Цистанозид Cistanche Herba улучшает репродуктивную функцию мужчин, вызванную гипоксией, посредством подавления окислительного стресса-Ⅰ

Введение

В настоящее время примерно 48,5 миллионов (15%) пар репродуктивного возраста во всем мире страдают от бесплодия, среди которых 40-50% случаев приходится на мужское бесплодие, состояние, которое тесно связано с факторами окружающей среды и образа жизни. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что восприимчивость яичек млекопитающих к низкому давлению кислорода является причинным фактором некоторых форм мужского бесплодия. Как было показано в предыдущих исследованиях, сперматогенез нарушается и снижается при воздействии гипобарической гипоксии.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Чтобы изучить основной механизм, исследования показали, что воздействие гипобарической гипоксии увеличивает выработку активных форм кислорода (АФК). АФК играют важную роль в мужской репродуктивной системе. На низких уровнях они необходимы для капацитации сперматозоидов, акросомной реакции и слияния сперматозоидов с ооцитами [10]. Однако избыток АФК может вызвать повреждение ядерной/митохондриальной ДНК сперматозоидов и пероксидативное повреждение плазматической мембраны, которые, в свою очередь, являются основными этиологическими факторамиповышенный риск мужского бесплодия. Таким образом, накопление АФК, вызванное гипоксией, может быть одной из причин мужского бесплодия.

Цистанчес Херба, многолетнее паразитическое лекарственное растение, широко распространено в засушливых районах и широко используется благодаря своей фармакологической активности. Среди всего эффективного содержанияЦистанчес Херба, PhGs рассматривались как основной активный компонент. На сегодняшний день выделено 34 PhG.Цистанчи растения. Цистанозид(Цис), активный PhG, выделенный изЦистанчес Херба, привлек внимание своим антиоксидантным действием.

Учитывая антиоксидантные эффекты Цис и роль АФК в мужском бесплодии, вызванном гипоксией, Цис считается потенциальным кандидатом на лечениемужское бесплодие, вызванное гипоксией. Тем не менее, в нескольких сообщениях рассматриваются антиоксидантные эффекты цис-экстракции из Cistanches Herba при лечении мужского бесплодия, вызванного гипоксией, или задействованных сигнальных путях. В данном исследовании были построены экспериментальные модели гипоксии in vitro и in vivo и оценены компоненты эффектов различных цис.

Материалы и методы

Клеточная культура и реагент

Линия клеток сперматогоний мыши GC-1spg (GC-1) была приобретена из Американской коллекции типовых культур (ATCC) и культивирована в среде DMEM (Invitrogen, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% L-глутамин (100 мМ), пенициллин (100 ед/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл) при 37 градусах во влажном инкубаторе с 5% CO2. Цис (Цис-А, В, С, Н) приобретали у Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (Китай).

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Анализ жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток проверяли с помощью набора для подсчета клеток {{0}} (CCK-8). Вкратце, клетки GC-1 высевали в планшеты с 96-лунками по 1,5×103 на лунку и культивировали при 37 градусах в течение 24 часов. Затем клетки обрабатывали различными концентрациями (20%, 15%, 10%, 5%) кислорода или разными концентрациями (2 мкМ, 0,2 мкМ, 0,02 мкМ) цис-(Цис-А, Цис-В, Цис-Б). С, Цис-Н) в течение необходимого времени. Затем супернатант отбрасывали и жизнеспособность клеток определяли с использованием набора CCK-8 (Dojindo Japan). Поглощение каждой лунки измеряли при 450 нм с использованием устройства для считывания микропланшетов (BioRad USA). Наконец, жизнеспособность клеток рассчитывали по следующей формуле: Жизнеспособность клеток=(экспериментальная группа - группа ODblank)/ (контрольная группа OD - группа ODblank) × 100%.

Вестерн-блот-анализ

Собранные клетки или ткани гомогенизировали в буфере RIPA для экстракции белков (RIPA Beyotime China; Cocktail Roche Switzerland). Супернатанты собирали и определяли концентрацию белков методом BCA (Beyotime). Примерно 40 мкг экстрагированных белков из каждого образца отделяли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и электропереносили на мембранный фильтр из нитроцеллюлозы (NC) (Beyotime China). Мембраны фильтра NC блокировали 5% обезжиренным молоком в течение 1,5 часов и инкубировали со специфическими антителами (анти-PARP 1:1000, антикаспаза-3 1:1000, анти-Bcl-2 1:1000, анти-Bax 1 :1000, анти-GAPDH 1:1000, все антитела были приобретены у Cell Signaling Technology, США) в течение ночи при 4 градусах. Затем все мембраны НК инкубировали с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой хрена, в течение 1,5 ч при комнатной температуре и визуализировали с помощью системы визуализации (Tannon, Китай).

