Clec12a смягчает воспаление, ограничивая расширение колитогенного комменсала

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ

Регуляция микробиоты имеет решающее значение для здоровья кишечника, однако механизмы, используемые врожденным иммунитетом, остаются неясными. Здесь мы показываем, что у мышей с дефицитом рецептора лектина C-типа Clec12a развился тяжелый колит, который зависел от микробиоты. Исследования трансплантации фекальной микробиоты (FMT) на стерильных мышах выявили колитогенную микробиоту, образующуюся у мышей Clec12a-/-, которая была отмечена экспансией грамположительного организма, грызунов Faecalibaculum. Обработки F. Rodentium было достаточно, чтобы усугубить колит у мышей дикого типа. Макрофаги кишечника экспрессируют самые высокие уровни Clec12a. Анализ цитокинов и секвенирование макрофагов Clec12a-/- выявил усиление воспаления, но заметное снижение генов, связанных с фагоцитозом. Действительно, способность макрофагов Clec12a-/- поглощать F. Rodentium нарушена. Очищенный Clec12a имел более высокое связывание с грамположительными организмами, такими как F. Rodentium. Таким образом, наши данные идентифицируют Clec12a как механизм врожденного иммунного надзора, позволяющий контролировать распространение потенциально вредных комменсалов без явного воспаления.

Польза цистанхе для мужчин – укрепление иммунной системы

ВВЕДЕНИЕ

Состав и функции микробиоты могут оказывать глубокое влияние на здоровье и болезни млекопитающих (Fassarella et al., 2021). Это было хорошо документировано для воспалительного заболевания кишечника (ВЗК), при котором большинство мышиных моделей ВЗК чувствительны к изменениям в составе микробиоты (Gkouskou et al., 2014). Понимание факторов, которые влияют на стабильность микробиоты и определяют ее, будет иметь важное значение по мере разработки методов лечения на основе микробиоты (Sharma et al., 2020; Sorbara and Pamer, 2022). На микробиоту влияют множество параметров, включая диету, лекарства и иммунную систему. В последние годы было показано, что компоненты адаптивного иммунитета, особенно IgA, влияют на состав микробиоты (Nakajima et al., 2018; Okai et al., 2016; Yang and Palm, 2020). Однако меньше известно о том, как специфические рецепторы врожденного иммунитета влияют на состав гомеостатической микробиоты.

Генетические полиморфизмы в генах, регулирующих распознавание микробов и иммунитет слизистой оболочки, являются аллелями значительного риска для ВЗК, включая белок аутофагии ATG16L1 (Cadwell et al., 2008; Liu et al., 2015; Rioux et al., 2007; Wellcome Trust Case Control, 2007). ). В недавнем исследовании, изучающем изменения экспрессии миелоидных генов у людей с полиморфизмом ATG16L1T300A, было обнаружено, что ингибирующий рецептор лектина C-типа (CLR), Clec12a, в этих клетках значительно подавлен (Begun et al., 2015). Это же исследование продемонстрировало, что Clec12a защищает от патогенной инфекции посредством ассоциации с путем аутофагии. Эти данные позволяют предположить, что снижение регуляции Clec12a у людей с ВЗК может влиять на тяжесть и/или развитие заболевания. Несмотря на эти данные, мало что известно о механизмах иммунной регуляции, осуществляемых Clec12a во время колита.

Лектины C-типа представляют собой разнообразную группу растворимых или мембраносвязанных молекул, способных связывать липиды, белки и углеводы как хозяйского, так и микробного происхождения (Brown et al., 2018). Минкле (Clec4e) и дектин-1 (Clec7a) — два CLR, которые влияют на конкретных членов микробиоты, поддерживая гомеостаз кишечника (Илиев и др., 2012; Мартинес-Лопес и др., 2019). Однако, поскольку существует более 1000 различных лектинов C-типа, в этом семействе белков еще многое предстоит открыть. Clec12a принадлежит к семейству естественных киллерных рецепторов и является одним из двух лектинов C-типа, содержащих мотив, ингибирующий иммунный тирозин (ITIM), способный ограничивать воспалительные сигнальные пути (Brown et al., 2018; Marshall et al., 2004). . Clec12a распознает мочевую кислоту, которая является сигналом клеточного повреждения (Neumann et al., 2014). Clec12a наиболее высоко экспрессируется в клетках врожденного иммунитета, а в нейтрофилах он снижает активацию и подавляет выработку воспалительных цитокинов при распознавании мочевой кислоты (Neumann et al., 2014). И наоборот, Clec12a способствует воспалению, обеспечивая трансмиграцию мононуклеарных фагоцитов (MNP) через гематоэнцефалический барьер во время аутоиммунной модели рассеянного склероза и усиливая передачу сигналов интерферона I типа в ответ на вирусную инфекцию (Li et al., 2019; Sagar et al. ., 2017). Clec12a также способен распознавать плазмодийный продукт, гемозоин, который, как было показано, увеличивает количество CD8+ Т-клеток в головном мозге после заражения плазмодием (Raulf et al., 2019). Таким образом, Clec12a представляет собой беспорядочный CLR с разнообразными ролями в иммунитете и уникальными сигнальными способностями, однако его роль в кишечнике остается неизвестной.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Ранее мы продемонстрировали, что специфические кишечные грибы усугубляют колит, индуцируя метаболит пурина, мочевую кислоту (Chiaro et al., 2017). Более того, недавно пуриновый метаболизм был связан с кишечными заболеваниями человека (Zhu et al., 2019). В совокупности эти данные позволяют предположить, что обнаружение мочевой кислоты может иметь отношение к ВЗК. Основываясь на этом, мы решили изучить функцию Clec12a в кишечнике. Мы обнаружили, что животные с дефицитом Clec12a очень восприимчивы к колиту, что зависит от состава микробиоты, образующейся в отсутствие Clec12a. FMT микробиоты Clec12a-/- у стерильных животных WT было достаточно для обострения колита, и образование колитогенной микробиоты у Clec12a-/- животных не зависит от адаптивного иммунитета. Чтобы выявить соответствующие микробы, которые могли усугубить колит, животных с Clec12a-/- лечили различными антибиотиками, а те, которые были нацелены на грамположительные бактерии, улучшали течение заболевания. Секвенирование 16S рДНК выявило, что Faecalibaculum Rodentium значительно более распространен у Clec12a-/- животных, а пероральный прием F. Rodentium был достаточен для обострения патологии заболевания у животных WT. Иммунный профиль Clec12a-/- животных выявил заметное снижение количества гомеостатических миелоидных клеток в толстой кишке. Секвенирование РНК макрофагов, обработанных F. Rodentium, показало, что Clec12a способствует фагоцитозу. Поскольку было показано, что Clec12a связывает несколько лигандов, мы спросили, будет ли Clec12a связываться с различными представителями микробиоты. Используя слитый белок Clec12a-Fc, мы определили, что Clec12a наиболее сильно связывается с грамположительными представителями микробиоты. В совокупности эти данные предполагают модель, согласно которой Clec12a контролирует колитогенных членов микробиоты посредством прямого связывания и фагоцитоза, одновременно предотвращая воспалительные реакции. В сценариях, когда экспрессия Clec12a снижается, грамположительные патобионты могут расширяться и способствовать воспалению. Таким образом, наши исследования идентифицируют Clec12a как важный супрессор воспаления, обеспечивающий гомеостаз и поддержание здоровой микробиоты.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Животные с Clec12a-/- очень восприимчивы к колиту, независимо от адаптивной иммунной системы.

