Цистанозид Cistanche Herba улучшает репродуктивную функцию мужчин, вызванную гипоксией, посредством подавления окислительного стресса-Ⅱ

Влияние цис на жизнеспособность клеток GC-1, индуцированную гипоксией, in vitro.

Чтобы выяснить, может ли цис предотвратить ингибирующее действие гипоксии на жизнеспособность клеток GC{{0}}, был проведен анализ CCK-8. Клетки GC-1 обрабатывали различными подтипами (цис-A, B, C, H) и диапазонами концентраций (0.02 мкМ, 0.2 мкМ, 2 мкМ) цис в течение 72 часов. Сравнение модельной группы с группой ДМСО показало, что ДМСО не способствует непосредственно жизнеспособности клеток GC{{10}} (рис. 2А). Однако жизнеспособность клеток заметно восстанавливалась (P < 0.05) при цис-обработке. По сравнению с модельной группой, Цис-А, Цис-В, Цис-С и Цис-Н продемонстрировали определенные защитные эффекты в отношении вызванного гипоксией повреждения жизнеспособности клеток GC-1, а Цис-В показал наиболее значительный эффект. эффект (рис. 2А). Защитные эффекты цис при 0,2 мкМ были значительно выше, чем защитные эффекты цис при 0,02 мкМ, тогда как разница между 2 мкМ и 0,2 мкМ не была очевидной, что указывает на то, что восстановленный Жизнеспособность клеток GC-1, индуцированная цис, продемонстрировала дозозависимое увеличение в диапазоне концентраций от 0,02-0,2 мкМ (рис. 2А). Поэтому, в соответствии с экспериментальными потребностями, 0,2 мкМ Цис был выбран в качестве оптимальной концентрации в следующих экспериментах in vitro. Для дальнейшего подтверждения того, действительно ли зародышевые клетки были защищены с помощью цис, было проведено окрашивание FCM и Ki-67 для оценки изменения пролиферации клеток GC-1 после обработки цис. При обработке цис доля клеток GC-1 в фазе G1 снижалась. Напротив, в S-фазу вошло больше клеток, что позволяет предположить, что цис-обработка может увеличить индекс пролиферации зародышевых клеток (P <0,01; рисунок 2B). Статистика клеточного цикла GC-1 показана на рисунке 2Bb. Результаты окрашивания Ki-67 также показали, что обработка Цис-A, Цис-B, Цис-C и Цис-H значительно улучшала соотношение Ki-67-положительных клеток в GC, индуцированных гипоксией{{54} } клетки in vitro (рис. 2C).

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Цис-механизм защищает половые клетки от гипоксии in vitro.

Чтобы выяснить, связано ли защитное действие Цис на клетки GC-1 с удалением избыточных АФК, флуоресцентный краситель DCFH-DA использовался для определения уровней АФК в каждой группе. Как показано на рисунках 3А и 3В, обработка ДМСО не изменила внутриклеточное содержание АФК или уровень ПОЛ по сравнению с модельной группой. Однако уровни АФК в клетках GC-1 были заметно снижены в группах, получавших цис-обработку (рис. 3А). Кроме того, снижение ПОЛ также наблюдалось в клетках GC-1, подвергнутых воздействию цис (рис. 3B).

Для дальнейшего изучения механизма, с помощью которого цис защищает зародышевые клетки от гипоксического повреждения, было проведено окрашивание TUNEL и вестерн-блоттинг для оценки апоптоза. Окрашивание TUNEL (рис. 3C) показало значительный апоптоз в группах модели и ДМСО. Однако при обработке цис наблюдалось меньше апоптотических клеток, что указывало на то, что обработка цис уменьшала апоптоз клеток GC-1. Кроме того, для подтверждения молекулярного механизма была измерена экспрессия PARP, каспазы-3, Bax и Bcl-2. Как показано на рисунке 3D, каспаза-3 и PARP активировались в клетках GC-1 в условиях гипоксии, и эта активация ингибировалась цис-обработкой. Кроме того, соотношение Bax/Bcl-2 было выше в модельной группе, чем в контрольной группе, а цис-обработка снижала соотношение Bax/Bcl-2 (рис. 3D). Эти данные показали, что цис обладает потенциальной способностью ослаблять оксидантное повреждение, вызванное гипоксией, и этот защитный эффект может быть достигнут за счет уменьшения накопления АФК и ингибирования активации пути апоптоза, связанного с каспазой.

