Фенилэтаноидные гликозиды Cistanche Tubulosa индуцируют апоптоз в клетках Eca-109 посредством митохондриально-зависимого пути
Mar 06, 2022
Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com
ЧАНШУАН ФУ, ЦЗИНЮ ЛИ, АДИЛА АЙПИРЕ, ЛИДЖЕ СЯ, ЙИ ЯН, ЦЮЯН ЧЕН, ДЖЕ ЛВ, СИНХУЙ ВАН и ЦЗИНЬЯО ЛИ
Абстрактный
Цистанхе трубчатаявыполняет различные биологические функции. В настоящем исследовании изучалось противоопухолевое действие водорастворимых фенилэтаноидных гликозидов C. Tubulosa (CTPG-W) на рак пищевода. Клетки Eca-109 обрабатывали CTPG-W и жизнеспособность клеток измеряли с помощью МТТ-анализа. Апоптоз, клеточный цикл, потенциал митохондриальной мембраны (Δψm) и активные формы кислорода анализировали с помощью проточной цитометрии. Уровни белков в путях апоптоза определяли с помощью вестерн-блоттинга. Было установлено, что CTPG-W значительно снижает жизнеспособность клеток Eca-109 за счет индукции апоптоза и остановки клеточного цикла. После лечения CTPG-W Δψm Eca-109 заметно снизился, что связано с повышенными уровнями B-клеточной лимфомы-2 (Bcl-2)-ассоциированного X и пониженными уровнями Bcl-2. Следовательно, уровни цитохрома с и c-Jun NH2-терминальной киназы были повышены, что повышало уровни расщепленной поли (АДФ-рибозы) полимеразы и расщепленной каспазы-3, {{18} } и -9, но не каспазу-8. Соответственно, уровни активных форм кислорода в клетках Eca-109 демонстрировали заметные изменения. Эти результаты показали, что CTPG-W индуцирует апоптоз клеток Eca-109 через митохондриально-зависимый путь.
Введение
Рак пищевода является одним из наиболее распространенных видов рака с 11-м по величине уровнем заболеваемости и 6-м по смертности в мире и стал причиной примерно 439 000 смертей в 2015 году (1). Заболеваемость раком пищевода заметно различается в разных регионах: в Восточной Азии, а также в восточной и южной частях Африки отмечены самые высокие показатели заболеваемости, а в Западной Африке — самые низкие показатели в 2012 г. (1,2). В Китае оценочные случаи рака пищевода и смертность составили 477000 и 375000 соответственно в 2015 г. (3). Хотя уровень заболеваемости раком пищевода снизился в странах со средним и высоким средним социально-демографическим индексом в период с 2005 по 2015 год, уровень смертности остается высоким из-за плохого прогноза (1,4). Комбинация хирургической резекции с химиотерапией или лучевой терапией использовалась для лечения рака пищевода, однако сообщалось, что в период с 2003 по 2014 год 5-летняя выживаемость оставалась неизменной.<20% in="" china,="" the="" usa,="" and="" europe="" (4,5).="" for="" these="" reasons,="" it="" is="" urgent="" to="" develop="" novel="" therapeutic="" agents="" to="" treat="" esophageal="">
Традиционная китайская фитотерапия (CHM) использовалась для лечения различных типов рака, включая немелкоклеточный рак легкого (6), колоректальный рак (7), гепатоцеллюлярную карциному (8). В недавних клинических испытаниях сообщалось, что комбинация ХМ с химиотерапией или лучевой терапией не только продемонстрировала ряд преимуществ в отношении качества жизни и облегчения побочных эффектов, вызванных химиотерапией или лучевой терапией (9,10), но также улучшила выживаемость пациентов. с немелкоклеточным раком легкого, печени, желудка, толстой кишки, носоглотки или шейки матки (9). Однако существуют противоречивые данные об эффективности лечения CHM при раке пищевода (10,11). Многочисленные исследования показали, что ряд растительных лекарственных средств или их компонентов могут ингибировать рост раковых клеток пищевода in vitro и in vivo, в том числе Andrographis paniculata (12, 13), Daikenchuto (14), икариин (15), Rosa Roxburghii Tratt и Fagopyrum. Cymosum (16), Jaridonin (17), Marsdenia tenacissima (18), OP16 (новый дитерпеноид энт-каурена) (19), Qigesan (20) и отвар Тонглиана (21). Цистанхе является типом CHM и выполняет различные биологические функции, включая антиоксидантную, противовоспалительную и нейропротективную (22,23). Наше предыдущее исследование показало, чтоЦистанхе тубулоза фенилэтаноидные гликозиды(CTPG) может подавлять рост клеток меланомы B16-F10 in vitro и in vivo (24). Однако плохая растворимость в воде CTPG, использовавшегося ранее, ограничивает разработку препарата (24). Поэтому использовали водорастворимый CTPG (CTPG-W) и исследовали противоопухолевый эффект на раковые клетки пищевода (Eca-109). Было установлено, что CTPG-W может в зависимости от дозы ингибировать жизнеспособность клеток Eca-109 посредством индукции апоптоза по митохондриально-зависимому пути.
