Cistanche Tubulosa защищает дофаминергические нейроны посредством регуляции апоптоза и нейротрофического фактора, происходящего из глиальных клеток: in vivo и in vitro-Ⅰ

ВВЕДЕНИЕ

Болезнь Паркинсона (БП) — распространенное нейродегенеративное заболевание, встречающееся у людей пожилого возраста с патологическими проявлениями гибели дофаминергических нейронов черной субстанции (ЧС) вследствие дегенерации. Тяжесть заболевания коррелирует с потерей дофаминовых (DA) нейрональных клеток в ЧС, что согласуется с мнением о том, что нейродегенеративный процесспроцесс прогрессирует в течение многих лет, прежде чем появятся какие-либо симптомы (Соул и Майерс, 1993 г.). Прогрессирующий характер заболевания предполагает интересные возможности терапевтического вмешательства путем блокирования основного нейродегенеративного процесса. Поэтому поиск индуцированного терапией мощного и специфического действия нейротрофических факторов на выживаемость ДА-нейронов представляет значительный интерес.

НАТУРАЛЬНЫЙ ЦИСТАНХ ТУБУЛОЗНЫЙ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ДОФАМИНЕРГИЧНЫХ НЕЙРОНОВ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Нейротрофические факторы являются важными белками, включая фактор роста нервов (NGF), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) и нейротрофический фактор глиальных клеток (GDNF), которые способствуют росту нервов, неврологическому развитию, наведению аксонов и функции нейронов. Среди всех нейротрофических факторов, которые защищают и способствуют восстановлению дофаминергических нейронов, GDNF оказывает наиболее сильное воздействие (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). Было показано, что GDNF обладает мощным нейротрофическим действием на DA-нейроны in vitro (Lin et al., 1993) и оказывает нейропротекторное действие in vivo. Было показано, что GDNF спасает нигральные DA-нейроны от гибели клеток, вызванной повреждением, после хирургической или токсин-индуцированной аксотомии у крыс (Beck et al., 1995; Kearns and Gash, 1995; Sauer et al., 1995) и частично также после системное администрированиеN-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МФТП)у мышей (Tomac et al., 1995). В основе дегенерации дофаминергических нейронов лежат повышенная частота апоптоза нейронов и снижение защитного действия нейротрофических факторов, потенциально вызванных различными патологическими факторами (Holden et al., 2006).

C. Tubeulosa — это лекарственное средство растительного происхождения, полученное из нескольких растений рода Cistanche. Это основной вариант лечения синдрома почечной недостаточности, который тесно связан с андрогенными гормонами в традиционной китайской медицине (ТКМ). На сегодняшний день множество клинических и фундаментальных исследований C. Tubeulosa продемонстрировали активность нейродегенеративных заболеваний. Таким образом, выявление рецептов традиционной китайской медицины, тонизирующих почки, при лечении БП может обеспечить альтернативное клиническое лечение БП.Эхинакозид (ECH)является основным биологически активным компонентом, содержащимся в лекарственной траве C. Tubeulosa. Исследования показали терапевтический эффект гликозидов Цистанхе и ЭХГ.вербаскозид(VER) и икариин (ICA) при болезни Альцгеймера (БА), БП и других пациентах с сосудистой деменцией (Urano and Tohda, 2010; Wang et al., 2013; Wu et al., 2014). Ву и др. (2014) предположили, что экстракты C. Tubeulosa, содержащие достаточное количество ЭХГ и актеозида, улучшают когнитивную дисфункцию, вызванную А -42, путем блокирования отложения амилоида и изменения функции холинергических и дофаминергических нейронов гиппокампа. Тао и др. (2015) обнаружили, чтофенилэтаноидные гликозидыиз C. Tubeulosa (Ph Gs-Ct) предотвращал высотный отек мозга за счет снижения экспрессии белка и мРНК AQP4 в ткани головного мозга крысиных моделей.