Ферментативный механизм ингибирования ОС включает в себя поглотители свободных радикалов, такие как глутатионредуктаза (GR), глутатионпероксидаза (GPx) и супероксиддисмутаза (СОД) [23]. Ферментативный механизм ингибирования ОС играет важную роль в предотвращении окислительного повреждения клеток и тканей [23]. Для дальнейшей проверки потенциального механизма цис-ингибирования ОС, индуцированной гипоксией, в клетках GC-1 были измерены активности GR, GPx и SOD. Результаты показали, что активность GR, GPx и SOD значительно (P < 0.01, рисунок 3E) снизилась в условиях гипоксии по сравнению с контрольными группами, а лечение цис заметно восстановило их активность в Клетки GC-1, подвергшиеся гипоксии (P <0,05, рисунок 3E), позволяют предположить, что эти соединения могут активировать мощную эндогенную антиоксидантную систему.

ЦИСТАНХЕ TUBULOSA ДЛЯ СТИМУЛИРОВАНИЯ ПРОИЗВОДСТВА СПЕРМЫ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Влияние цис на репродукцию крыс, вызванных гипобарической гипоксией.

Чтобы определить влияние гипобарической гипоксии на крыс-самцов, мы сначала проверили морфологические изменения семенников у крыс, вызванных гипобарической гипоксией. Результаты окрашивания HE показали, что в контрольной группе нормальные сперматогенные клетки на различных стадиях располагались упорядоченно от базальной мембраны до просвета канальцев, а в просветах канальцев были видны зрелые сперматозоиды (рис. 4А). По сравнению с контролем в модельной группе наблюдались патологические изменения ткани яичка, базальная мембрана эпителиальных клеток яичка располагалась рыхло, сперматогенный эпителий был чрезвычайно тонким, а уровень и количество половых клеток были заметно снижены (рис. 4А). . Однако лечение цис значительно улучшило гистологию повреждения яичек, вызванного гипобарической гипоксией in vivo (рис. 4А). Также измеряли массу тела, массу семенников, массу придатков яичек и массу семенных пузырьков, на основании чего рассчитывали индекс репродуктивного органа (соотношение репродуктивного органа/массы тела). Как показано на рисунке 4B-D, индекс репродуктивных органов (семенники, придатки яичек и семенные пузырьки) был заметно ниже в модельной группе (P <{7}},01), чем в контрольной группе. Однако влияние гипобарической гипоксии на индекс репродуктивных органов крыс было обращено вспять при лечении цис (рис. 4B-D).

Затем также измеряли активность акросомного фермента и количество живых сперматозоидов в сперме самцов крыс, чтобы выяснить повреждение функции яичек. Как показано на рисунках 4E, 4F, активность ферментов акросом и подвижность сперматозоидов были ниже у крыс модельной группы, чем в контрольной группе (P < 0.01). Однако по сравнению с крысами в модельной группе активность фермента акросомы восстанавливалась у крыс, получавших цис в дозе 8 мг/кг/сут (P <0,05) (рис. 4D). Более того, как показано на рисунке 4F, лечение цис такжеувеличило количество живых сперматозоидов; у всех крыс, получавших цис в дозе 8 мг/кг/сут, наблюдалось значительно повышенное количество живых сперматозоидов (55,83 ± 6,03%, P < 0.05; 69.{ {8}} ± 2,29 %, P < 0,01; 52,33 ± 3,40 %, P < 0,05 и 53,67 ± 2,25 %, P < 0,05 соответственно) по сравнению с модельными крысами (43,83 ± 4,01 %) .

В совокупности эти результаты позволяют предположить, что гипобарическая гипоксическая среда приводит к морфологическим изменениям яичек, потере веса репродуктивных органов и повреждению функции яичек у самцов крыс, а цис может эффективно защищать репродуктивные органы от повреждений, вызванных гипоксией.

Влияние цис на ОС в семенниках крыс, вызванных гипобарической гипоксией.