Сообщалось о снижении экспрессии Clec12a у людей с ВЗК, и мы продемонстрировали, что блокирование выработки одного из лигандов Clec12a, мочевой кислоты, может облегчить течение колита (Begun et al., 2015; Chiaro et al., 2017; Liu et al. ., 2015). Однако Clec12a еще не изучался на животных моделях колита. С этой целью мышей дикого типа и Clec12a-/- C57BL/6 заражали острым колитом DSS. Животные Clec12a-/- теряли значительно больше веса, имели более короткие ободочные кишки и имели значительное увеличение маркера воспаления LCN2 в фекалиях по сравнению с животными дикого типа, что указывает на ухудшение воспаления и заболевания (рис. 1A-C). В подтверждение этого гистологический анализ выявил повышенное повреждение эпителия, потерю крипт и приток иммунных клеток у животных Clec12a-/- по сравнению с WT (рис. 1D, E). В соответствии с результатами модели колита DSS, перенос клеток CD4+ CD45RBhi в TCRb-/-; Мыши с двойным нокаутом Clec12a-/- приводили к меньшему увеличению веса с течением времени и более коротким толстым кишкам по сравнению с Т-клетками, перенесенными мышам TCRb-/- (рис. 1F, G). В совокупности эти результаты показывают, что потеря Clec12a приводит к ухудшению кишечных заболеваний.

Сообщается, что Clec12a в основном экспрессируется в клетках врожденного иммунитета, при этом очень низкая экспрессия наблюдается в CD8+ Т-клетках. Поэтому, чтобы определить, участвует ли адаптивный иммунитет в ухудшении заболевания, наблюдаемом у животных Clec12a-/-, животных Clec12a-/- скрещивали с животными Rag-/- для удаления как Т-, так и В-клеток. Опять же, у животных Clec12a-/- заболевание развивалось хуже по сравнению с животными дикого типа, поскольку они теряли больше веса и имели более короткие кишки, чем контрольные животные дикого типа (рис. 1H, I). Аналогично, Clec12a-/-; У Rag-/- наблюдалось ухудшение кишечного заболевания по сравнению с контрольной группой Rag-/-, и они теряли столько же веса и имели более короткие ободочные кишки, чем WT и Rag-/-, как и Clec12a-/- (рис. 1H, I). Ранее мы сообщали, что пероральное лечение S. cerevisiae повышает уровень мочевой кислоты, что усугубляет колит. Однако не наблюдалось никаких различий в уровнях мочевой кислоты в сыворотке или фекалиях у животных дикого типа и Clec12a-/-, что позволяет предположить, что усиление заболевания, наблюдаемое у Clec12A-/-, не является результатом увеличения мочевой кислоты (рис. S1). Таким образом, ухудшение развития колита, наблюдаемое у Clec12a-/- животных, не зависит от адаптивной иммунной системы.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Нажмите здесь, чтобы просмотреть продукты Cistanche Enhance Immunity

【Запросить дополнительную информацию】 Электронная почта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Обострение колита у животных Clec12a-/- зависит от микробиоты.

Известно, что колит частично обусловлен изменениями в составе микробиоты (Kubinak et al., 2015; Ray and Dittel, 2015). Чтобы определить, содержат ли животные Clec12a-/- микробиоту, которая способствует обострению колита, проводили FMT от мышей дикого типа или мышей Clec12a-/- у животных дикого типа, свободных от микробов. Через четыре недели после трансплантации половина животных содержалась вместе, а другая половина оставалась отдельно. Затем в каждой группе вызывали острый колит DSS (рис. 2А). Животные, получившие Clec12a-/- FMT, и животные, содержащиеся в совместном содержании, потеряли значительно больше веса (рис. 2B) и имели значительно более короткие кишки (рис. 2C), чем животные, получившие FMT от мышей дикого типа. Кроме того, гистологический анализ выявил большее повреждение эпителия и воспалительный приток после трансплантации микробиоты Clec12a-/- (рис. 2D, E). Установленные микробные сообщества различались между группами, что было определено с помощью секвенирования гена 16S рРНК с использованием Брея-Кертиса (PERMANOVA, p=0.0001), невзвешенного (PERMANOVA, p=0.0062) и взвешенного Дистанции Unifrac (PERMANOVA, p= 0.0001). Различия внутригрупповой микробиоты были наибольшими у животных, содержащихся в совместном помещении, по тем же показателям, что указывает на приобретение микробов от каждого генотипа FMT (рис. 2 FH). Эти данные показывают, что обострение колита у Clec12a-/- животных вызвано специфическими микробами, обогащенными в отсутствие Clec12a; и эти микробы стали доминирующими факторами колитогенного фенотипа даже при наличии устоявшейся микробиоты WT.

Состав микробиоты, формирующийся у Clec12a-/- животных, не зависит от адаптивного иммунитета.

Иммунная система важна для определения состава микробиоты. Эксперимент FMT показал, что Clec12a-/- приводит к изменению состава микробиоты, что способствует ухудшению развития колита. Сначала мы хотели определить, способен ли дефицит Clec12a-/- в иммунном компартменте изменить микробиоту кишечника. С этой целью костный мозг мышей дикого типа или Clec12a-/- переносили летально облученным мышам-реципиентам WT SPF для стандартизации микробиоты с последующим 8-недельным периодом восстановления иммунитета (рис. 3А). За это время трансплантированные иммунные системы успевают развиться внутри реципиента, по-разному формируя состав микробиоты. Чтобы определить, являются ли проколитогенные изменения в микробиоте результатом этого иммунного моделирования, мы провели FMT, используя фекалии химерных мышей дикого типа или Clec12a-/- и индуцировали колит DSS (рис. 3A). Хотя существенных изменений в потере веса не произошло (рис. 3B), толстая кишка у животных, получавших FMT от химерных мышей Clec12a-/-, была значительно короче по сравнению с животными, получавшими FMT от мышей дикого типа (рис. 3C), что указывает на ухудшение заболевания. Более того, когда реципиенты WT и Clec12a-/- FMT содержались совместно, ободочная кишка была значительно короче по сравнению с животными, получавшими WT FMT (рис. 3C). Таким образом, дефицит Clec12a-/- в кроветворном компартменте приводит к формированию доминантной колитогенной микробиоты.