Материалы и методы Животные.
Самки мышей C57BL/6 (6-8 недель, ~25 г) были приобретены в Пекинском центре исследований лабораторных животных (Пекин, Китай) и помещены в камеру с регулируемой температурой (25°C) и световым циклом (12/ 12) Животноводческий комплекс Синьцзянского университета (Урумчи, Китай). Все животные получали свободную от патогенов воду и корм.
Клеточная линия и культура. Клеточная линия карциномы пищевода человека (Eca-109) была сохранена в Синьцзянской ключевой лаборатории биологических ресурсов и генной инженерии (Колледж естественных наук и технологий, Синьцзянский университет, Урумчи, Китай) и культивирована в RPMI{{1} } среда (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Уолтем, Массачусетс, США) с добавлением 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Цзянсу, Китай), 1% L -глутамин (100 мМ), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). CTPG-W (номер по каталогу SGJG20170410) был приобретен у Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Основные соединения CTPG были квалифицированы и количественно определены с помощью ВЭЖХ в соответствии с нашим предыдущим исследованием (24). Вкратце, ВЭЖХ проводили на колонке ZORBAX SB-C18 (250x4,6 мм; 5 мкм) при 30°C и элюировали 0,2-процентным раствором муравьиной кислоты и градиентом метанола, начиная с 23-процентного, при добавлении 1 мл каждую минуту. в течение 45 мин до достижения 31%. Всего было введено 10 мкл образца, который был обнаружен при длине волны 330 нм. Стандарт эхинакозида был приобретен у Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Шанхай, Китай), а стандарт актеозида был приобретен у Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Дармштадт, Германия). Стандарты использовались для анализа компонентов CTPG-W.
анализ МТТ. Пролиферацию клеток измеряли с помощью анализа МТТ. Клетки Eca{{0}} инокулировали в 96-луночные планшеты с плотностью 5x103 клеток в 100 мкл RPMI{{5 }} среду/лунку и культивировали при 37°C в течение 24 ч, затем обрабатывали различными концентрациями (0, 200, 400, 600 и 800 мкг/мл) CTPG-W или 0,4% диметилсульфоксида (ДМСО) в течение 24, 48 и 72 ч. ДМСО использовали в качестве контроля растворителя (800 мкг/мл CTPG-W, содержащего 0,4% ДМСО). Цисплатин (20 мкг/мл) использовали в качестве положительного контроля. Затем супернатант отбрасывали после центрифугирования при 225 x g в течение 5 мин при комнатной температуре, в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора МТТ (0,5 мг/мл в среде RPMI-1640 без FBS) и инкубировали при 37°C. на 3 ч. Образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в 200 мкл ДМСО. Значения оптической плотности (ОП) измеряли при длине волны 490 нм с помощью 96-луночного считывателя микропланшетов (Bio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США). Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали по формуле: Жизнеспособность клеток (в процентах) =(ОП обработанных/ОП необработанных) x 100 процентов. Морфологию клеток Eca-109 наблюдали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (увеличение x200) (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, Токио, Япония).
