Тубулозид B из Cistanche Salsa спасает нейронные клетки PC12 от 1-метил-4-фенилпиридиния, индуцированного ионами апоптоза и окислительного стресса

Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

Гоцин Чжэн, Сяопин Пу, Ли Лэй, Пэнфэй Ту, Чанлин Ли

Абстрактный:

Нейропротекторныйэффекты тубулозида В из цистанхе, один из фенилэтаноидов, выделенных из китайскогофитотерапия Цистанхе сальса, на 1-метил-4-ион фенилпиридиния (MPP plus )-индуцированный апоптоз и окислительный стресс в нервных клетках PC12 были исследованы. Клетки PC12, обработанные MPP +, подверглись апоптотической гибели, что было определено с помощью анализа MTF, проточной цитометрии и электрофореза ДНК в агарозном геле; внутриклеточное накопление активных форм кислорода (АФК) измеряли окрашиванием DCFH-DA с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (LSCM). Одновременная обработка тухулозидом В заметно ослабляла MPP+-индуцированную цитотоксичность, фрагментацию ДНК и внутриклеточное накопление АФК. Эти результаты убедительно указывают на то, что тубулозид B предотвращает индуцированный MPP апоптоз и окислительный стресс. Тубулозид В может применяться в качествеболезнь Паркинсонаагенты.

Введение

Патологически спорадическая болезнь Паркинсона (БП) обычно характеризуется потерей катехоламинергических нейронов, особенно дофаминергических нейронов компактной части черной субстанции (SNc), и наличием характерных интранейронов|включения, называемые тельцами Леви, в пораженных участках мозга. Несмотря на множество факторов, вовлеченных в патогенез БП, механизмы, участвующие в инициации и прогрессировании БП, остаются неясными. к гибели нейронов или апоптозу за счет чрезмерного образования свободных радикалов [1], [2], [3]. Тот факт, что нигральная дофаминергическая система может продуцировать высокие уровни свободных радикалов и имеет относительно низкий уровень системы антиоксидантной защиты, также подтверждает эту гипотезу. Как in vivo, так и in vitro исследования показали опосредованную окислительным стрессом нейротоксичность MPP＋, активного метаболита 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (MPTP) на дофаминергические нейроны [4]. ], [5]. Участие свободных радикалов, чрезмерно продуцируемых окислительным стрессом, в качестве непосредственной причины нейродегенеративных расстройств, таких как БП, предполагает ключевую роль антиоксидантов. Тубулозид Б (рис. 1) был одним из фенилэтаноидных соединений, выделенных из стеблейЦистанче сальса. Предыдущие исследования показали, что многие фенилэтаноиды, включая тубулозид B, проявляют сильную активность по удалению свободных радикалов [6], [7].

Принимая во внимание эти результаты, мы исследовали в настоящем исследовании влияние тубу]нзида B на нейротоксичность, индуцированную MPP plus, in vitro, используя клеточную линию феохромоцитомы симпатического нерва PC12, которая успешно использовалась на протяжении многих лет для изучения функции нейронов [8]. [9].

против болезни Паркинсона:цистанхе

Материалы и методы

Материалы

Тубулозид В изЦистанче сальсабыл любезно предоставлен доктором Ли Лей (отделение натуральных продуктов, школа фармацевтических наук, Пекинский университет, Пекин, Китай). Чистота соединения составила более 98% по анализу ВЭЖХ. Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), сыворотка лошади и сыворотка эмбриона теленка были приобретены у GIBCO BRL, ион 1-метил~-фенилпиридиния (MPP плюс), поли-L-лизин, 3-(4, 5 -диметилтиазол-2 -ил)-2,5- бромид дифенилтетразолия (MTT), йодид пропидия (PI), РНКаза A, протеиназа K и диацетат 2;7'-дихлорфлуоресцеина (DCFH-DA) были приобретены у Sigma.

Культура клеток

Клетки PCI2 поддерживали в среде DMEM с добавлением 10% лошадиной сыворотки, 5% фетальной телячьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки культивировали во влажном инкубаторе, аэрируемом 95% воздуха и 5% СО2 при 37°С. Все эксперименты проводили через 24-48 ч после посева клеток. Клетки обычно собирали путем трипсинизации 0,25%, когда клетки приближались к стадии субконфлюэнтности, и высевали в культуральные колбы на 25 см, разделенные в пропорции 1:8.