Для дальнейшего подтверждения того, что адаптивная иммунная система необходима для формирования колитогенной микробиоты у животных Clec12a-/-, мы провели FMT с использованием фекалий Rag-/- или Rag-/-; Clec12a-/- -, как описано ранее. Животные, получившие Rag-/-; Clec12a-/- FMT потеряли больше веса и имели значительно более короткие ободочные кишки, чем животные, получившие FMT от Rag-/- животных, более того, у животных, содержащихся в совместном содержании, также наблюдалось ухудшение заболевания (рис. 3D, E). Эти данные демонстрируют, что дефицита Clec12a во врожденной иммунной системе достаточно, чтобы привести к образованию микробиоты, способной усугубить колит.

Clec12a подавляет размножение Faecalibaculum Rodentium.

Мы использовали ряд различных антибиотиков для идентификации соответствующих организмов, вызывающих заболевания у животных Clec12a-/-. Во-первых, лечение мощным коктейлем антибиотиков широкого спектра действия, включающим эритромицин, ампициллин, неомицин и гентамицин, значительно снижало тяжесть заболевания как у Clec12a-/-, так и у животных WT, что позволяет предположить, что бактериальная популяция микробиоты имеет отношение к заболеванию ( Рисунок 4А; Рисунок S2). Затем мы еще больше сузили круг бактериальных популяций, наиболее значимых для заболевания, используя различные антибиотики, воздействующие на уникальные таксоны бактерий. В частности, мы выбрали гентамицин, аминогликозид, нацеленный на грамотрицательные бактерии, и цефалотин, цефалоспорин, который в первую очередь нацелен на грамположительные бактерии. Эти препараты вводили животным Clec12a-/- во время колита DSS. Хотя лечение гентамицином не повлияло на тяжесть заболевания, животные, получавшие цефалотин, сохраняли свой вес и имели значительно более длинные ободочные кишки, чем животные, получавшие ложное лечение (рис. 4B, C), что указывает на то, что грамположительные организмы, находящиеся в микробиоте Clec12a-/-, играют роль важную роль в обострении патологии заболевания.

Затем мы выполнили секвенирование гена 16S рРНК фекалий SPF WT и Clec12a-/- для определения изменений состава микробиоты. Животные WT и Clec12a-/- группировались значительно по-разному как по нефилогенетическим, так и по филогенетическим показателям, взвешенным по численности, Брею-Кертиса и взвешенному UniFrac соответственно (рис. S3A-C). Показатели альфа-разнообразия не выявили существенных различий в богатстве (наблюдаемых особенностях), что указывает на то, что Clec12a-/- не содержит большего количества видов (рис. 4D). Однако индексы равномерности и разнообразия Шеннона были увеличены в отсутствие Clec12a, что указывает на то, что пропорциональное распределение бактерий у мышей Clec12a-/- было изменено (рис. 4E, F), что еще раз подтверждает, что Clec12a важен для регуляции структуры микробиоты в кишечнике.

Анализ состава микробиомов (ANCOM) показал, что среди ASV (вариантов последовательностей ампликонов), которые по-разному распространены, ASV, классифицированный в роде Faecalibaculum (семейство Erysipelotrichaceae), был значительно расширен в фекалиях Clec12a-/- по сравнению с WT (рис. 4Г, З). Использование BLAST репрезентативной последовательности ASV из нашего анализа показало 100% идентичность последовательностям бактерий Faecalibaculum Rodentium. Эти данные доказывают, что грамположительные бактерии у животных Clec12a-/- ответственны за колитогенный фенотип и, в частности, указывают на участие грамположительного организма F. Rodentium в обострении заболевания.

Основываясь на этом, мы проверили гипотезу о том, что F. Rodentium может усугублять колит. Мы предварительно вводили животным WT SPF 1 x 108 КОЕ живого или фиксированного F. Rodentium перорально через зонд и продолжали лечение каждый день во время острой модели DSS, чтобы гарантировать высокие уровни колонизации F. Rodentium. Животные, которые получали как живой, так и фиксированный F. Rodentium, теряли больше веса и имели значительно более короткие кишки, чем животные, получавшие носитель (рис. 4I, J), что указывает на то, что повышенные уровни F. Rodentium могут ухудшить заболевание.

Clec12a ограничивает воспалительную реакцию макрофагов, одновременно усиливая фагоцитоз.

Чтобы определить клеточную экспрессию Clec12a при отсутствии заболевания, мы профилировали клетки врожденного и адаптивного иммунитета в собственной пластинке пластинки (LP) с помощью многоцветной проточной цитометрии. В соответствии с предыдущими сообщениями, Clec12a преимущественно ограничен миелоидным клоном и практически не экспрессируется на лимфоцитах (Figure 5A) (Han et al., 2004; Pyz et al., 2008; Sobanov et al., 2001). Кишечные нейтрофилы, макрофаги и дендритные клетки демонстрировали одинаковые уровни экспрессии Clec12a (рис. S4A), в то время как макрофаги имели наибольший процент клеток в ткани кишечника, экспрессирующих Clec12a (рис. 5A). Учитывая двойную роль макрофагов: стимулировать воспаление посредством классической активации, а также инициировать репаративные механизмы в ответ на повреждение тканей, мы задались вопросом, как Clec12a может влиять на эту дихотомию во время колита. Хотя макрофаги весьма разнообразны, их можно разделить на воспалительные макрофаги М1 и репаративные макрофаги М2 по экспрессии CD38 и EGR2 соответственно. Мы показываем, что у животных с Clec12a-/- наблюдается увеличение количества макрофагов M1 и снижение количества макрофагов M2 в толстой кишке LP во время колита (рис. 5 B, C, рис. S4B). Эти данные показывают, что Clec12a регулирует реакцию макрофагов в кишечнике.

Чтобы лучше понять, как Clec12a влияет на биологию макрофагов в ответ на микробные лиганды, макрофаги костномозгового происхождения (BMDM), выделенные от животных дикого типа или Clec12a-/-, обрабатывали различными распространенными микробными лигандами, включая LPS, Pam3CysK и флагеллин. На всех этих образцах был проведен цитокиновый анализ. Многие из протестированных цитокинов не индуцировались в этих условиях, однако MCP-1, IL-27, IFN-b, TNF-a и IL-6 последовательно обнаруживались в этих культурах ( Рисунок 5D). Clec12a-/- BMDM имели значительно более высокую экспрессию этих цитокинов в ответ на многие микробные лиганды, а наибольшие дифференциальные ответы наблюдались в ответ на агонист TLR2 Pam3CysK. Эти данные согласуются с известной ролью Clec12a в смягчении воспалительных реакций во время стерильного воспаления (Neumann et al., 2014).

