Клонирование, функциональная идентификация и анализ экспрессии халконсинтазы из Cistanche Tubulosa
Mar 25, 2024
Резюме: Цель: изучить функцию халконсинтазы Guanhuaroucongrong (Цистанхе трубчатая) и характер экспрессии гена CtCHS в белых, красных и фиолетовых цветах.
Методы. Ген CtCHS клонировали с помощью RT-PCR и проводили биоинформатический анализ. Плазмиду pET-28a-CtCHS переносили в Escherichia coli для индукции экспрессии белка с помощью IPTG. Рекомбинантный белок CtCHS инкубировали с субстратами п-кумароил-КоА и малонил-КоА, продукты детектировали методами ВЭЖХ и МС. Плазмиду pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS перенесли в протопласт Arabidopsis thaliana для наблюдения субклеточной локализации белка CtCHS. Характер экспрессии гена CtCHS в цветкахС. трубчатаяс тремя цветами был обнаружен с помощью qRT-PCR.
Результаты. Ген CtCHS был клонирован. Длина открытой рамки считывания (ORF) составила 1173 п.о., кодируя 390 аминокислот, молекулярная масса белка — 42 8000. CtCHS содержал каталитические остатки Cys164, His303, Asn336, консервативные в халконсинтазе. Белок CtCHS экспрессировали в E.coli и очищали с получением рекомбинантного белка. Белок CtCHS может катализировать п-кумароил-КоА и малонил-КоА с образованием нарингенин-халкона. Белок CtCHS преимущественно локализовался в цитоплазме. Ген CtCHS был высоко экспрессирован в фиолетовых и красных цветках, а относительные уровни экспрессии были в 8,44 и 3,21 раза выше, чем в белых цветках соответственно.
Вывод: Ген CtCHS был клонирован из цветкаС. трубчатаяи белок был экспрессирован. Белок CtCHS выполняет функцию халконсинтазы, а экспрессия гена CtCHS выше в более темных цветках, что указывает на то, что ген CtCHS может регулировать окраску цветков C. Tubeulosa, что закладывает основу для дальнейших исследованиймеханизм регуляции окраски цветков C. Tubeulosa.
Ключевые слова:Цистанхе трубчатая (Schenk) Уайт; халконсинтаза; анализ активности ферментов; субклеточная локализация; экспрессионный анализ
НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ, ЧТОБЫ ПОЛУЧИТЬ НАТУРАЛЬНЫЙ ОРГАНИЧЕСКИЙ ЭКСТРАКТ ЦИСТАНШИ С 30% ЭХИНАКОЗИДА И 12% АКТЕОЗИДА
Служба поддержки Wecistanche — крупнейшего экспортера цистаншей в Китае:
Электронная почта:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Телефон:+86 15292862950
Магазин для получения дополнительных технических характеристик:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
Биосинтетическийпуть флавоноидовначинается с фенилпропаноидного пути.Фенилаланинсначала превращается в коричную кислоту под действиемдействие фенилаланинаммиализы(PAL), а коричная кислота 4-гидроксилируется коричной кислотой. Фермент (-4-гидроксилаза коричной кислоты, C4H) и 4-кумараткофермент A лигаза (4-кумараткоэнзим A лигаза, 4CL) катализируют реакцию с образованием 4-кумароил-КоА [11 ]. Одна молекула 4-кумароил-КоА и три молекулы малонил-КоА катализируются халконсинтазой (CHS) с образованием нарингенина халкона, который содержит флавоноидные соединения. Основной скелет халконизомеразы, флаванон-3-гидроксилазы, дигидрофлавонол4-редуктаза и т. д. генерирует различные флавоноиды, такие как изофлавоны, флавонолы, антоцианы и т. д. [12]. Являясь ключевым ферментом пути биосинтеза флавоноидов, CHS регулирует содержание флавоноидов в растениях, а также играет важную роль в регуляции окраски цветков растений [13]. Например, посттранскрипционное молчание генов Gentiana scabra Bunge CHS может ингибировать биосинтез антоцианов и вызывать специфическое побеление долей венчика [14]. Выключение гена CHS у Actinidia erianthaBenth. CHS снижает содержание антоцианов в лепестках и делает лепестки красными. Лепестки становятся светлее[15]. Поэтому в этом исследовании ген CtCHS был клонирован из цветков Cistanche Tubeulosa, и на нем были проведены биоинформатический анализ, прокариотическая экспрессия и очистка, анализ активности ферментов, анализ субклеточной локализации и анализ экспрессии в трех цветах цветов, чтобы изучить функцию CtCHS. белка и характер экспрессии гена CtCHS были использованы для предварительного изучения связи между CtCHS и окраской цветков цистана трубчатого, что заложило основу для изучения механизма регуляцииЦвет цветка цистанхе трубчатой.