Уровни АФК и ПОЛ в семенниках крыс измеряли с целью анализа влияния цис на ОВ, вызванную гипобарической гипоксией. Анализ АФК показал, что по сравнению с контрольной группой уровни АФК в семенниках в модельной группе были значительно повышены (P < 0.01 Рисунок 5А). И наоборот, ПОЛ был резко повышен в семенниках (P < 0,01) при гипобарической гипоксии по сравнению с нормоксическими условиями (рис. 5B). Однако лечение цис изменило вышеуказанные изменения (P <0,05), при этом цис-B оказал лучший эффект, чем другие цис (рис. 5A, 5B). Цис, по-видимому, защищал семенники, снижая ОС в условиях гипобарической гипоксии in vivo.

Кроме того, были проведены анализы апоптоза для дальнейшей оценки механизма, с помощью которого цис защищает от повреждения функции яичек, вызванного гипобарической гипоксией. Результаты окрашивания TUNEL (рис. 5C) показали, что в модельной группе существовал значительный апоптоз по сравнению с контрольной группой. Однако после лечения цис (8 мг/кг/сут) наблюдалось меньшее количество апоптотических клеток (P < 0,05) (рис. 5C). Данные вестерн-блоттинга также показали, что гипоксия и гипобарическая обработка приводили к активации каспазы-3 и PARP и увеличению соотношения Bax/Bcl-2 в ткани яичка, что указывает на усиление апоптоза (рис. 5D). Кроме того, различные видыЦис-лечениезначительно снизил апоптоз в ткани яичек (рис. 5D). Аналогичным образом, ИГХ-анализ ткани яичек показал аналогичные результаты (дополнительный рисунок 1).

Чтобы проверить механизм цис-редуцированной ОС, вызванной гипобарической гипоксией, мы дополнительно проверили активность GR, GPx и SOD в ткани яичка. Как показано на рисунке 5E, по сравнению с контрольной группой, лечение гипобарической гипоксией значительно снижало активность GR, GPx и SOD (P < 0.01). Однако обработка цис восстанавливала активность ферментов (ГР, ГП и СОД) ткани семенников у крыс, перенесших гипобарическую гипоксию (P < 0,05). В заключение, цис, по-видимому, защищает семенники, активируя мощный механизм защиты эндогенных антиоксидантных ферментов в условиях гипобарической гипоксии.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Обсуждение

Известно, что в высокогорных районах гипобарическая гипоксия поражает многие системы человека, в том числе мужскую репродуктивную систему [4, 20]. Недавние экспериментальные исследования направлены на понимание механизмов влияния гипобарической гипоксии на мужскую репродуктивную систему. В этом исследовании изучалось терапевтическое воздействие цис-экстракта Cistanches Herba на репродуктивные нарушения, вызванные гипоксией. Результаты показали, что Цис может защищать мужскую репродуктивную систему от гипоксического повреждения за счет снижения вызванного гипоксией накопления АФК и ОВ за счет повышения активности эндогенных антиоксидантных ферментов.

АФК — это свободные радикалы, производные кислорода, которые играют жизненно важную роль в физиологии и патологии человека. Низкие дозы АФК необходимы длякапацитация сперматозоидов, акросомная реакция и слияние сперматозоидов с ооцитами [24, 25]. Однако избыточное накопление АФК часто приводит к повреждению половых клеток и стромальных клеток, что приводит к мужскому бесплодию [26]. АФК могут легко повредить клеточные мембраны, нуклеиновые кислоты, белки, ферменты и другие биологические макромолекулы посредством перекисного окисления. Более того, они также приводят к потенциальному повреждению клеток и ДНК, когда превышают антиоксидантную способность. Накопленные данные подтверждают ключевую роль АФК в патогенезе мужской фертильности [27, 28]. Производство АФК регулируется напряжением кислорода. В условиях гипоксии количество доступного кислорода в окружающей среде уменьшается, а вязкость крови увеличивается, что влияет на многие кислородзависимые метаболические процессы в организме [29, 30]. Однако более низкое атмосферное давление на больших высотах вызывает плохой венозный возврат и уменьшение количества кислорода, транспортируемого кровотоком ко всем клеткам организма, что еще больше усиливает гипоксию органов и клеток [29, 30]. Таким образом, пребывание на большой высоте вызывает ряд гипоксических физиологических реакций, включая продукцию и накопление АФК, когда потребность в кислороде превышает кровоснабжение. Как упоминалось ранее, накопление АФК приводит к множеству внутриклеточных эффектов, наиболее важным из которых является возникновение ОС в клетках.