растение цистанхе, повышающее иммунную систему

РНК-секвенирование проводили на BMDM из WT или Clec12a-/-, обработанных F. родентиум, чтобы определить, как Clec12a регулирует ответы этих клеток на этот конкретный бактериальный организм. Мы оценили дифференциальный ответ, сравнив Clec12a-/- BMDM, подвергшиеся воздействию F. Rodentium, с контролем транспортного средства, с ответом BMDM дикого типа. Анализ обогащения дифференциально экспрессируемых генов показал, что макрофаги с дефицитом Clec12a имели значительное увеличение количества генов, участвующих в контроле клеточного цикла, при заражении F. Rodentium (рис. S5A). Клеточный цикл неразрывно связан с фагоцитозом, также наблюдалось значительное снижение генов, связанных с фагоцитозом и воспалительной реакцией (рис. 5E) (Luo et al., 2005). В соответствии с недавним исследованием Clec12a и Salmonella, эти данные позволяют предположить, что фагоцитоз является дефектным в отсутствие Clec12a в ответ на нормального резидента кишечника F. Rodentium (Begun et al., 2015). Чтобы проверить это, перитонеальные макрофаги собирали у животных дикого типа и Clec12a-/- и культивировали совместно с F. Rodentium, меченным Sybr®-зеленым. Макрофаги Clec12a-/- содержали значительно меньше микробов на клетку (рис. 5F, G; рис. S5B), что указывает на то, что дефицит Clec12a приводит к поглощению меньшего количества организмов и согласуется со снижением фагоцитоза в наборе данных RNA-seq. В совокупности эти данные показывают, что Clec12a играет двойную роль: смягчает явные воспалительные реакции на распространенные микробные лиганды и одновременно способствует поглощению бактерий макрофагами.

Clec12a преимущественно связывается с грамположительными комменсалами.

Поскольку фагоцитоз инициируется связыванием микробов с последующей интернализацией и уничтожением, мы предположили, что Clec12a способен связываться со специфическими представителями микробиоты, такими как F. Rodentium. Чтобы учесть эту возможность, был создан гибридный белок, содержащий внеклеточный связывающий домен мышиного Clec12a и Fc-часть человеческого IgG1 (Clec12a-Fc) (рис. 6A) (Maglinao et al., 2014; Neumann et al., 2014; Raulf). и др., 2019). Белок был очищен и проверен на связывание с группой разнообразных грамположительных и грамотрицательных бактерий, которые, как известно, присутствуют в гомеостатическом кишечнике, включая F. Rodentium, Roseburia spp., Bifidobacteria Animalis, Akkermansia Muciniphila, Bacteriodes Uniformis, и грибок-комменсал Candida albicans, методом проточной цитометрии. Salmonella enterica также была включена, поскольку предыдущие исследования показали, что Clec12a может ассоциироваться с проникновением S. enterica в клетку (Begun et al., 2015). Clec12a в различной степени связывается с несколькими филогенетически различными бактериями, включая F. Rodentium, но не с грибами C. albicans (рис. 6B). Clec12a наиболее сильно связывался с грамположительными организмами F. Rodentium и представителем семейства Lachnospiraceae Roseburia sp. и меньше всего взаимодействовал с B. Animalis, B. Uniformis и S. Enterica (рис. 6B), что указывает на то, что Clec12a может связываются с конкретными представителями микробиоты, отдавая предпочтение грамположительным организмам. В совокупности наши данные идентифицируют Clec12a как механизм, используемый иммунной системой для исследования микробного сообщества кишечника и сокращения микробиоты посредством прямого связывания и фагоцитоза, одновременно предотвращая явные воспалительные реакции на большое количество грамположительных микробов, что имеет решающее значение для поддержания здоровья кишечника.

ОБСУЖДЕНИЕ

Гомеостаз в кишечнике требует механизмов, ограничивающих количество комменсальных микробов, не инициируя повреждающее воспаление (Macpherson et al., 2000). IgA в последние годы стал одним из важнейших способов, с помощью которых иммунитет кишечника может контролировать микробиоту (Pabst and Slack, 2020). Действительно, IgA способен напрямую связываться с микробами и/или продуктами их жизнедеятельности и выводить их из кишечника без индукции типичного воспаления. Другие иммунные молекулы, обладающие этими двойными свойствами, на сегодняшний день не изучены. Лектины C-типа включают разнообразный класс белков, которые могут распознавать различные молекулы белков, углеводов и липидов из микробных продуктов и продуктов хозяина (Brown et al., 2018; Drouin et al., 2020). Однако лишь немногие из них были изучены в контексте кишечного иммунитета и микробиоты (Илиев и др., 2012; Мартинес-Лопес и др., 2019). Таким образом, насколько нам известно, это первая демонстрация того, что дефицит Clec12a изменяет состав микробиоты, что определяет тяжесть заболевания.

Преимущества цистанхе – укрепляют иммунную систему

Clec12a в основном изучался в контексте распознавания мононатрийурата (MSU) или мочевой кислоты, что часто является признаком клеточной смерти (Kono et al., 2010; Neumann et al., 2014). Мочевая кислота способна активировать воспалительные реакции через инфламмасому NLRP3, поэтому для предотвращения разрушения тканей во время гибели клеток необходимо контролировать это воспаление (Martinon et al., 2006). Было показано, что Clec12a уравновешивает эту воспалительную реакцию посредством подавления передачи сигналов Syk (Marshall et al., 2004). В соответствии с этим, делеция Clec12a в модели стерильного воспаления и аутовоспалительной модели артрита вызывает усиленную активацию нейтрофилов и ухудшение заболевания, что делает Clec12a важным тормозом воспаления (Redelinghuys et al., 2016). Однако совсем недавно было также продемонстрировано, что Clec12a усиливает передачу сигналов интерферона I типа в ответ на вирусную инфекцию и опосредует захват сальмонеллы через путь антибактериальной аутофагии (Begun et al., 2015; Li et al., 2019). Это демонстрирует, что Clec12a не ограничивает воспаление, а может играть различные роли в зависимости от контекста. Кишечник отличается тем, что даже при отсутствии заболевания в нем находится большое количество иммунных клеток. Это связано с наличием микробиоты, которая играет важную роль в управлении иммунным развитием и предотвращении колонизации патогенных организмов. Микробиота обладает теми же поверхностными структурами, которые обнаруживаются TLR, которые также распознают патогены, и поэтому иммунная система кишечника должна иметь строгие регуляторные механизмы, чтобы сдерживать воспаление от этих чужеродных организмов (Blander et al., 2017).