1 Материалы и инструменты
1.1 Материалы
Цветки цистанхе трубчатой были собраны в уезде Ютянь префектуры Хотан Синьцзяна в мае 2018 года. При отборе проб соблюдался случайный принцип: были выбраны цветы цистанхе трубчатой с хорошим физиологическим состоянием и постоянной высотой растений. Профессором Ту Пэнфэем из Фармацевтической школы Пекинского университета были взяты три штамма Cistanche Tubeulosa с цветками трех цветов: белого, красного и фиолетового. Их быстро заморозили в жидком азоте, а затем перевезли в Пекин в хранилище сухого льда. Химически компетентные клетки E. coli DH5 были приобретены у компании Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., а химически компетентные клетки E. coli BL21 (DE3) были приобретены у компании Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Вектор был приобретен у Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Малонил-КоА был приобретен у Sigma Company, 4-кумароил-КоА, нарингенин -халкон были приобретены у Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., а нарингенин был приобретен у Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.
1.2 Инструменты
Спектрофотометр Nanodrop 2000C (Thermo Fisher Company, США); прибор для градиентной ПЦР (Eppendorf Company, Германия); Прибор для количественной флуоресцентной ПЦР CFX 96, гель-визуализатор UVP, прибор для гель-электрофореза, прибор для электрофореза белков (BioRad Company, США); EnSpire
Микропланшетный ридер (PerkinElmer Company, США); инкубатор с постоянной температурой (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); Полнотемпературный генератор большой мощности DHZ-D (Тайканский завод экспериментального оборудования); THZ-82Генератор постоянной температуры на водяной бане (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); сверхчистый верстак AIRTECH (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); паровой стерилизатор высокого давления (компания TOMY, Япония); прибор для чистой воды Milli Q (Millipore, США); LC-20Высокоэффективный жидкофазный хроматограф (компания Shimadzu, Япония); масс-спектрометрия высокого разрешения UPLC-Q-Exactive-Orbitrap (Thermo Fisher Company, США); Лазерный конфокальный микроскоп FV1200 (компания Olympus, Япония).
2 Экспериментальные методы
2.1. Экстракция РНК и синтез кДНК.
Цветки цистанхе трубчатой измельчали в жидком азоте, а затем подвергали анализу экстракции РНК.
Тотальную РНК экстрагировали с использованием набора (Norgen, Cat 17200), концентрацию и качество РНК определяли с помощью NanoDrop 2000C, а образцы РНК с соотношением A260/A280 от 1,8 до 2,1 отбирали для обратной транскрипции для синтеза кДНК. Обратная транскриптаза M-MLV (Promega, M170B) использовалась для обратной транскрипции квалифицированной тотальной РНК в кДНК. Экспериментальные операции проводили согласно инструкции.