Анализ жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток определяли с использованием модифицированного анализа МТТ, как описано ранее [10]. Вкратце, клетки PC12 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 1 × 104 клеток на лунку. Культуры выращивали в течение 48 ч, затем среду меняли на среду, содержащую различные концентрации тубульнсида В или МФП＋. После инкубации в течение 48 часов и 72 часов раствор MTr (5 мг/мл в DMEM) добавляли в 96-луночные планшеты и клетки инкубировали в течение 4 часов при 37°С. После удаления среды кристаллы клеток и красителя солюбилизировали путем добавления 200 мкл ДМСО и измеряли поглощение при 570 нм (540 нм в качестве эталона) с помощью устройства для считывания микропланшетов модели 550 (Bio-Rad). Жизнеспособность клеток также анализировали с использованием метода исключения трипанового синего. Клетки собирали, осторожно осаждали и окрашивали 0,6%-ным раствором трипанового синего в течение 3 часов. Затем в десяти случайно выбранных полях микроскопа оценивали процент неокрашенных клеток. В качестве положительного препарата использовали 100 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF).

Обнаружение апоптоза методом проточной цитометрии

Апоптозные клетки выявляли с помощью проточной цитометрии с использованием иодида пропидия (PI) [11]. Вкратце, примерно 1 × 106 клеток, инкубированных с тестируемыми веществами, собирали центрифугированием и один раз промывали PBS. Клетки фиксировали 70%-ным этанолом в течение 24 ч при - 20 градусах и однократно промывали PBS. Затем клетки ресуспендировали в 300 мкл PBS, содержащего 0,5 мг/мл РНКазы и 0,5 мг/мл PI. После дополнительной инкубации в течение 30 минут в темноте была проведена проточная цитометрия с помощью FACScan (Becton Dickinson, Гейдельберг, Германия).

Мы применили протокол Мура [12], который выделял только фрагментированную ДНК, и эксперименты были нормализованы с использованием равного количества культур из каждой испытуемой группы. Вкратце, 3 × 106 нейронов из каждого из обработанных образцов промывали в сбалансированном солевом растворе Хенкса (1{14}}г в течение 10 мин), а осадки, образовавшиеся на дне пробирки, гомогенизировали. с 1 мл буфера для лизиса (10 мМ Трис при рН 7,4, 5 мМ ЭДТА, 1 процент Тритона X-100) в течение 20 мин на льду. После центрифугирования при 11,000 g в течение 20 мин при 4 градусах супернатанты, содержащие фрагментированную ДНК, удаляли и расщепляли 20 мг/мл РНКазы А при 37 градусах в течение 1 ч и 0,1 мг/мл протеиназы К при 56 градусах. еще на 1 ч. Фрагментированную ДНК экстрагировали фенолом и хлороформом и центрифугировали при 10,{33}}g в течение 1 мин при 4°C. Водную фазу переносили в новую пробирку Эппендорфа, смешивали с 2 объемами ледяного этанола, а затем помещают при -20 градусах не менее чем на 1 ч для осаждения ДНК. После центрифугирования при 15,{38}}g в течение 20 мин при 4° супернатанты удаляли, а осадки ДНК однократно промывали 80-процентным этанолом (15000 g в течение 15 мин при 4°), сушили на воздухе и растворяли в 20 мкл ТЕ. буфер с рН 7,6. Весь образец подвергали электрофорезу на 1,5% агарозном геле в течение 1 часа при 85 В. Гель исследовали и фотографировали с помощью системы документирования гелей ультрафиолетовых продуктов (GELDOC-2000, Bio-Rad, США).

Измерение внутриклеточного образования АФК

Образование внутриклеточных перекисей выявляли с помощью конфокального сканирующего лазерного микроскопа с использованием нефлуоресцентного соединения 2"7"-дихлорфлуоресцеиндиацетата (DCFH-DA) [13], который этерифицируется в клетках эндогенными эстеразами до ионизированной свободной кислоты, 2 ;7"-дихлорфлуоресцеин. 2",7-Дихлорофлуоресцин способен окисляться до флуоресцентного 2"7"-дихлорфлуоресцеина (DCF) гидроантиоксидантами. Клетки инкубировали с 10 мкМ DCFH-DA в течение 30 мин при 37°С. Культуры дважды промывали сбалансированным солевым раствором Хенкса и визуализировали в той же среде. Изображение было получено с использованием конфокального сканирующего лазерного микроскопа, DCF возбуждалась при 488 нм, а эмиссионный фильтр представлял собой барьерный фильтр 510 нм. Для обеспечения достоверности сравнения одни и те же параметры сбора данных использовались для всех наблюдений. Устанавливали оптимальное вертикальное положение в середине клеток, после чего быстро сканировали поле. Поскольку освещение с длиной волны возбуждения 488 нм вызывало усиление флуоресценции из-за окисления этого красителя, каждое поле подвергалось воздействию Света в течение одинакового времени. Исходные значения для нестимулированных клеток использовали в качестве контрольных значений для сравнения с обработанными MPP клетками в присутствии или в отсутствие тубулозида B. После сканирования среднюю относительную интенсивность флуоресценции в 15-20 телах нейронов на поле микроскопа количественно определяли в четырех отдельные культуры для каждого условия лечения.