Первоначально мы заинтересовались Clec12a, потому что обнаружили, что кишечные грибы Saccharomyces cerevisiae индуцируют мочевую кислоту, усугубляющую колит (Chiaro et al., 2017). Более того, другие исследования показали, что микробиота может влиять на кишечные заболевания посредством индукции пуринового метаболизма, конечным продуктом которого у млекопитающих является мочевая кислота (Zhu et al., 2019). Эти данные позволяют предположить, что механизмы восприятия мочевой кислоты, такие как Clec12a, могут влиять на гомеостаз кишечника. Однако мы не наблюдали никаких изменений в уровнях мочевой кислоты в сыворотке или кале, что указывает на то, что усиление тяжести заболевания у Clec12a-/- животных не было вызвано увеличением мочевой кислоты. Однако повышенная тяжесть колита у Clec12a-/- обусловлена ​​составом микробиоты. Таким образом, согласно нашим данным, снижение экспрессии Clec12a-/- может влиять на состав микробиоты у пациентов с ВЗК (Jason L. Kubinak, 2015; Rehman et al., 2011; Vijay Kumar et al., 2010). Интересно, что мы обнаружили, что антибиотики, нацеленные на грамположительные организмы, способны снижать тяжесть колита у Clec12a-/- животных. Это контрастирует с несколькими сообщениями, в которых было выявлено увеличение количества грамотрицательных энтеробактерий во время воспаления кишечника, поэтому это одно из немногих исследований, в которых было выявлено увеличение количества грамположительных микроорганизмов, связанных с развитием колита. Хотя, вероятно, это не единственный организм, влияющий на тяжесть колита в этой модели, у Clec12a-/- животных наблюдалось резкое распространение F. Rodentium. F. Rodentium является грамположительным, оксидазным и каталазоотрицательным представителем типа Firmicutes (Bacillota) (Chang et al., 2015). Ежедневное введение F.rodentium даже мышам дикого типа усиливает колит, подтверждая, что повышенные уровни F.rodentium в кишечнике вредны и, вероятно, приводят к серьезности колита у Clec12a-/-. Недавний отчет продемонстрировал, что F.rodentium может увеличивать обновление эпителия и подавлять экспрессию ферментов внутри эпителия, которые подавляют воспалительные реакции, и, таким образом, это соответствует ухудшению заболевания, которое мы наблюдаем, когда F.rodentium разрастается в кишечнике (Cao et al., 2022). Поскольку люди колонизированы организмом, похожим на F. Rodentium (Zagato et al., 2020), дальнейшие исследования должны выяснить влияние этих F. родентиоподобных бактерий на аспекты физиологии человека, связанные с колитом.

Подтверждая роль Clec12a среди клеток врожденного иммунитета, мы заметили, что колитогенная микробиота все еще формируется у Clec12a-/- животных, у которых отсутствует адаптивная иммунная система. Самый высокий процент клеток в кишечнике, экспрессирующих Clec12a, приходится на макрофаги, что побудило нас сосредоточиться на функции Clec12a в этих клетках. Предыдущие исследования показали, что Clec12a является важным медиатором продукции интерферона I типа в ответ на вирусную инфекцию (Li et al., 2019). Однако то, как Clec12a влияет на реакцию на широкий спектр бактериальных лигандов, не изучено; это очень актуально для кишечника, где существует большое количество лигандов TLR. Здесь мы показываем, что Clec12a служит для смягчения макрофагальных реакций в кишечнике и, вероятно, обеспечивает гомеостаз в ответ на микробиоту. Секвенирование РНК макрофагов, инкубированных с F. Rodentium, показало, что дефицит Clec12a приводит к дефектам клеточного цикла и фагоцитоза в ответ на эти комменсальные бактерии. Недавнее исследование показало, что макрофаги Clec12a-/- снижают аутофагию в ответ на сальмонеллу (Begun et al., 2015). Наши данные дополняют и расширяют эти результаты, включив в них то, что Clec12a также контролирует неинвазивные комменсальные организмы. Другие показали, что F. Rodentium влияет на биологию эпителия, что предполагает, что F. Rodentium находится в непосредственной близости от хозяина и, следовательно, должен строго контролироваться иммунной системой. Наши данные подтверждают, что Clec12a контролирует F. Rodentium посредством регуляции фагоцитоза. Фагоцитоз инициируется физическим связыванием лиганда или микроба, а лектины C-типа могут связываться с несколькими лигандами, что побудило нас проверить, может ли Clec12a напрямую связываться с кишечными бактериями. Интересно, что Clec12a наиболее сильно связывается с грамположительными организмами F.rodentium и Roseburia и гораздо меньше с грамотрицательными организмами A.muciniphila и B.uniformis, но совсем не с C.albicans. Эти данные показывают, что Clec12a имеет склонность связывать определенных членов микробиоты. Это позволяет нам построить модель, согласно которой вовлечение Clec12a и последующий фагоцитоз могут контролировать определенных членов микробиоты и предотвращать потенциально вредные последствия их экспансии. Это подчеркивает двойную функцию Clec12a, которая может сдерживать воспаление против микробных лигандов, а также распознавать и контролировать конкретных членов микробиоты. Таким образом, Clec12a представляет собой уникальный способ, который врожденная иммунная система использует для обеспечения гомеостаза в желудочно-кишечном тракте.

РИСУНКИ ЛЕГЕНДЫ

Рисунок 1. Clec12a сдерживает кишечные заболевания независимо от адаптивной иммунной системы.

(A) Для оценки тяжести колита мышам дикого типа или Clec12a-/- C57BL/6, свободным от специфических патогенов (SPF), вводили 2,5% декстрансульфат натрия (DSS) без ограничений в течение 7 дней в питьевой воде. Процент потери веса оценивали ежедневно. Среднее значение +/- SEM, данные объединены из трех независимых экспериментов с использованием двустороннего дисперсионного анализа и критерия множественного сравнения Сидака.

(B) Длину толстой кишки (см) указанных животных измеряли при умерщвлении. Диаграмма рассеяния представляет собой среднее значение +/- SEM, данные объединены из трех независимых экспериментов с использованием непарного t-критерия. Каждая точка представляет одну мышь

(C) Фекальный липокалин-2 (нг/мл) указанных животных измеряли как показатель воспаления. Гистограмма представляет собой среднее значение +/- SEM, данные объединены из двух независимых экспериментов с использованием непарного t-критерия. Каждая точка представляет одну мышь

(D) Репрезентативные окрашенные H&E срезы толстой кишки указанных животных после колита, вызванного DSS.

(E) Гистологические оценки для указанных животных были получены из срезов толстой кишки в

(Д). Гистограмма представляет собой среднее значение +/- SEM, сравниваемое с использованием непарного t-критерия. Каждая точка представляет одну мышь.