НАТУРАЛЬНЫЕ ЗАКУСКИ С ЭКСТРАКТОМ ЦИСТАНХА TUBULOSA УЛУЧШАЮТ ПАМЯТЬ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Предыдущие исследования показали, что соединения китайских трав, в том числе три ингредиента C. Tubeulosa, epimedium и Rhizoma Polygonati, облегчают повреждение дофаминергических нейронов и повышают уровень дофамина, регулируя экспрессию нейротрофических факторов (Wu et al., 2013). Таким образом, пока неизвестно, являются ли нейропротекторные эффекты, индуцированные C. Tubeulosa, длительными и в какой степени спасение черных DA-нейронов введением GDNF может обеспечить значительное сохранение двигательного поведения, имеющего отношение к симптоматике животных с БП. В этом исследовании использовался рецепт традиционной китайской медицины, тонизирующий почки, нанопорошок C. Tubeulosa, который получил национальный патент (номер патента: 2011103028541) в Китае и ранее показал определенный терапевтический эффект при БП. Таким образом, настоящее исследование было разработано для изучения нейропротекторных и регенеративных эффектов лечения C. Tubeulosa, а также для изучения апоптоза на клетках MES23.5 и поведенческих дефинитивных крысах, а также регуляции GDNF, измеренной с помощью набора целевых тестов. .

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы, реагенты и оборудование

C. Tubeulosa была приобретена у компании Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Пекин, Китай. ECH, VER и ICA были созданы Национальными институтами контроля пищевых продуктов и лекарств Китая. Линия дофаминергических нейрональных клеток MES23.5 была подарена профессором Бяо Ченом из лаборатории нейробиологии Столичного медицинского университета, Пекин, Китай. Пятьдесят мышей-самцов C57BL/6 (весом 20–25 г каждая) были приобретены у Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (номер лицензии: SCXK2012-0002), Шанхай, Китай.

MPP+, МТТ и глютамин были приобретены у Sigma-Aldrich (Карлсбад, Калифорния, США); Среду DMEM/F12 и фетальную бычью сыворотку закупили у компании Gibco Co. (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США); и стандарт MPTP, DA и стандарт гомованилиновой кислоты (HVA) были приобретены у Sigma-Aldrich (Карлсбад, Калифорния, США). -актин, Bax, Bcl2, GDNF, рецептор альфа семейства GDNF (GFR 1) и антитела Ret были приобретены у Cell Signaling Technology, Inc. (Беверли, Массачусетс, США); Набор реагентов для окрашивания 3,3'-диаминобензидина (DAB) был приобретен у Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Фуцзянь, Китай); и набор для подготовки образцов геля SDS-PAGE, набор для обнаружения сверхчувствительной усиленной хемилюминесценции (ECL) и анализ бицинхониновой кислоты (BCA) были приобретены в Институте биотехнологии Beyotime (Пекин, Китай).

В этом исследовании использовались следующие инструменты: считыватель микропланшетов ELX800 (Bio Tek Winooski, VT, США); СО2-инкубатор (Heraeus, Ханау, Германия); Система анализа изображений геля Gel DOC 2000, ячейка для электрофореза и резервуар для электрофореза (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США); анализатор белков DU-650 (Beckman Coulter, Inc., Фуллертон, Калифорния, США); высокоскоростная центрифуга с охлаждением 5417R (Eppendorf, Гамбург, Германия); Двойная планетарная шаровая мельница SXQM (Чанша, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Хунань, Китай); Мельница-смеситель ММ400 (Retsch GmbH, Хан, Германия); Высокоэффективная жидкостная хроматография Agilent 1200 (ВЭЖХ; Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США); Электрофорез PowerPac Basic, система трансмембранного переноса PowerPac Basic, хемилюминесцентный имидж-сканер Universal Hood II, система обратной транскрипции РНК S1000 Thermal Cycler (Bio-Rad); Система анализа изображений тканей и клеток Motic Med 6.0 (Motic China Group, Co., Ltd, Сямэнь, Китай).