цистанхе

статистический анализ

Все полученные значения выражали как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистическую значимость различий между группами определяли по критерию Стьюдента; Вычисленные значения р менее 0,05 считались статистически значимыми.

Полученные результаты

Как показано на рис. 2, MPP plus вызывает дозозависимое снижение жизнеспособности клеток PCI2. В отличие от этого, EGF, хорошо известный нейротрофический фактор, вызывал значительную защиту жизнеспособности клеток при 100 нг/мл MPP + индуцированные цитотоксические эффекты также ослаблялись в присутствии тубулозида B (5, 10, 50 или 100 мкг-мл -1 ), хотя и с меньшей активностью, чем эталонный препарат (рис. 3). Тубулозид В в этих концентрациях проявлял цитопротекторный эффект дозозависимым образом, и само по себе соединение не вызывало какой-либо очевидной цитотоксичности (данные не представлены). Гель-электрофорез экстракта ДНК из клеток PCI 2, обработанных 200 мкМ MPP plus в течение 48 часов, показал ступенчатую структуру ДНК. классический признак апоптоза, тубулозид В, в дозах 10 и 100 мкг·мл -1вызывает формирование лестницы ДНК (рис. 4). На рис. 5 показаны типичные гистограммы проточного цитометрического анализа апоптотической гибели клеток, индуцированной MPP＋ в клетках PC12. в присутствии или в отсутствие тубулозида B. Количественная оценка профиля клеточного цикла с помощью PI выявила количество клеток с субдиплоидными характеристиками (область M1), свидетельствующими об апоптотической фрагментации ДНК. В необработанных клетках апоптотическая субдиплоидная фракция была минимальной до 5．94% от общего числа 10000 клеток (рис. 5А). После 48-часового воздействия MPP＋ процент апоптоза увеличился до 43．02;j; (рис. 5 B)． При добавлении в клеточную культуру тубулозид B ингибировал MPP+индуцировал апоптоз дозозависимым образом. При концентрации 10 мкг·мл-1защита тубулозида В не была статистически значимой, но при 50 и 1 00мкг·мл-1 наблюдалось снижение на 45% и 63% соответственно, наблюдалось увеличение процента выживших клеток (рис. 5D, E).

Накопление внутриклеточных АФК может быть обнаружено с помощью DCFH-DA. Клетки PC12, обработанные 200 мкМ MPP, в течение 48 ч демонстрировали интенсивную флуоресценцию внутри клетки после окрашивания красителем DCFH-DA (рис. 6). Одновременное лечение тубулозидом В (в дозах 10 и 100 мкг·мл) ингибировало MPP＋一 индуцировало продукцию АФК (процент снижения составил 24．52% и 55．63％ соответственно)．

Обсуждение

Патогенез БП включает сильный окислительный стресс, снижение уровня антиоксидантов и митохондриальные дефекты. известно, что они вызывают апоптоз в нескольких клеточных системах. В частности, было показано, что свободные радикалы вызывают активную гибель клеток в нейронах [14]. MPTP вызывает необратимый и тяжелый паркинсоноподобный синдром, который вызывает избирательную дегенерацию нигростриарных дофаминергических нейронов у людей. Этот нейротоксин был использован для создания животных моделей БП [15]．MPTP преобразуется моноаминоксидазой B в MPP＋, который накапливается в митохондриях. где он ингибирует митохондриальный комплекс I и эти митохондриальные дни. Функция вызывает апоптоз [16]. Таким образом, нейротоксичность, индуцированная MPP плюс β в дофаминергических нейронах, широко использовалась в качестве этиологической модели БП для скрининга нейропротекторных агентов.

В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что MPP plus-индуцированная гибель клеток из-за окислительного стресса в клетках PC12 была уменьшена тубулозидом B. Кроме того, мы продемонстрировали, что тубулозид B также защищал дозозависимым образом от MPP plus-индуцированного лэддеринга ДНК. и апоптоз, измеренный с помощью ДНК-гель-электрофореза и проточного цитометрического анализа. Более того, одновременное лечение более высокими концентрациями тубулозида В ингибировало MPP-индуцированную продукцию АФК. Таким образом, тубулозид В проявляет многофункциональное нейропротекторное действие. В действие тубулозида В могут быть вовлечены несколько механизмов, по отдельности или в сочетании. Антиоксидантный эффект является возможным механизмом нейропротекции, опосредованной тубулозидом В. Xiong Q обнаружил, что тубулозид B проявляет сильную активность по удалению свободных радикалов в отношении 1,1-дифенил-2-пикрилгидразильного радикала, а ксантин]ксантиноксидаза образует супероксидный анион-радикал [6].