(F) Для оценки хронического колита была использована модель колита с переносом Т-клеток. Вес животных TCRb-/- и Clec12a-/-;TCRb-/- измеряли еженедельно. На графике изображен процент потери веса указанных животных на протяжении всего эксперимента. Среднее значение +/- SEM по сравнению с 2-способом ANOVA.

(G) Длина колонии указанных животных из (I) измерялась при умерщвлении. Гистограмма представляет собой среднее значение +/- SEM, сравниваемое с использованием непарного t-критерия. Каждая точка представляет одну мышь.

(H) Мышей дикого типа, Clec12a-/-, Rag-/- или Rag-/-;Clec12a-/- C57BL/6 SPF оценивали на наличие острого колита. Указанным животным давали 2,5% DSS без ограничений в течение 7 дней. Процент потери веса оценивали ежедневно. Среднее значение +/- стандартная ошибка среднего, данные репрезентативны для двух независимых экспериментов. Двусторонний дисперсионный анализ и критерий множественного сравнения Сидака.

(I) Длину толстой кишки (см) указанных животных измеряли при умерщвлении. Гистограмма представляет собой среднее значение +/- SEM, данные репрезентативны для двух независимых экспериментов с использованием непарных t-тестов. Каждая точка представляет одну мышь * p < 0.05; ** р < 0.01; *** р < 0,001; **** р < 0,0001

Рисунок 2. Микробиота, образующаяся у животных Clec12a-/-, вызывает обострение колита.

А) Трансплантацию фекальной микробиоты (FMT) осуществляли путем переноса супернатантов фекалий от животных дикого типа или Clec12a стерильным мышам дикого типа. Микробиоте давали возможность гомогенизироваться в течение четырех недель, после чего половину мышей WTFMT и половину мышей Clec12a-/-FMT содержали вместе и давали возможность смешиваться еще четыре недели. Затем все группы получали 2,5% DSS ad libitum с питьевой водой и были умерщвлены на 7-й день.

Б) Процент потери веса указанных животных оценивали ежедневно. На графике показано среднее значение +/- SEM, данные объединены из двух независимых экспериментов с использованием двустороннего дисперсионного анализа и теста множественного сравнения Сидака.

В) Длину толстой кишки (см) указанных животных измеряли при умерщвлении. Диаграмма рассеяния представляет собой среднее значение +/- SEM, сравниваемое с использованием обычного однофакторного дисперсионного анализа и критерия множественных сравнений Даннетта. Каждая точка представляет одну мышь.

D) Репрезентативные окрашенные H&E срезы толстой кишки указанных животных после FMT и колита, вызванного DSS.

E) Гистологические оценки были получены из срезов толстой кишки в (D). Гистограмма представляет собой среднее значение +/- SEM, сравниваемое с использованием непарного t-критерия. Каждая точка представляет одну мышь.

F) Взвешенные расстояния Unifrac от секвенирования гена 16S рРНК WTFMT, Clec12a-/- FMT или животных, содержащихся в совместном содержании. Диаграммы «ящик и усы», показывающие все точки (попарное сравнение расстояний) и сравниваемые с использованием теста Крускала-Уоллиса.

G) Невзвешенные расстояния Unifrac от секвенирования гена 16S рРНК WTFMT, Clec12a-/- FMT или животных, содержащихся в совместном содержании. Диаграммы «ящик и усы», показывающие все точки (попарное сравнение расстояний) и сравниваемые с использованием теста Крускала-Уоллиса.

H) Расстояние Брея-Кертиса от секвенирования гена 16S рРНК WTFMT, Clec12a-/- FMT или животных, содержащихся в совместном содержании. Диаграммы «ящик и усы», показывающие все точки (попарное сравнение расстояний) и сравниваемые с использованием теста Крускала-Уоллиса.

Рисунок 3: Состав микробиоты, формирующийся у животных Clec12a-/-, не зависит от адаптивного иммунитета.

А) Схематическая диаграмма, показывающая восстановление костного мозга с последующей ТФМ. Мышей C57Bl/6 дикого типа подвергали летальному облучению и восстанавливали костным мозгом либо дикого типа, либо Clec12a-/-. Через 8 недель у этих мышей брали фекалии и переносили мышам дикого типа, свободным от микробов, как описано в (А). Первоначально восстановленным химерным животным затем давали 2,5% DSS без ограничений в питьевой воде.

B) Процент потери веса мышей FMT из (F) оценивали ежедневно. Среднее значение +/- SEM, с использованием двустороннего дисперсионного анализа и теста множественного сравнения Тьюки.

В) Длину толстой кишки (см) указанных животных измеряли при умерщвлении. Диаграмма рассеяния представляет собой среднее значение +/- SEM, непарный t-критерий. Каждая точка представляет одну мышь

D) ТФМ для оценки роли адаптивной иммунной системы в формировании микробов и тяжести колита проводили путем переноса фекальных супернатантов из Rag-/- или Rag-/-; Clec12a-/- SPF животных в стерильных мышах дикого типа, как описано в (А). Мышей обрабатывали 2,5% DSS в течение 7 дней. Процент потери веса оценивали ежедневно. График представляет собой среднее значение +/- SEM, полученное с использованием двустороннего дисперсионного анализа и теста множественного сравнения Тьюки.

E) Длина толстой кишки (см) животных, указанных на (F), измерялась при умерщвлении. Среднее значение +/-, SEM сравнивалось с использованием обычного однофакторного дисперсионного анализа и критерия множественного сравнения Даннета. Каждая точка представляет одну мышь. * p < 0.05; ** р < 0.01; *** р < 0,001; **** р < 0,0001

Рисунок 4. Clec12a ограничивает распространение грызунов Faecalibaculum, микроба, который усугубляет колит.

А) Мышам дикого типа или Clec12a-/- C57BL/6 SPF давали смесь антибиотиков (А) (неомицин, гентамицин, ампициллин, эритромицин), цефалотин или гентамицин (В, С) в концентрации 0. 5 г/л в течение четырнадцати дней. Через семь дней животным вводили 2,5% DSS в питьевую воду до умерщвления. Длину толстой кишки (см) указанных животных измеряли при умерщвлении. Диаграмма рассеяния представляет собой среднее значение +/- SEM, непарный t-критерий. Каждая точка представляет одну мышь.

Б) Процент потери веса указанных животных оценивали ежедневно. График представляет собой среднее значение +/- SEM с использованием двустороннего дисперсионного анализа и критерия множественного сравнения Тьюки.

C) Длина толстой кишки (см) указанных животных, измеренная при умерщвлении. Диаграмма рассеяния представляет собой среднее значение +/- SEM, непарный t-критерий. Каждая точка представляет одну мышь.

D) Наблюдаемые особенности альфа-разнообразия WT или Clec12a-/- фекалий, секвенирования 16S рРНК. Среднее значение +/- SEM, сравнение с использованием критерия Манна-Уитни.