Для пролиферации спленоцитов мышей C57BL/6 подвергали эвтаназии путем смещения шейных позвонков и выделяли селезенки. Готовили одноклеточную суспензию и спленоциты высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 1x105 клеток/лунку в 100 мкл среды RPMI-1640, а затем обрабатывали различными концентрациями. (0, 200, 400, 600 и 800 мкг/мл) CTPG-W в течение 24, 48 и 72 часов при 37°C с 5% CO2. Пролиферацию спленоцитов измеряли с помощью анализа МТТ в соответствии с вышеупомянутым протоколом. Стимулирующий индекс=Передозировка после лечения/Передозировка без лечения.
Измерение апоптоза и клеточного цикла. Клетки Eca{{0}} культивировали в чашках диаметром 60 мм при плотности 2,5x105 клеток/чашку в течение 24 ч и обрабатывали различными концентрациями ({{31} }, 200, 400, 600 и 800 мкг/мл) CTPG-W или 0,4% ДМСО в течение 24 часов при 37°C с 5% CO2. Клетки собирали и окрашивали с помощью набора для обнаружения апоптоза аннексин V-флуоресцеинизотиоцианат (FITC)/йодид пропидия (PI) (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Шанхай, Китай) в соответствии с протоколами производителя. Образцы собирали с помощью проточной цитометрии (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) и анализировали с помощью FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA). Для анализа влияния CTPG-W на клеточный цикл 2,5x105 клеток Eca-109 высевали в чашки для культивирования диаметром 60 мм и обрабатывали CTPG-W (0, 100, 200 и 400 мкг/мл) или 0,4 % ДМСО в течение 24 ч при 37°C с 5 % CO2. Все клетки собирали и дважды промывали ледяным PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), затем фиксировали в 70-процентном ледяном этаноле при 4°C в течение 30 мин. После двукратной промывки ледяным PBS клетки ресуспендировали в 300 мкл буфера для окрашивания PI/RNase (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США) в течение 10 мин при комнатной температуре. Распределение клеточного цикла анализировали с помощью программного обеспечения ModFit LT 3.0 методом проточной цитометрии (BD FACSCalibur).
Анализ митохондриального мембранного потенциала (Δψm) и активных форм кислорода (АФК). Для анализа Δψm клетки Eca{{0}} обрабатывали CTPG-W (0, 400, 600 и 800 мкг/мл) или 0,4% ДМСО в течение 24 часов. ч при 37°C с 5% CO2 и окрашивание с помощью набора для анализа потенциала митохондриальных мембран с помощью JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Шанхай, Китай), в соответствии с протоколом производителя, в течение 20 мин при 37°C . После двукратной промывки промывочным буфером JC-1 (Институт биотехнологии Beyotime) образцы ресуспендировали в 300 мкл промывочного буфера JC-1 и анализировали с помощью проточной цитометрии (BD FACSCalibur). Флуоресценцию красителя JC-1 в клетках Eca-109 также наблюдали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (увеличение х200, Nikon Eclipse Ti-E). Для анализа АФК клетки Eca-109 обрабатывали CTPG-W (0, 400, 600 и 800 мкг/мл) в течение 2, 4, 6, 12 и 24 ч и окрашивали активными формами кислорода. Набор для анализа (Beyotime Institute of Biotechnology), согласно протоколу производителя, в течение 20 мин при 37°С. После трехкратного промывания ледяным PBS образцы собирали с помощью проточной цитометрии (BD FACSCalibur) и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo 7.6.
2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH) активность по удалению радикалов. Активность CTPG-W по удалению свободных радикалов определяли с помощью анализа свободных радикалов DPPH в соответствии с опубликованным протоколом с небольшой модификацией, поскольку для растворения DPPH метанол заменяли этанолом (25, 26). Для стационарных измерений 150 мкл DPPH (100 ммоль/л) в этаноле смешивали с различными концентрациями CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 и 600 мкг/мл) в 50 мкл PBS и инкубируют в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре. Поглощение при 517 нм определяли в присутствии и в отсутствие CTPG-W. Всего в качестве положительного контроля использовали 50 мкл витамина С. Активность по удалению радикалов DPPH рассчитывали по формуле: Удаление (в процентах)=[1-(образец-пробел)/A0] x100, где Абхолоть - поглощение контроля (без DPPH), Образец представляет собой оптическую плотность образца, а A0 представляет собой оптическую плотность PBS с DPPH.