Недавно сообщалось, что несколько фенилэтаноидов обладают свойствами удаления свободных радикалов и защищают от токсических повреждений, вызванных окислительным стрессом. АФК, продуцируемые MPP plus, такие как перекись водорода, супероксидный анион и гидроксильный радикал, легко повреждают биологические молекулы, что в конечном итоге может привести к апоптотической или некротической гибели клеток. Таким образом, тубулозид B может оказывать прямое нейтрализующее действие на АФК. Хотя наши данные не устанавливают точное место, в котором тубулозид B действует для подавления накопления АФК, они предполагают, что нейропротекторный механизм включает стимуляцию путей антиоксидантов. Изучение молекулярной структуры тубулозида В также указывает на то, что он обладает мощной способностью удалять свободные радикалы (личное сообщение).

Другие механизмы также могут иметь значение. Например, тубулозид B может противодействовать токсичности MPP＋ путем ингибирования открытия переходной поры митохондриальной проницаемости и дисфункции. Кроме того, следует учитывать, оказывает ли тубулозид В прямое стимулирующее рост действие на нервные клетки. Точный механизм нейропротекторного действия тубулозида В остается неясным. Необходимы дополнительные исследования, чтобы прояснить полную картину его нейропротекторного действия.

Таким образом, тубулозид В из экстракта цистанхе сальса оказывает очевидное защитное действие на апоптоз, индуцированный MPP plus, и окислительный стресс. Его нейропротекторные эффекты против токсичности MPP + могут быть важными и предполагают, что он может иметь терапевтический потенциал в профилактике и лечении БП.

лечение БП: цистанхе

использованная литература

7. Xiong Q, Tezuka Y, Kaneko 1", Li H, Tran LQ Hase K, Namba T, Kadota S. Ингибирование оксида азота фенилэтаноидами в активированных макрофагах. Eur J Pharmaco 12000; 400:137-44

8. Грин Л.А., Тишлер А.С. Создание норадренергической клональной линии клеток феохромоцитомы надпочечников, которые реагируют на фактор роста нервов. Proc Nat Acad Sci 1976; 73:2424-8

9. Yao Z, Drieu K, Szweda LI, Papadopoulos V. Свободные радикалы и перекисное окисление липидов не опосредуют индуцированную амилоидом гибель нейронов. Мозг Рес 1999; 847: 203- 10

10. Ямамото Т., Юяма К., Накамура К., Като Т., Ямамото Х. Кинетическая характеристика токсичности оксида азота для клеток PC12: влияние периода полураспада высвобождения NO. Евр Дж Фармакол 2000; 397:25-33

11. Nicoletti l, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani E Riccardi C. Быстрый и простой метод измерения апоптоза тимоцитов с помощью окрашивания йодидом пропидия и проточной цитометрии. J Immunol Methods 1991; 139: 271-9

12. Moore KJ, Matlashewski C. Внутриклеточная инфекция Leishmania do nova ингибирует апоптоз макрофагов. Дж. Иммунол, 1994 г.; 152: 2930- 7

13. Марк Р.Дж., Келлер Дж.Н., Круман И., Мэттсон М.П. Основной FGF ослабляет индуцированный амилоидными пептидами окислительный стресс, митохондриальную дисфункцию и нарушение активности Na+K+АТФазы в нейронах гиппокампа. Исследование мозга, 1997 г.; 756: 205-14

14. Мерад-Будиа М., Николь А., Сантиард-Барон Д., Сайль С., Себаллос-Пико Л. Митохондриальные нарушения как раннее событие в процессе апоптоза, вызванного истощением глутатиона в нейрональных клетках: отношение к болезни Паркинсона. Биохим Фармако 11998; 56: 645-55

15. Langston JW, Ballard P, Tetrud JW, Irwin I. Хронический паркинсонизм у людей, вызванный продуктом синтеза аналога меперидина. Наука 1983; 219:979-80

16. Mizuno Y, Sone N, Suzuki K, Saitoh T. Исследования токсичности иона 1-меэтил-4-фенилпиридиния (MPP ＋) против митохондрий мозга мыши. J Neurol Sci 1988; 86: 97-110