ПодготовкаС. трубчатаяНанопорошок

C. Tubeulosa взвешивали, затем очищали и обезвоживали. После обычного измельчения мелкий порошок C. Tubeulosa пропускали через сетчатое сито 200- и подвергали сублимационной сушке. Для приготовления нанопорошка C. Tubeulosa использовалась вакуумная и высокоэнергетическая шаровая мельница с контролируемой температурой. Сначала необработанный нанопорошок C. Tubeulosa поместили в вакуумный резервуар для шаровой мельницы, который был загружен карбидными мелющими шарами. Соотношение мелющих шаров и нанопорошка C. Tubeulosa варьировало от 15:1 до 5:1. Для получения мелкодисперсного порошка скорость и продолжительность работы высокоэнергетической шаровой мельницы устанавливали равными 300 об/мин и 20 мин соответственно. Мелкодисперсный порошок взвешивался для обработки наноразмерных материалов и обрабатывался в смесителе-мельнице с частотой 25/с и колебанием 20 с в трех повторениях. PBS использовали для растворения и приготовления исходного раствора с концентрацией 25 мг/мл, после чего следовали 30-минутную обработку ультразвуком, автоклавирование и, наконец, хранение при -20°C.

Контроль качества активных компонентовС. трубчатаяметодом ВЭЖХ

ЭХГ и VER содержали градиентное элюирование диоксидом кремния, связанным с октадецилсиланом, в качестве наполнителя, метанолом в качестве подвижной фазы А и раствором 0,1% муравьиной кислоты в качестве подвижной фазы В. Длина волны обнаружения составляла 330 нм. ICA содержал градиентное элюирование диоксидом кремния, связанным с октадецилсиланом, в качестве наполнителя и ацетонитрил-вода (30:70) в качестве подвижной фазы. Длина волны регистрации составляла 270 нм. Образец, контроль и отрицательный контроль измерялись по 10 мкл для каждого теста.

Клеточная культура и анализ МТТ для измерения жизнеспособности MPP+-Обработанные клетки

Клетки MES23.5 инокулировали 5% фетальной телячьей сывороткой, 1% глутамином, 2% 50× раствором Сато и средой DMEM/F12 с 2% пенициллином/стрептомицином. Их инкубировали при температуре 37°C в инкубаторе с 5% CO2 и насыщенной влажностью. Клетки выделяли и пассировали с 0,25% трипсином, а клеточную суспензию собирали в фазе логарифмического роста. Изолированные клетки с плотностью 1 × 105 высевали в покрытые полилизином планшеты с 96-лунками с последующим добавлением различных конечных концентраций (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 и 800 мкмоль/л). ) СМИ MPP+. Клетки MES23.5, которые инкубировали с нормальной культуральной средой в течение 24 и 48 часов, использовали в качестве отрицательного контроля в экспериментах in vitro. Клетки из разных групп лечения инкубировали с реагентом МТТ в течение 4 часов. Затем раствор в лунках сливали, добавляли 150 мкл ДМСО и перемешивали в течение 10 мин. Поглощение каждого образца при длине волны 570 нм измеряли с использованием автоматического считывателя микропланшетов. Процент жизнеспособности клеток (%)=среднее поглощение экспериментальной группы/среднее поглощение группы отрицательного контроля × 100%.

Соответствующие концентрации среды MPP+ добавляли для 24-часовой обработки клеток MES23.5 с использованием того же подхода, что и для культуры in vitro. После обработки раствор в лунке сливали. Среду, содержащую различные концентрации (10, 50, 100, 200, 250, 500 и 1000 мкг/мл) нанопорошка C. Tubeulosa, добавляли к клеткам MES23.5 в разных лунках и оставляли инкубироваться на 24 и 48 часов. Клетки MES23.5, которые инкубировали с нормальной культуральной средой в течение 24 и 48 часов, использовали в качестве отрицательного контроля. В качестве носителя использовали клетки MES23.5, инкубированные со средой MPP+. Измерения проводились в трех повторах для каждого образца. Поглощение соответствующей экспериментальной и контрольной групп измеряли для расчета жизнеспособности клеток.