Вестерн-блот анализ. Клетки Eca{{0}} обрабатывали CTPG-W (0, 200, 600 мкг/мл) или 0,4% ДМСО в течение 24 ч при 37°C с 5% CO2. После двукратной промывки PBS клетки лизировали в буфере для лизиса для радиоиммунопреципитации (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Пекин, Китай) в течение 20 мин на льду. После центрифугирования при 10 000 xg в течение 10 мин при 4°C супернатанты собирали и определяли концентрацию белка с помощью набора с бицинхониновой кислотой (Thermo Fisher Scientific, Inc.) в соответствии с протоколами производителя. Вестерн-блоттинг был проведен в соответствии с нашим предыдущим описанием (24). Антитела против каспазы-7 (кат. № D120077), каспазы-8 (кат. № D155240), каспазы-9 (кат. № D220078), В-клеточной лимфомы{ {24}} (Bcl-2)-ассоциированный X (Bax) (каталожный номер D220073) и Bcl-2 (кат. номер D260117), а также антимышиный IgG-пероксидаза хрена (HRP ) (кат. № D111050) и IgG-HRP против кролика (кат. № D110058) были приобретены у BBI Life Sciences (Шанхай, Китай). Антитела против каспазы-3 (каталожный номер E-AB-10050) и активной каспазы-3 (кат. номер E-AB-22115) были приобретены у Elabscience ( Ухань, Китай). Другие антитела против каспазы-7 (кат. № 9492), поли(АДФ-рибозо)полимеразы (ПАРП) (кат. № 9542), цитохрома с (кат. № AC909), c-Jun NH{ {48}}терминальная киназа (JNK) (кат. № 9252S) и -актин (кат. № 58169) были получены от Cell Signaling Technology, Inc. (Данверс, Массачусетс, США). Все первичные и вторичные антитела разводили в соотношении 1:1000. Первичные антитела инкубировали при 4°С в течение ночи, а вторичные антитела инкубировали при 37°С в течение 1 часа.
Белки-мишени выявляли с помощью набора для анализа с улучшенной хемилюминесценцией (Beyotime Institute of Biotechnology) в соответствии с протоколом производителя.
Статистический анализ. Статистическую значимость рассчитывали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным тестом Тьюки, а результаты анализировали с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, Ла-Хойя, Калифорния, США) среди экспериментальной и контрольной групп. Все данные были представлены как среднее ± стандартное отклонение. п<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Цистанхе тубулоза фенилэтаноидные гликозиды(КТПГ)
Полученные результаты
CTPG-W подавляет рост клеток Eca-109. Компоненты CTPG-W были квалифицированы и количественно определены с помощью ВЭЖХ (рис. 1), которые были сопоставлены со стандартами эхинакозида и актеозида. Согласно временам удерживания пиков и площадям пиков, CTPG-W содержал 39,16% эхинакозида и 2,44% актеозида. Во-первых, влияние CTPG-W на жизнеспособность клеток Eca-109 определяли с помощью анализа МТТ. CTPG-W растворяли в ДМСО в концентрации 200 мг/мл и разбавляли средой RPMI-1640, содержащей 10% термоинактивированной FBS, до указанных концентраций. Клетки Eca-109 обрабатывали CTPG-W и анализировали жизнеспособность клеток с помощью анализа МТТ в указанные моменты времени. Обработка CTPG-W значительно снижала жизнеспособность клеток Eca-109 в зависимости от дозы и времени (P<0.001; fig.="" 2a).="" the="" morphology="" of="" eca-109="" cells="" was="" observed="" with="" an="" inverted="" fluorescence="" microscope="" (magnification,="" x200)="" following="" ctpg‑w="" treatment="" for="" 24="" h,="" which="" changed="" notably="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" with="" the="" cells="" shrinking="" and="" becoming="" round="" following="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 2b).="" these="" results="" indicate="" that="" ctpg-w="" suppresses="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells.="" the="" effect="" of="" ctpg-w="" on="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" was="" also="" detected="" with="" an="" mtt="" assay.="" ctpg-w="" significantly="" promoted="" the="" proliferation="" of="" splenocytes="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="" 2c),="" indicating="" that="" it="" has="" no="" cytotoxic="" effect="" on="">