2.2 Клонирование гена CtCHS
На основании данных транскриптома цветков Cistanche tubeulosa нашей исследовательской группы [16] был отобран CtCHS с полной открытой рамкой считывания, а программное обеспечение SnapGene было использовано для разработки специфических праймеров на основе последовательности гена (таблица 1). ПЦР-амплификацию проводили с использованием кДНК цветка Cistanche Tubeulosa в качестве матрицы. Система амплификации представляла собой 2×Phanta Max Buffer 25 мкл, dNTPMix (10 ммоль/л) 1 мкл, восходящие и последующие праймеры (10 мкмоль/л) по 2 мкл каждый, кДНК 2 мкл, ДНК-полимераза Phanta Max SuperFidelity 1 мкл, ddH2O 17 мкл. Условия реакции были следующими: предварительная денатурация при 95° в течение 3 мин; 25 циклов денатурации при 95 градусах в течение 15 с, отжига при 55 градусах в течение 15 с и удлинения при 72 градусах в течение 1 мин; продление реакции при 72 градусах в течение 5 мин. Продукт ПЦР детектировали электрофорезом в 1% агарозном геле, для восстановления в геле использовали набор для очистки ДНК (Novizan, Cat DC301-01), а затем восстановленную ДНК очищали с помощью набора для быстрого клонирования (Novizan, Cat С601-01). Фрагмент ДНК лигировали с вектором pCE2TA/Blunt-Zero, трансформировали в компетентные клетки Escherichia coli DH5 и после культивирования в течение ночи при 37 градусах отбирали одиночные клоновые штаммы и отправляли их в компанию для секвенирования.
Таблица 1. Последовательности праймеров
2.3 Биоинформатический анализ
Используйте онлайн-программу ProtParam для анализа физических и химических свойств белков; использовать онлайн-инструмент Prot Scale для анализа гидрофильности/гидрофобности белков; использовать онлайн-инструмент SOPMA для прогнозирования вторичной структуры белка; использовать программное обеспечение для онлайн-анализа SWISS-MODEL для прогнозирования третичной структуры белка; использовать онлайн-программу TMHMM. Предсказать трансмембранную структуру белка; использовать программное обеспечение DNAMAN для сравнения гомологии CtCHS с аминокислотными последовательностями CHS других видов; используйте программное обеспечение MEGA-X для построения филогенетического дерева с использованием соединения соседей (Нью-Джерси) и поправки Пуассона. Эволюционное расстояние рассчитывается с использованием метода Bootstrap, а количество повторений Bootstrap составляет 1000 раз.
2.4 Прокариотическая экспрессия и очистка CtCHS
Разработайте праймеры с сайтами рестрикции BamHⅠ и XhoⅠ на основе последовательности CtCHS и ПЦР амплифицируйте соответствующие целевые фрагменты. Вектор pET-28a и целевой фрагмент расщепляли с использованием эндонуклеаз BamHI и Клонированный штамм секвенировали, и после правильного секвенирования экстрагировали плазмиду. Плазмиду pET-28a-CtCHS, проверенную секвенированием, перенесли в компетентные клетки Escherichia coli BL21 (DE3). Обратитесь к методу Ding Ning et al. [17] с изопропилом
-D-тиогалактопиранозид (IPTG) использовали для индукции экспрессии белка при низкой температуре и очищали на колонке аффинной хроматографии Ni2+ (Cytiva, Cat 17531901). Белок концентрировали центрифугированием в пробирке для ультрафильтрации (Millipore, 30 000) и обессоливали. Хранить в буфере КПБ концентрацией 20 ммоль/л (рН 8,0, содержащий 1 ммоль/ЛЭДТА) и хранить в холодильнике при -80 градусах для длительного хранения.
2.5 Анализ активности фермента CtCHS
Ферментная реакционная система CtCHS: 100 ммоль/л КПБ (pH 7,5) 468 мкл, 1 ммоль/л малонил-КоА 10 мкл, 5 ммоль/л 4-кумароил-КоА 2 мкл, CtCHS рекомбинантный белок 20 мкл, в. После реакции на водяной бане при 37 градусах в течение 12 часов смесь трижды экстрагировали по 800 мкл этилацетата, сушили током азота и затем растворяли в 100 мкл метанола. Для обнаружения продукта используйте высокоэффективную жидкостную хроматографию. Условия: колонка Ultimate LP-C18 (250 мм × 4,6 мм, 5 мкм), температура колонки 30 градусов, объем образца 10 мкл, вода (А) и ацетонитрил (В) в качестве потока. Фаза, градиент элюирования: 0~10
мин, 30% Б; 10~20 мин, 30%~60% Б; 20–25 мин, 60–70 % Б; 25–30 мин, 70–80 % Б; 30–35 мин, 80–100 % Б; 35-40 мин, 100% Б; 40-46 мин, 100%-30% B. Объемная скорость потока составляет 1 мл/мин, детектирование осуществляется при длине волны 290 нм.