E) Равномерность по Пиелоу из фекалий WT или Clec12a-/-, альфа-разнообразие секвенирования 16S рРНК. Среднее значение +/- SEM, сравнение с использованием критерия Манна-Уитни.

F) Среднее значение энтропии Шеннона +/- SEM, сравнение с использованием критерия Манна-Уитни.

G) Анализ ANCOM фекалий WT и Clec12a-/-. Таксономические названия являются лучшими классификациями ASV с использованием базы данных таксономии генома (GTDB).

H) Относительная численность ASV Faecalibaculum Rodentium. По сравнению с использованием Манна Уитни * p < {{0}}.05; ** р < 0.01; *** р < 0,001; **** р < 0,0001

I) Мышам C57Bl/6 WT SPF предварительно вводили 1×108 КОЕ F.rodentium перорально через зонд в течение трех дней. Затем животные получали 2,5% DSS с питьевой водой в течение 7 дней, продолжая при этом ежедневно получать через зонд F.rodentium. Процент потери веса оценивали ежедневно. Среднее значение +/- SEM. Данные объединены из четырех отдельных экспериментов с использованием двустороннего дисперсионного анализа и теста множественного сравнения Тьюки.

J) Длину толстой кишки (см) указанных животных измеряли при умерщвлении. Гистограмма представляет собой среднее значение +/- SEM. Данные объединены из четырех отдельных экспериментов и сравниваются с использованием обычного однофакторного дисперсионного анализа с тестом множественной коррекции Даннета. Каждая точка представляет одну мышь. * p < 0.05; ** р < 0.01; *** р < 0,001; **** р < 0,0001

Рисунок 5. Clec12a ограничивает воспаление и способствует фагоцитозу макрофагов.

А) Иммунофенотипирование проводили с помощью проточной цитометрии на клетках, выделенных из собственной пластинки толстой кишки (cLP) у животных дикого типа и Clec12a-/-. Тепловая карта показывает частоту экспрессии Clec12a на клетках врожденного и адаптивного иммунитета.

Б) Гистограмма показывает частоту пре-гейтных клеток CD38+ (макрофагов М1) из cLP указанных животных. Среднее значение +/- SEM, сравнение с использованием непарного t-критерия. Каждая точка представляет одну мышь.

C) Гистограмма показывает частоту пре-воротных клеток EGR2+ (макрофагов M2) из ​​cLP указанных животных. Среднее значение +/- SEM, сравнение с использованием непарного t-критерия. Каждая точка представляет одну мышь.

D) BMDM собирали из длинных костей WT и Clec12a-/- и культивировали в присутствии M-CSF (20 нг/мл) в течение 7 дней. На 8-й день BMDM вводили ЛПС (100 нг/мл), MDP (10 мг/мл), Pam3cysk (1 мг/мл) или флагеллин (1 мг/мл) в течение 24 часов. Среду собирали и анализировали на выработку цитокинов. Тепловая карта показывает лог2-кратное изменение указанных цитокинов из Clec12a-/- по сравнению с WT.

E) BMDM мышей дикого типа и Clec12a-/- выделяли и культивировали, как описано в (A), а затем совместно культивировали с F. Rodentium при MOI 10 в течение 24 часов. После промывки BMDM собирали РНК и готовили ее к секвенированию. Топ-10 упрощенных категорий терминов GO (биологический процесс), обогащенных Clec12a-/- с пониженным уровнем регулирования

F) Перитонеальные макрофаги выделяли из мышей WT и Clec12a-/- и затем совместно культивировали с окрашенными зеленым Sybr F. Rodentium для оценки фагоцитоза. Слева: макрофаги WT. Справа: макрофаги Clec12a-/-. Представлены репрезентативные изображения светлого поля (левые столбцы), флуоресценции (средние столбцы) и объединенных (правые столбцы). Желтые стрелки обозначают примеры клеток F. Rodentium, поглощенных макрофагами. масштабная линейка=20 мкм. Изображения представляют два отдельных эксперимента.

G) Гистограмма показывает количество организмов на клетку, как показано на (F). 250 клеток дикого типа и 269 клеток Clec12a-/- подсчитывали для количественного определения количества F. Rodentium на клетку.

Рисунок 6: Clec12a напрямую связывается с конкретными представителями микробиоты.

А) Схематическая диаграмма, изображающая слитый белок Clec12a-человеческий IgG1-Fc или пустой вектор (только часть Fc). Б) Гистограммы проточного цитометрического анализа, показывающие дифференциальное связывание Clec12a-Fc с различными бактериями или C. albicans.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ НА РИСУНКАХ

Дополнительный рисунок 1. Отсутствие Clec12a не нарушает уровень мочевой кислоты.

А) Мочевую кислоту в сыворотке (мкМ) указанных животных измеряли для оценки пуринового метаболизма между мышами дикого типа и Clec12a-/- C57Bl/6. Диаграмма рассеяния представляет собой среднее значение +/- SEM, данные объединены из трех независимых экспериментов с использованием непарного t-критерия. Каждая точка представляет одну мышь.

B) Мочевую кислоту в фекалиях (мкМ) указанных животных измеряли для оценки кишечной экскреции мочевой кислоты между мышами дикого типа и Clec12a-/- C57Bl/6. Диаграмма рассеяния представляет собой среднее значение +/- SEM, данные объединены из трех независимых экспериментов с использованием непарного t-критерия. Каждая точка представляет одну мышь.

Дополнительный рисунок 2. Микробиота WT и Clec12a-/- вызывает дифференциальное заболевание.

Процент потери веса у животных дикого типа и Clec12a-/-, получавших смесь антибиотиков, состоящую из неомицина, гентамицина, ампициллина и эритромицина.

Дополнительный рисунок 3. На состав микробиоты влияет Clec12a.

А) Графики PCoA первых трех осей, основанные на расстояниях Брея-Кертиса, показывающие общие взаимоотношения микробиоты, и соответствующие диаграммы прямоугольника и усов, количественно определяющие различия внутри каждой группы, и сравниваемые с тестом Манна-Уитни.

B) Графики PCoA, основанные на взвешенных расстояниях Unifrac и соответствующих диаграммах прямоугольника и усов, количественно определяющих различия внутри группы по сравнению с использованием непарного критерия Манна-Уитни.

C) Таблица, показывающая результаты теста PERMANOVA для WT по сравнению с фекальной микробиотой Clec12a-/- с использованием Брея-Кертиса и взвешенными расстояниями Unifrac.

Дополнительная фигура 4: Clec12a в макрофагах ограничивает воспаление.

А) Графики скрипки отображают среднюю геометрическую интенсивность флуоресценции (MFI) иммунных клеток, показанную на (А). Среднее значение +/- SEM, критерий Крускала-Уоллиса с поправкой Данна для множественных сравнений. Буквы обозначают группы, существенно отличающиеся друг от друга.