CTPG-W индуцирует апоптоз в клетках Eca-109. Чтобы выяснить, подавляет ли CTPG-W рост клеток Eca-109 посредством индукции апоптоза или некроза, клетки обрабатывали различными концентрациями CTPG-W. Через 24 часа апоптоз и некроз клеток Eca-109 обнаруживали с помощью окрашивания аннексином V/PI. Как показано на фиг. 3А, клетки с аннексином V-/PI плюс были отобраны как некротические клетки, а клетки с аннексином V плюс/PI плюс и клетки с аннексином V плюс/PI- были отобраны как апоптотические клетки. CTPG-W в первую очередь индуцировал апоптоз клеток Eca-109 дозозависимым образом, хотя количество некротических клеток Eca-109 также значительно увеличивалось при обработке 600 и 800 мкг/мл CTPG-W (P<0.001 at="" 600="" µg/ml="" and=""><0.05 at="" 800="" µg/ml).="" consistently,="" the="" levels="" of="" pro-apoptotic="" bax="" and="" anti-apoptotic="" bcl-2="" in="" eca-109="" cells="" were="" upregulated="" and="" downregulated,="" respectively,="" upon="" ctpg-w="" treatment="" (fig.="" 3b).="" the="" results="" indicated="" that="" ctpg-w="" primarily="" inhibited="" the="" growth="" of="" eca-109="" cells="" through="" the="" induction="" of="">
CTPG-W индуцирует остановку клеточного цикла в фазе S в клетках Eca-109. Нарушение цикла раковых клеток будет подавлять рост клеток и способствовать апоптозу (27). Распределение клеточного цикла в клетках Eca-109 определяли с помощью окрашивания PI после обработки CTPG-W в течение 24 часов. Было замечено, что количество клеток в фазе S увеличилось, а количество клеток в фазах G0/G1 показало общее значительное снижение при лечении CTPG-W (P<0.05; fig.="" 4),="" indicating="" that="" ctpg-w="" arrests="" the="" eca-109="" cell="" cycle="" at="" the="" s="">
CTPG-W снижает Δψm и индуцирует высвобождение цитохрома с. Апоптоз может быть индуцирован митохондриально-зависимым путем (28,29). Про- и антиапоптотические члены семейства белков BCL-2 играют важную роль в регуляции целостности митохондриальной мембраны (30,31). После обработки CTPG-W в течение 24 часов Δψm оценивали с использованием окрашивания JC-1. Агрегат JC-1 (красная флуоресценция, обнаруженная в FL-2) будет распадаться на мономер (зеленая флуоресценция, обнаруженная в FL-1), когда Δψm снижается (32). Как показано на рис. 5А, частоты клеток FL-1 плюс клетки FL-2-/plus значительно увеличились в зависимости от дозы, что указывает на снижение Δψm клеток Eca-109. Изменения флуоресценции в клетках Eca-109 также наблюдали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (рис. 5Б). С увеличением концентрации CTPG-W красная флуоресценция уменьшалась, а зеленая увеличивалась, что согласуется с данными проточной цитометрии. Также было отмечено заметное повышение уровня цитохрома с в цитозоле (рис. 5В), что является результатом снижения Δψm. Это подтверждает вывод, сделанный на основании увеличенного числа клеток FL-1 plus FL-2-/plus, о том, что Δψm уменьшилось в результате обработки CTPG-W. Сообщалось, что JNK может регулировать активацию семейства белков BCL-2, вызывая высвобождение цитохрома с (33-35). Также было установлено, что уровень JNK заметно повышался после лечения CTPG-W (фиг. 5C). Результаты показали, что CTPG-W может индуцировать апоптоз клеток Eca-109 через митохондриально-зависимый путь.