НАТУРАЛЬНЫЙ ЭКСТРАКТ ЦИСТАНХА TUBULOSA ПРОТИВ УСТАЛОСТИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Экспрессия TH, измеренная иммуноцитохимическим методом

Когда нанопорошок C. Tubeulosa содержался в концентрациях 100, 200 и 250 мкг/мл, выживаемость клеток значительно увеличивалась (рис. 2G). Таким образом, в последующих экспериментах мы протестировали три концентрации: группы с низкой дозой, средней дозой и высокой дозой. Для каждой группы C. Tubeulosa были протестированы три повторности. Стерилизованные покровные стекла, покрытые полилизином, помещали в луночные планшеты с 6-лунками. Далее в каждую лунку высевали по 5×104 клеток и инкубировали в течение 24 часов. Обычную свежую среду заменяли в нормальной контрольной группе, а среду MPP+ с конечной концентрацией 100 мкмоль/л заменяли в остальных группах лечения для инкубации в течение 24 часов. Затем в обычных контрольных группах и группах носителя заменяли обычные свежие среды, а конечные концентрации нанопорошка C. Tubeulosa 100, 200 и 250 мкг/мл инкубировали с клетками в течение 24 часов в низких, средних и высоких дозах. Группы лечения C. Tubeulosa соответственно. Клетки MES23.5 в разных группах трижды промывали PBS для удаления супернатанта и дополнительно фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 15 минут. После промывки PBS клетки инкубировали с блокатором пероксидазы при 37°C в течение 30 мин, а затем снова промывали PBS. Для пермеабилизации клеток в течение 10 мин использовали 0,2% раствор Тритона Х-100 с последующей промывкой PBS. К каждому образцу добавляли нормальную козью сыворотку и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем нормальную козью сыворотку удаляли и к каждому образцу добавляли первичное антитело, разведенное 1:400 в PBS, и инкубировали при 4°C в течение ночи. Клетки в группе отрицательного контроля инкубировали с PBS при 4°C в течение ночи. После промывки PBS клетки инкубировали с меченными биотином вторичными антителами во влажной камере при 37°С в течение 20 мин. Затем каждый образец промывали PBS и метили конъюгатами пероксидазы хрена и стрептавидина (рабочий раствор C) при 37°C в течение 20 мин. После промывания PBS клетки окрашивали реагентом DAB в темноте в течение примерно 1–10 мин и наблюдали за развитием коричневой окраски под световой микроскопией. Затем каждый образец дважды промывали дистиллированной водой по 1–2 мин и докрашивали ядра раствором гематоксилина в течение 0,5–1 мин. После тщательного промывания каждого образца в воде клетки погружали в 1%-ный раствор соляной кислоты для дифференцировки и 1%-ный водный раствор аммиака с последующей тщательной промывкой клеток в воде. Затем клетки из каждого образца обезвоживали в 70% этаноле в течение 2 минут, 80% этаноле в течение 2 минут, 90% этаноле в течение 2 минут дважды, 95% этаноле дважды в течение 2 минут и 100% этаноле дважды в течение 2 минут. Затем клетки дважды погружали в раствор ксилола на 2 мин и монтировали на предметное стекло с нейтральными смолами. Под световой микроскопией каждый образец подвергался захвату изображения и случайному выбору 5–10 эффективных полей зрения для определения экспрессии выбранных белков в дофаминергических нейронах, на что указывает интенсивность коричневых частиц, и для полуколичественной оценки содержания белка по его среднему значению серого. .