Обнаружение клеточного цикла

Для анализа клеточного цикла был проведен проточно-цитометрический анализ (FCM). Клетки обрабатывали в различных условиях в течение 72 часов и собирали. Затем клетки промывали PBS, фиксировали в 75% этаноле и окрашивали иодидом пропидия (PI). Для каждого образца собирали 1×104 клеток и анализировали их методом проточной цитометрии (FACS Calibur, BD Biosciences). Затем рассчитывали долю клеток фазы G1/S/G2 и индекс пролиферации [Фаза(S+G2)/Фаза(G1+S+G2) × 100%].

Окрашивание Ки-67

Клетки культивировали в конфокальной чашке и обрабатывали гипоксией или различными подтипами цис в течение 72 часов. После фиксации всех клеток 4% параформальдегидом их инкубировали с антителом против Ki-67 (1:200, Cell Signaling Technology). Затем все клетки инкубировали с соответствующим CY-3-конъюгированным антителом против кроличьего IgG (1:200, Boster, Китай) и раствором DAPI (1,0 мкг/мл, Beyotime). Флуоресценцию наблюдали с помощью конфокального микроскопа Fluoview FV1000 (Olympus, Япония).

ЭКСТРАКТ ЦИСТАНХА TUBULOSA ВЫСШЕГО УРОВНЯ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ТЕСТОСТЕРОНА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Обнаружение АФК

FCM был введен для измерения внутриклеточных уровней АФК с использованием DCFH-DA. Суспендированные клетки высевали в 6-луночные планшеты и подвергали различным обработкам. После 72 часов обработки клетки суспендировали в бессывороточной среде DMEM с 10 мкМ DCFH-DA (Beyotime). Затем содержание АФК определяли путем сортировки клеток, активируемой флуоресценцией, на системе проточной цитометрии Beckman Coulter с длиной волны возбуждения 488 нм и длиной волны эмиссии 525 нм [18].

Определение перекисного окисления липидов (ПОЛ)

Для обнаружения ПОЛ проводили анализ веществ, реагирующих на тиобарбитуровую кислоту (TBARS). Все этапы работы выполнялись согласно инструкции (Sigma USA). Концентрации рассчитывали с использованием молярного коэффициента экстинкции 1,56×105/(М·см), который был получен с использованием малонового диальдегида в качестве стандарта. Результаты выражены в нмоль эквивалентов MDA/мг белка.

Определение активности ферментов

Активность фермента тестировали с использованием наборов для анализа, включающих глутатионредуктазу (GR), глутатионпероксидазу (GPx) и супероксиддисмутазу (SOD). Все рабочие этапы выполняли в соответствии с предоставленными инструкциями (Институт биоинженерии Нань Цзин Цзянь Ченг, Китай).

Животные и экспериментальный протокол

Половозрелые самцы крыс линии Вистар (180-220 г, возраст 8 недель) были получены из центра животных Четвертого военно-медицинского университета, Сиань, Китай. Разрешение на использование животных было получено от Комитета по этике университета (номер ссылки: 20190506). Эксперимент на животных проводился в соответствии с университетскими рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных.

Всем крысам давали возможность адаптироваться примерно за 1 неделю до начала эксперимента. После акклиматизации крыс случайным образом распределили на 6 групп по 5 животных в каждой. Крысы в ​​контрольной группе выращивались при нормальном давлении (PO2: 20%; давление воздуха: 101,3 кПа), тогда как крысы в ​​модельной группе и группах, получавших цис, выращивались в кислородной камере низкого давления (внутреннее давление 61,6 кПа). , что эквивалентно высоте 4000 метров над уровнем моря PO2: 14,55%) для имитации высотной гипоксической среды; Все крысы имели свободный доступ к пище и воде в пластиковых клетках при температуре 22±2 градуса и влажности с автоматическим 12-часовым циклом света/темноты. Крысы в ​​модельной группе и группе, получавшей цис-обработку, оставались в гипобарических условиях, но переводились в нормобарические условия каждые 96 часов, в это время им давали еду и воду и очищали клетки. Продолжительность перехода от гипобарического режима к гипобарическому составила около 2 часов. Все группы лечения получали соответствующий цис (8 мг/кг/день) через пероральный зонд в течение 8 недель, тогда как контрольных и модельных крыс вводили равный объем воды.