Влияние CTPG-W на внутриклеточную генерацию АФК. АФК могут снижать Δψm, вызывая апоптоз (36). Чтобы выяснить, может ли CTPG-W увеличивать выработку АФК, клетки Eca-109 обрабатывали различными концентрациями CTPG-W. Клетки собирали в указанные моменты времени и окрашивали DCFH-DA. Продукцию внутриклеточных АФК в клетках Eca-109 определяли с помощью проточной цитометрии. Как показано на рис. 6А, 800 мкг/мл CTPG-W значительно увеличивали продукцию АФК с 2-6 ч и снижали с 12-24 ч. Кроме того, 400 мкг/мл CTPG-W значительно увеличивали выработку АФК с 12-24 ч. Более того, 200 мкг/мл CTPG-W не влияли заметно на продукцию АФК. Динамические изменения продукции АФК могут быть связаны с апоптозом клеток Eca-109. Также было установлено, что CTPG-W обладает активностью по удалению свободных радикалов (рис. 6B), что может быть связано со снижением продукции АФК в клетках Eca-109, обработанных 800 мкг/мл CTPG-W через 12 часов.
CTPG-W повышает активность каспазы-3, каспазы-7, каспазы-9 и PARP. Высвобождение цитохрома с из-за снижения Δψm может активировать каспазные протеазы, вызывая апоптоз (29,30,37). После обработки CTPG-W в течение 24 часов с помощью вестерн-блоттинга была обнаружена активация каспаз -3, 7, 8, 9 и PARP. По сравнению с контролем уровни расщепленной каспазы-9, расщепленной каспазы-7, расщепленной каспазы-3 и расщепленной PARP, но не уровни расщепленной каспазы{{ 20}}, усиливались при лечении CTPG дозозависимым образом (рис. 7). Эти результаты показали, что CTPG-W снижает Δψm и способствует высвобождению цитохрома с для активации каспаз, которые индуцируют апоптоз клеток Eca-109.
Экстракт цистанхе трубчатой
Обсуждение
Традиционный CHM может индуцировать апоптоз раковых клеток пищевода различными путями, включая внешний рецептор смерти, внутренние пути стресса митохондрий и эндоплазматического ретикулума (29). Наше предыдущее исследование показало, что CTPG, как основной компонент C. Tubulosa, ингибирует рост клеток меланомы B16-F10 посредством индукции апоптоза митохондриально-зависимым путем (24). В настоящем исследовании изучалось противоопухолевое действие CTPG-W на клетки Eca-109, и было установлено, что CTPG-W подавляет рост клеток Eca-109, индуцирует апоптоз и остановку клеточного цикла, снижал Δψm, увеличивал выброс цитохрома с и активировал каспазы. CTPG и CTPG-W могут вызывать апоптоз и остановку клеточного цикла в раковых клетках. Однако точные механизмы различаются из-за разных компонентов CTPG (26,64% эхинакозида, 10,19% актеозида и 1,71% изоактеозида) и CTPG-W (39,16% эхинакозида и 2,44% актеозида). CTPG арестовывал клетки B16-F10 в фазах G0/G1, но CTPG-W арестовывал клетки Eca-109 в S-фазе (24). Продукция АФК дозозависимо увеличивалась под действием CTPG, но это указывало на изменение в зависимости от времени при высокой дозе CTPG-W, которая значительно увеличивалась в начале лечения CTPG-W (2-6 ч) и значительно снизился через 12 ч по сравнению с контролем. Возможная причина заключается в том, что основным компонентом CTPG-W является эхинакозид. В ряде исследований сообщалось, что эхинакозид может ингибировать выработку АФК и индуцированный АФК апоптоз, оказывая нейропротекторное и омолаживающее действие (38-40). Точно так же активность по удалению свободных радикалов наблюдалась в настоящем исследовании. Поэтому было высказано предположение, что некоторые компоненты, в том числе вербаскозид, изо-вербаскозид и салидрозид в высокой дозе CTPG-W, могут немедленно индуцировать образование АФК, вызывая апоптоз клеток Eca-109 (41, 42), а затем АФК удаляли эхинакозидом. Другая возможная причина различий в продукции АФК CTPG и CTPG-W заключается в том, что в этом и предыдущем исследованиях использовались разные клеточные линии (24). Dong et al (43) сообщили, что эхинакозид может индуцировать апоптоз клеток колоректального рака SW480 человека за счет образования окислительных повреждений ДНК без повышения уровня АФК.