Под ОС подразумевается дисбаланс между реакциями окисления и восстановления, приводящий к образованию избытка окислителей или молекул, которые принимают электрон от другого реагента, что, в свою очередь, производит АФК [31, 32]. Хорошо известно, что ОС может быть вызвана рядом эндогенных и экзогенных факторов, включая воздействие большой высоты. Сперматозоиды являются клетками, которые особенно восприимчивы к ОС из-за их неадекватных систем восстановления клеток и высокого содержания в плазматической мембране полиненасыщенных жирных кислот [33]. Ткани яичка и придатка яичка не являются исключением: наличие тяжелой ОС наблюдалось в круглых сперматидах крыс, подвергнутых гипоксии [4]. ОС влияет на стабильность ДНК, тем самым ставя под угрозу целостность генетического материала гамет [34-36]. Однако подтверждено, что высокий уровень повреждения ДНК в мужских гаметах приводит к активации передачи сигналов апоптоза, что приводит к снижению количества придаточных сперматозоидов и увеличению процента дефектных клеток [28, 37]. В настоящем исследовании гипоксия значительно снижала жизнеспособность клеток GC-1 за счет индукции апоптоза и остановки клеточного цикла. Что еще более важно, анализ FCM после стимуляции гипоксией показал значительно повышенные уровни АФК с повышенной скоростью апоптоза и более высокой активацией каспазы -3, PARP и соотношения Bax/Bcl-2, что указывает на то, что АФК могут активироваться. апоптоз путем активации сигнального пути каспазы во время нарушения фертильности, вызванного гипоксией. Полученные результаты показали, что гипоксия приводит к чрезмерному накоплению АФК, вызывая окислительное повреждение репродуктивных клеток. Таким образом, имеет смысл идентифицировать новые антиоксиданты, которые могут служить эффективным подходом к облегчению нарушений фертильности, вызванных гипоксией.

Для защиты от ОС в организме существует сложная антиоксидантная система, состоящая преимущественно из ферментативных факторов. В физиологических условиях содержание АФК и антиоксидантная система поддерживают определенный баланс. Однако перепроизводство АФК истощает антиоксидантную систему сперматозоидов, что приводит к ОС, что вызывает повреждение ДНК сперматозоидов и приводит к снижению фертильности и частоты наступления беременности [23]. Таким образом, для решения проблемы перепроизводства АФК и связанных с ним вредных эффектов на клеточном уровне мужской репродуктивной системы были протестированы различные антиоксидантные стратегии [23]. В настоящее время в литературе имеется информация об использовании соединений с антиоксидантной активностью иулучшение функции спермыявляется обширным. Важно отметить, что в большинстве отчетов описывается улучшение параметров спермы после перорального приема антиоксидантов, в том числеулучшение концентрации сперматозоидови подвижность или уменьшение повреждений ДНК [38]. Таким образом, все большее число урологов назначают пероральные антиоксиданты при бесплодии из-за проблем, связанных с ОС [39]. К таким антиоксидантам относятся главным образом карнитины, витамины, цинк, мелатонин и природные соединения [23, 40]. В настоящее время, с развитием технологии экстракции лекарств, все большее количество экстрактов традиционной китайской медицины также рассматривается как средство смягчения мужского бесплодия, поскольку эти антиоксиданты могут снижать разрушительное воздействие ОС [41]. Юдже А. и др. в 2013 году сообщили, что корица благотворно влияет на окислительный и антиоксидантный баланс в семенниках и качество спермы [42]. Чжан Л и др. показали, что куркумин значительно улучшает подвижность сперматозоидов у пациентов и снижает H2O2 [43]. Кроме того, было показано, что ряд других растительных экстрактов, таких как черника, крокус посевной, семена граната и зеленый чай, защищают репродуктивную систему посредством антиоксидантных механизмов [27, 44-47]. Cistanches Herba — важная традиционная китайская медицина, обладающая благоприятным профилем безопасности и широкими лечебными функциями для лечения бесплодия, среди других состояний [13]. Современные фармакологические исследования показали, что Cistanches Herba обладает различной активностью, такой как антиоксидантная, противовоспалительная, гепатопротекторная и противонейродегенеративная активность [13, 48]. Таким образом, экстракты, фракции или соединения Cistanches Herba могут обладать потенциальными антиоксидантными свойствами для лечения бесплодия.