Скорость апоптоза клеток MES23.5, измеренная с помощью проточной цитометрии

Прикрепившиеся клетки один раз промывали PBS. Для выделения клеток добавляли соответствующее количество раствора трипсина, не содержащего ЭДТА, при комнатной температуре и осторожно пипетировали раствор, чтобы дать возможность прикрепившимся клеткам отделиться. Затем добавляли среду для культуры клеток, чтобы остановить трипсинизацию. Смесь переносили в новую центрифужную пробирку и затем центрифугировали в течение 5 минут при 1500 об/мин для сбора изолированных клеток. После удаления супернатанта осадок клеток осторожно ресуспендировали в PBS и подсчитывали клетки. Примерно от 1 × 105 до 5 × 105 ресуспендированных клеток центрифугировали в течение 5 минут при 1500 об/мин и супернатант отбрасывали. К клеточному осадку добавляли пять микролитров раствора, связывающего аннексин V-FITC, для осторожного ресуспендирования клеток. Добавляли еще 5 мкл аннексина V-FITC и тщательно перемешивали. Пять микролитров раствора йодида пропидия использовали для окрашивания клеток путем инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут незадолго до проточной цитометрии.

Вестерн-блоттинг дляin vitro

Клетки были разделены на нормальную группу, группу лечения MPP+, группу с низкими дозами.С. трубчатаягруппа лечения, группа лечения умеренными дозами C. Tubeulosa и группа лечения высокими дозами C. Tubeulosa. Экспрессию Bcl2 и Bax измеряли в каждом из них. В общей сложности 1 × 105 клеток на лунку в 6-луночном планшете использовали для моделирования и обработки в каждой группе перед сбором клеток. Смешанный лизат, содержащий буфер RIPA, ингибитор протеазы и ингибитор фосфатазы, добавляли для лизирования клеток в течение 30 минут на льду. После центрифугирования супернатант использовали для анализа белка. Общий белок определяли количественно с использованием анализа BCA и разделяли с помощью 10% SDS-PAGE. Отделенные белки переносили на мембрану и инкубировали с 5%-ным буфером, блокирующим обезжиренное молоко, при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем мембрану инкубировали с первичным антителом (Bcl-2 0,34 мг/мл, Bax 0,11 мг/мл, разведение 1:200) при 4°C в течение ночи. После стадии промывки мембрану инкубировали во вторичном антителе (0,5 мг/мл, разведение 1:5000) при 4°C в течение 1 часа, а затем в проявителе ECL в течение 2 минут для обычного проявления. Программное обеспечение Quantity One использовали для полуколичественного анализа экспрессии белка.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ ПРОТИВ УСТАЛОСТИ ЗАЩИТА ПЕЧЕНИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Экспериментальное моделирование животных и введение лекарств

Пятьдесят мышей-самцов 8-недельного возраста, не содержащих специфических патогенов, были случайным образом разделены на пять групп: нормальная группа, группа лечения MPTP (носитель), группа лечения низкими дозами C. Tubeulosa, лечение умеренными дозами C. Tubeulosa. группа и группа лечения высокими дозами C. Tubeulosa. Животных содержали при температуре 20–22°С со свободным доступом к пище и воде. Мышам в нормальной группе внутрибрюшинно вводили равный объем физиологического раствора в течение семи дней подряд. Мышам в других группах лечения внутрибрюшинно вводили МФТП (30 мг/кг/день) в течение семи дней подряд для создания носителей.

Во время моделирования БП мышам в группах лечения C. Tubeulosa низкими, умеренными и высокими дозами внутрижелудочно вводили эквивалентные клинические объемы 4 г/кг/сут, 8 г/кг/сут и 16 г/сут. кг/деньНанопорошок C. Tubeulosaсоответственно, в течение 14 дней подряд. Мышам в контрольной группе и группе носителя внутрижелудочно вводили эквивалентные объемы физиологического раствора в течение 14 дней подряд. Все экспериментальные процедуры были одобрены Этическим комитетом Фуцзяньского университета традиционной китайской медицины и проводились в соответствии с международно признанными принципами использования и ухода за лабораторными животными. В этом исследовании были предприняты все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных.