежденную ДНК in vitro [J]. Чин Фарм, 2001;36(1):29-32.

[6] Sheng G, Pu X, Lei L, et al. Tubuloside B отцистанчесальса спасает нейронные клетки PC12 от 1-метил-4-фенилпири-диниумион-индуцированныхапоптози окислительный стресс[ J]. Play nta Med, 2002;68(11):966-970.

Из: Журнал Четвертого военно-медицинского университета (J Fourth Mil Med Univ) 2004; 25(10)

Номер статьи (ID) 1000-2790 (2004) 10-0955-03