Для дальнейшего обнаружения использовали UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Условия жидкой фазы: колонка Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 мм × 3,0 мм, 1,7 мкм), температура колонки 40 градусов, нарингенин- контроль халкон и нарингенин. Загрузочный объем продукта составляет 4 мкл, а загрузочный объем продукта ферментативной реакции составляет 7 мкл. В качестве подвижной фазы используется вода (А)-ацетонитрил (Б). Градиент элюирования составляет: от 0 до 5 мин, 30% B; от 5 до 15 минут, 30 %-60% B; 15-20 мин, 60%-100% B; 20-25 мин, 100% Б; 25-31 мин, 100%-30% B. Объемная скорость потока составляет 0,3 мл/мин. Условия масс-спектрометрии: источник ионов электрораспыления, азот в качестве газа-носителя, давление оболочки 3,5 МПа, давление вспомогательного газа 1,0 МПа, давление распыления 3500 В, температура капилляра 350 градусов, температура нагрева вспомогательного газа 200 градусов, режимы положительных и отрицательных ионов, сканирование. диапазон ионов m/z — 100-1500, полное разрешение МС — 35 000, разрешение dd-MS2 — 17 500, (N)
CE/stepped nce установлен на 35, 60.
2.3 Биоинформатический анализ
Используйте онлайн-программу ProtParam для анализа физических и химических свойств белков; использовать онлайн-инструмент Prot Scale для анализа гидрофильности/гидрофобности белков; использовать онлайн-инструмент SOPMA для прогнозирования вторичной структуры белка; использовать программное обеспечение для онлайн-анализа SWISS-MODEL для прогнозирования третичной структуры белка; использовать онлайн-программу TMHMM. Предсказать трансмембранную структуру белка; использовать программное обеспечение DNAMAN для сравнения гомологии CtCHS с аминокислотными последовательностями CHS других видов; используйте программное обеспечение MEGA-X для построения филогенетического дерева с использованием соединения соседей (Нью-Джерси) и поправки Пуассона. Эволюционное расстояние рассчитывается с использованием метода Bootstrap, а количество повторений Bootstrap составляет 1000 раз.
2.4 Прокариотическая экспрессия и очистка CtCHS
Разработайте праймеры с сайтами рестрикции BamHⅠ и XhoⅠ на основе последовательности CtCHS и ПЦР амплифицируйте соответствующие целевые фрагменты. Вектор pET-28a и целевой фрагмент расщепляли с использованием эндонуклеаз BamHI и Клонированный штамм секвенировали, и после правильного секвенирования экстрагировали плазмиду. Плазмиду pET-28a-CtCHS, проверенную секвенированием, перенесли в компетентные клетки Escherichia coli BL21 (DE3). Обратитесь к методу Ding Ning et al. [17] с изопропилом
-D-тиогалактопиранозид (IPTG) использовали для индукции экспрессии белка при низкой температуре и очищали на колонке аффинной хроматографии Ni2+ (Cytiva, Cat 17531901). Белок концентрировали центрифугированием в пробирке для ультрафильтрации (Millipore, 30 000) и обессоливали. Хранить в буфере КПБ концентрацией 20 ммоль/л (рН 8,0, содержащий 1 ммоль/ЛЭДТА) и хранить в холодильнике при -80 градусах для длительного хранения.
2.5 Анализ активности фермента CtCHS
Ферментная реакционная система CtCHS: 100 ммоль/л КПБ (pH 7,5) 468 мкл, 1 ммоль/л малонил-КоА 10 мкл, 5 ммоль/л 4-кумароил-КоА 2 мкл, CtCHS рекомбинантный белок 20 мкл, в. После реакции на водяной бане при 37 градусах в течение 12 часов смесь трижды экстрагировали по 800 мкл этилацетата, сушили током азота и затем растворяли в 100 мкл метанола. Для обнаружения продукта используйте высокоэффективную жидкостную хроматографию. Условия: колонка Ultimate LP-C18 (250 мм × 4,6 мм, 5 мкм), температура колонки 30 градусов, объем образца 10 мкл, вода (А) и ацетонитрил (В) в качестве потока. Фаза, градиент элюирования: 0~10
мин, 30% Б; 10~20 мин, 30%~60% Б; 20–25 мин, 60–70 % Б; 25–30 мин, 70–80 % Б; 30–35 мин, 80–100 % Б; 35-40 мин, 100% Б; 40-46 мин, 100%-30% B. Объемная скорость потока составляет 1 мл/мин, детектирование осуществляется при длине волны 290 нм.