Через 8 недель крыс забивали под наркозом. Семенники, придатки яичек и семенные пузырьки отделяли и взвешивали, а органный индекс рассчитывали по следующей формуле: (вес органа/вес животного) × 100%. Впоследствии собирали сперматозоиды из придатков яичка и проверяли их подвижность и активность акросомных ферментов. Аналогичным образом собирали ткани яичек для гистопатологических исследований и определения активности АФК, ПОЛ и антиоксидантных ферментов.

ЭКСТРАКТ ЦИСТАНХА TUBULOSA ТРАВА ЦИСТАНХА ПОВЫШАЕТ СЕКСУАЛЬНУЮ СИЛУ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Оценка количества живых сперматозоидов

Придаток яичка разрезали хирургическими ножницами и готовили суспензию спермы в физиологическом растворе. Чтобы оценить количество живых сперматозоидов, 5 мкл суспензии сперматозоидов осторожно смешивали с равным объемом красителя эозина-Y. Затем сперматозоиды подсчитывали под световым микроскопом. Уровень живых сперматозоидов оценивали путем подсчета как окрашенных (мертвые сперматозоиды), так и неокрашенных сперматозоидов (живые сперматозоиды).

Определение активности ферментов акросомы сперматозоидов

Для оценки активности акросомных ферментов сперматозоидов использовали анализ активности акросомных ферментов сперматозоидов [19]. Результаты в каждой группе рассчитывали по следующей формуле: Активность фермента акросомы (мкМЕ)=(группа ODExperiment - группа ODBlank)/(247,5×10)×106.

Полученные результаты

Влияние гипоксии на клетки GC-1

Чтобы определить влияние гипоксии на половые клетки, мы сначала исследовали изменения жизнеспособности клеток после обработки гипоксией различными концентрациями кислорода (20%, 15%, 10% и 5%) в течение 1, 3, 5 и 7 дней соответственно. Результаты анализа CCK-8 показали, что по сравнению с контрольной группой (концентрация кислорода 20%) клетки, подвергшиеся гипоксии, продемонстрировали значительное снижение жизнеспособности (P <0,01; рисунок 1А). Более того, их выживаемость была обратно пропорциональна концентрации кислорода и далее снижалась со временем индукции. Чтобы избежать чрезмерного цитотоксического эффекта, в качестве критериев гипоксической модели для последующих экспериментов in vitro были выбраны 10%-ная концентрация кислорода и 3-дневное время индукции.

Впоследствии были выполнены FCM и иммунофлуоресцентное окрашивание для дальнейшей оценки изменения пролиферации клеток GC{{0}} при лечении гипоксией. Результаты показали, что гипоксия может вызвать остановку клеток GC-1 в фазе G1, тем самым уменьшая переход клеток в фазу S и ингибируя репликацию ДНК. Таким образом, гипоксия значительно снижала индекс пролиферации клеток GC-1 (P <0,01; рисунок 1Б). Положительное окрашивание Ki-67 является еще одним специфическим биомаркером пролиферирующих клеток. Поэтому мы также исследовали соотношение Ki-67-положительных клеток с лечением гипоксии или без него. По сравнению с контрольной группой лечение гипоксией значительно уменьшило Ki-67-положительные клетки, как показано на рисунке 1C.

Далее мы стремились исследовать механизм ингибирования жизнеспособности клеток GC{{0}}, вызванного гипоксией. Как сообщается в литературе, уровень АФК повышался при нахождении крыс в гипобарической гипоксической среде [8, 20]. Следовательно, уровни эндогенных АФК в клетках GC-1 измеряли с использованием анализа FCM. Результаты показали более высокие уровни АФК при гипоксии по сравнению с группой с нормальным кислородом (P <0,01; рисунок 1D). Накопленные АФК вызывают выраженное нарушение ДНК, что, в свою очередь, вызывает активацию пути клеточного апоптоза и может быть основным этиологическим фактором повышения риска мужского бесплодия [21, 22]. Затем мы обнаружили эффект апоптотической активации гипоксии на клетках GC-1 с помощью окрашивания TUNEL. Как показано на рисунке 1E, лечение гипоксией привело к увеличению флуоресценции TUNEL по сравнению с контрольной группой, что указывает на увеличение апоптоза в модельной группе.

Поскольку повреждение клеток, вызванное АФК, обычно вызывается ОС, мы дополнительно протестировали ОС клеток GC-1. Как показано на рисунке 1F, уровни ПОЛ клеток GC-1 в модельной группе были заметно повышены по сравнению с уровнями ПОЛ клеток GC-1 в контрольной группе. Эти данные позволяют предположить, что повреждение клеток GC-1, вызванное гипоксией, может быть связано с ОС, вызванной накоплением АФК.