Обработка CTPG-W снижала Δψm и вызывала высвобождение цитохрома с, который способствует расщеплению каспазы -9 (28). Соответственно, уровни расщепленной каспазы -9 повышались при лечении CTPG-W. Впоследствии активная каспаза-9 может активировать каспазу-3, чтобы вызвать апоптоз (44). Уровни расщепленной каспазы -3 также повышались при лечении CTPG-W. Однако каспаза -8 не активировалась CTPG-W, что указывает на то, что внешний путь рецептора смерти не участвовал в апоптозе, индуцированном CTPG-W. Эти наблюдения показывают, что CTPG-W индуцирует апоптоз клеток Eca-109 посредством активации митохондриально-зависимого пути.
PARP играет важную роль в стабильности генома и может расщепляться активными каспазами, особенно каспазами -3 и -7 (45). Было установлено, что обработка CTPG-W активировала каспазы -3 и -7, которые могут расщеплять PARP, ингибируя репарацию ДНК и вызывая апоптоз.
CTPG-W также в зависимости от дозы и времени подавляет рост клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека BEL-7404 (неопубликованные данные). Хотя CTPG-W ингибирует рост клеток Eca-109 и BEL-7404, он способствует пролиферации спленоцитов, что может быть связано с содержанием полисахаридов (~50 процентов) в CTPG-W (46). ). Точно так же в ряде исследований сообщается, что полисахариды могут способствовать пролиферации спленоцитов (46-49). В модели на мышах было установлено, что CTPG-W значительно увеличивал индекс селезенки по сравнению с контрольной группой, но не влиял на массу тела и другие индексы органов, включая сердце, печень, почки и легкие (неопубликованные данные). что указывает на то, что CTPG-W не оказывает цитотоксического действия на нормальные клетки.
В совокупности данные показали, что CTPG-W ингибирует рост клеток Eca-109 путем индукции апоптоза через митохондриально-зависимый путь.
Преимущества цистанхе: антиапоптоз
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Цзяньхуа Янга (Медицинский колледж Бейлора) за шлифовку рукописи.
Финансирование
Это исследование было поддержано 13-м Пятилетним планом для проекта тендера по ключевой дисциплине биологии (грант № 17SDKD0202), Синьцзянским педагогическим университетом и Ключевой лабораторией особого применения и регулирования биоразнообразия окружающей среды в Синьцзяне (грант № XJTSWZ-2017-04) для JL и грант Китайского национального фонда естественных наук (грант № 31760260) для XW.
Наличие данных и материалов
Данные и материалы, использованные и проанализированные в ходе настоящего исследования, можно получить у соответствующего автора по обоснованному запросу.
Вклад авторов
CF, AA, YY и QC провели эксперименты. LX, JLv и XW проанализировали данные и подготовленные рисунки. JinyuL и JinyaoL разработали проект и написали рукопись.
Этическое одобрение и согласие на участие
Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Синьцзянской ключевой лаборатории биологических ресурсов и генной инженерии (одобрение № BRGE-AE001; Синьцзянский университет).
Согласие пациента на публикацию
Непригодный.
Конкурирующие интересы
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
использованная литература
Wu CR, Lin HC и Su MH: обращение водным растворомэкстракты цистанхе трубчатойот поведенческих дефицитов в модели крысы, похожей на болезнь Альцгеймера: актуальность для отложения амилоида и функции центрального нейротрансмиттера. Дополнение BMC Altern Med 14: 202, 2014.
Li J, Aspire A, Gao L, Huo S, Luo J и Zhang F:Фенилэтаноидные гликозиды из Cistanche tubulosaингибирует рост клеток B16-F10 как in vitro, так и in vivo путем индукции апоптоза через митохондриально-зависимый путь. J Рак 7: 1877-1887, 2016.
Brand-Williams W, Culver ME и Berset C: Использование метода свободных радикалов для оценки антиоксидантной активности. LWT-Food Sci Technol 28: 25-30, 1995.