Для дальнейшего обнаружения использовали UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS. Условия жидкой фазы: колонка Waters Acquity UPLC BEH SheildRP18 (100 мм × 3,0 мм, 1,7 мкм), температура колонки 40 градусов, нарингенин- контроль халкон и нарингенин. Загрузочный объем продукта составляет 4 мкл, а загрузочный объем продукта ферментативной реакции составляет 7 мкл. В качестве подвижной фазы используется вода (А)-ацетонитрил (Б). Градиент элюирования составляет: от 0 до 5 мин, 30% B; от 5 до 15 минут, 30 %-60% B; 15-20 мин, 60%-100% B; 20-25 мин, 100% Б; 25-31 мин, 100%-30% B. Объемная скорость потока составляет 0,3 мл/мин. Условия масс-спектрометрии: источник ионов электрораспыления, азот в качестве газа-носителя, давление оболочки 3,5 МПа, давление вспомогательного газа 1,0 МПа, давление распыления 3500 В, температура капилляра 350 градусов, температура нагрева вспомогательного газа 200 градусов, режимы положительных и отрицательных ионов, сканирование. диапазон ионов m/z — 100-1500, полное разрешение МС — 35 000, разрешение dd-MS2 — 17 500, (N)
CE/stepped nce установлен на 35, 60.
2.6. Субклеточная локализация белка CtCHS.
На основе последовательности CtCHS и принципа бесшовного клонирования были созданы праймеры с сайтами расщепления ферментов Kpn Ⅰ и BamH Ⅰ и соответствующие целевые фрагменты амплифицировали методом ПЦР. Плазмиду pCAMBIA1300-35S-GFP расщепляли эндонуклеазами рестрикции Kpn Ⅰ и BamH Ⅰ, целевой фрагмент и вектор соединяли с помощью набора для бесшовного клонирования (Novizan, Cat C115-01), а затем переносили в компетентные клетки E. coli DH5. , выберите отдельные штаммы клонов для секвенирования и извлеките плазмиды из правильных штаммов. Плазмиды pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS и pCAMBIA1300-35S-GFP трансформировали в протопласты Arabidopsis thaliana с использованием PEG4000 и культивировали при слабом освещении в течение 8-10 часов. Субклеточную локализацию белка CtCHS наблюдали под лазерным конфокальным микроскопом.
2.7 Анализ структуры экспрессии CtCHS
Количественные флуоресцентные праймеры в реальном времени были разработаны с использованием DNAMAN на основе последовательности CtCHS с F-box в качестве внутреннего эталонного гена. Последовательности праймеров показаны в таблице 1. Относительную экспрессию CtCHS в цветках Cistanche tubeulosa разного цвета определяли с помощью флуоресцентной количественной ПЦР в реальном времени. Используйте TransStart Green qPCR SuperMix (полное золото, AQ101-02) для измерения методом флуоресцентного красителя SYBRGreen. Реакционная система: 2×TransStartGreen qPCR SuperMix 5 мкл, восходящие и последующие праймеры (10 мкмоль/л) 0.2 мкл каждый, матрица кДНК 0,5 мкл, 4,1 мкл воды, свободной от нуклеотидаз. для реакции используют двухстадийный метод. Процедура реакции была основана на методе Dong Xianjuan et al. [18]. Каждый образец содержал 3 биологические повторы, эксперимент повторялся трижды. Экспериментальные данные анализировали с помощью Excel, относительную экспрессию CtCHS рассчитывали с помощью метода 2-ΔΔCt, а GraphPadPrism 8 использовали для анализа значимости и построения гистограмм.