Активные вещества растений, повышающие плодовитость, включают различные химические группы, такие как PhG, сапонины, кислородсодержащие летучие соединения и алкалоиды [41]. Исследования фармакологической активности PhG показали, что PhG проявляют широкий спектр биологической активности, такой как антиоксидантная, антирадиационная нейропротекция и усиление сексуальной функции [49, 50]. Среди этих мероприятий постепенно привлекает внимание антиоксидантное действие. Сообщалось, что некоторые отдельные компоненты или фракции PhG ингибируют апоптоз зародышевых клеток, индуцированный различными химическими веществами, а их антиоксидантные способности in vitro также были продемонстрированы in vivo на нескольких моделях животных [51, 52]. Эти результаты показывают, что PhG могут быть привлекательными кандидатами на рольлечение мужского бесплодия. Цис представляет собой активный PhG, который можно выделить из Cistanches Herba. В настоящем исследовании мы изучили влияние цис на клетки, обработанные гипоксией, или на модели крыс, а также исследовали основные молекулярные механизмы. Цис проявлял защитную активность в отношении снижения жизнеспособности, вызванной гипоксией, и увеличения апоптоза в клетках GC-1, а также проявлял защитное действие в отношении вызванных гипоксией повреждений репродуктивной системы крыс in vivo. Наблюдалось достоверное снижение активности GR, GPx и СОД в условиях гипоксии по сравнению с нормоксичными группами, тогда как удельная активность GR, GPx и СОД значительно повышалась в семенниках или клетках GC-1, обработанных Цис. Цис, по-видимому, защищает семенники и клетки GC-1 в условиях гипоксии, усиливая активность антиоксидантных ферментов.

Ферментные антиоксиданты действуют главным образом за счет удаления супероксидных анионов, тем самым предотвращая перекисное окисление липидов и повреждение ДНК, предотвращая бесплодие. Ферментативные антиоксидантные механизмы играют решающую роль в предотвращении окислительного повреждения [23]. Ферментативный механизм против ОС включает в себя поглотители свободных радикалов и глутатион-зависимые ферменты, включая GR, GPx и SOD [12]. Хорошо известно, что антиоксидантные ферменты необходимы для мужской репродуктивной системы. В настоящем исследовании эффект снижения активности антиоксидантных ферментов в условиях гипобарической гипоксии сопровождался увеличением АФК и ПОЛ в модельной группе, что согласуется с предыдущими сообщениями [12]. Однако введение цис привело к восстановлению активности антиоксидантных ферментов в клетках GC-1 и семенниках крыс, что позволило разработать стратегии введения Cistanches Herba для предотвращения повреждений, вызванных гипобарической гипоксией, как предполагалось ранее. Хотя настоящие результаты показали, что лечение цис частично снижает повреждение зародышевых клеток у крыс, вызванное гипоксией, необходимы дальнейшие исследования, чтобы раскрыть полную картину его репродуктивно-защитных эффектов. Например, специфический механизм действия цис влияет на активность антиоксидантных ферментов. Кроме того, остается вопрос, могут ли иметь значение какие-либо другие механизмы, поскольку цис лишь частично восстанавливается после репродуктивного повреждения, вызванного гипоксией. Наконец, следует также рассмотреть вопрос о том, оказывает ли цис прямое стимулирующее рост влияние на зародышевые клетки.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША TUBULOSA ДЛЯ ПОДДЕРЖАНИЯ АКТИВНОСТИ СПЕРМЫ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Выводы

В целом, результаты этого исследования подчеркивают потенциал цис-оксида в качестве антиоксиданта для лечения вызванных гипоксией нарушений репродуктивной функции мужчин. Цис может защитить от повреждения мужской репродуктивной системы, вызванного гипоксией, восстанавливая активность антиоксидантных ферментов, снижая ОС, индуцированную АФК, одновременно повышая жизнеспособность клеток и уменьшая апоптоз. Важно отметить, что все изученные в этом исследовании подтипы Цис (Цис-А, Цис-В, Цис-С и Цис-Н) продемонстрировали определенный защитный эффект на репродуктивную систему, а Цис-В показал наиболее значительный эффект. Таким образом, мы предполагаем, что цис может быть хорошим кандидатом на роль антиоксиданта.лечение нарушений мужской репродуктивной системы, вызванных гипоксией, хотя точный основной механизм требует дальнейшего изучения.