B) Репрезентативные графики проточной цитометрии макрофагов M1 и M2 из cLP мышей WT или Clec12a-/- после колита DSS. Клетки предварительно подвергаются воздействию живых CD45+, Ly6C-, CD11b+, MHCII+ и CD64+. Из рисунка 5А.

Дополнительная фигура 5. Clec12a стабилизирует контроль клеточного цикла и регулирует фагоцитоз в макрофагах.

А) Топ-10 упрощенных категорий терминов GO (биологический процесс), обогащенных генами с повышенной регуляцией Clec12a-/- по сравнению с WT в ответ на F. Rodentium. BMDM от мышей дикого типа и Clec12a-/-, совместно культивированных с F. Rodentium, выделяли и анализировали, как показано на рисунке 7А.

B) Peritoneal macrophages were prepared as described and co-cultured with Sybr®-green stained F. rodentium. Bacteria cells were counted inside macrophages. >Подсчитали 200 макрофагов. Гистограмма показывает среднее количество F. Rodentium в 4 отдельных лунках, чтобы продемонстрировать единообразие подсчета и эффекта во всех лунках. Среднее значение +/- SEM по сравнению с использованием непарного t-критерия.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы хотели бы поблагодарить Гордона Брауна за предоставление животных Clec12a-/- для этого проекта. Эта работа была поддержана Фондом Хелен Хэй Уитни (KSO), учебным грантом NRSA по микробному патогенезу T32 Университета Юты (KSO), премией CCFA за старшие исследования (JLR), NIDDK R01DK124336, NIDDK R01124317 и NCCAM R01AT011423 (JLR), Эдвардом Маллинкродтом. Jr. Foundation (JLR), награда NSF CAREER (IOS-1253278) (JLR), стипендия Паккарда в области науки и техники (JLR), премия Берроуза «Добро пожаловать исследователю патогенеза» (JLR), Американский фонд астмы (JLR), Марголис (JLR), грант Центра общества рассеянного склероза (JLR) и премию NIH New Innovator Award DP2GM111099-01 (RMO), NHLBI R00HL102228-05 ( RMO), грант Американского онкологического общества на исследования (RMO), стипендиальную премию Киммеля (RMO), R01AG047956 (RMO) и NIAID R01AI141202 (ASI). Эта работа была поддержана Центром проточной цитометрии Университета Юты, а также Национальным институтом рака в рамках премии номер 5P30CA042014-24. Мы с благодарностью признательны за поддержку и ресурсы Центра высокопроизводительных вычислений Университета Юты.

АВТОРСКИЕ ВЗНОСЫ

TRC помогла задумать исследование, провела большую часть экспериментов на мышах и иммунологии, свела данные в цифры и помогла написать рукопись. РБ проводил эксперименты по защите от микробов и содержал всех животных, свободных от микробов. ESV помог в иммунологических экспериментах с собственной пластинкой кишечника. KSO помогла с добычей мышей, дала понимание и направление. KMB помог с сбором мышей и проточной цитометрией. MCN помог с добычей мышей. WV оказал помощь в создании конструкции слитого белка и его очистке. TJ оказал помощь с анализами фагоцитоза. JH проанализировал слайды микроскопии фагоцитоза. MH оказал помощь в очистке и использовании гибридного белка. КАК предоставляет бактериальные изоляты. ROC предоставил экспертные знания и знания в области иммунологии. WZS помог задумать исследование, провел биоинформатический анализ, помог с подготовкой цифр и статистикой, а также помог написать рукопись. JLR помог задумать и направить исследование, курировал дизайн и результаты эксперимента, организовал сотрудников и реагенты, получил финансирование для исследования и помог написать рукопись.

МЕТОДЫ

Мышиные штаммы

Все использованные здесь мышиные линии находились на фоне C57BL/6. Мыши Clec12a-/- были любезно предоставлены Гордоном Брауном (Центр медицинской микологии Совета медицинских исследований, Университет Эксетера) и были генотипированы в соответствии с ранее описанным протоколом (Redelinghuys, et al. 2016). Rag2-/- и TCRb-/- (Jackson Laboratories, 002118) были получены от Jackson Laboratories и поддерживались в нашей колонии мышей в течение нескольких поколений. Для всех экспериментов с колитом in vivo использовали мышей соответствующего пола в возрасте от 8 до 12-недель. Использовали как самцов, так и самок мышей. Мышей содержали в особых условиях, свободных от патогенов.

Бактериальные и грибковые штаммы

Следующие организмы были приобретены из DSMZ-Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур GmbH: Faecalibaculum Rodentium (DSM#103405); Akkermansia mucinophilia DSMZ (DSM#26127); Бифидобактерия животных ДСМЗ (DSM#26074). Bacteroides униформис был получен из Американской коллекции типовых культур (ATCC® 8492™). Roseburia sp (штамм, обозначение JLR.KK002) был выделен на агаре Шедлера от мышей C57BL/6, несущих микробиоту, обогащенную спорообразователями. Обогащение спорообразователями проводили, как описано ранее, и мышей содержали с этой микробиотой в течение нескольких поколений в нашем гнотобиотическом учреждении, прежде чем JLR.KK002 был выделен из фекалий (Browne et al., 2016). Мы провели ПЦР-амплификацию, и Сэнгер секвенировал ген 16S рРНК, а затем классифицировал его с помощью службы SILVA ACT и базы данных SILVA (Pruesse et al., 2012). Использовали штамм Salmonella typhimurimum ST2. Использовали штамм Candida albicans sc5314. Бактериальные штаммы, используемые в синтетическом сообществе PhyLo11b, описаны ниже.

Экспериментальный колит, вызванный DSS

Колит вызывали добавлением в питьевую воду 2,5% или 3% (масс./об.) 36,000-50,000MW декстрана сульфата натрия (DSS) (MP Biomedicals) в течение 7 дней. Тяжесть колита контролировали ежедневно по изменению массы тела, консистенции стула и крови в кале. В эксперименте по спасению моноцитов все мыши получали 2,5% DSS в течение 5 дней, после чего давали обычную воду; Мониторинг веса продолжался до 10-го дня, когда животных собирали. В качестве порога тяжести были установлены пределы тяжести, превышающие 20% потерю веса. В конце эксперимента MLN и толстая кишка были удалены. Для определения длины ободочную кишку измеряли от слепой кишки до прямой кишки. Затем ткани обрабатывали для гистологии, экстракции РНК или анализа проточной цитометрии.

Гистология и оценка толстой кишки

Colons were fixed within histology cassettes O/N at RT in 10% buffered formalin phosphate solution after removal of fecal contents and then transferred to 70% EtOH at 4 C until staining. Sectioning and H&E staining were done at the HCI Biorepository and Molecular Pathology Resource core in the ARUP-operated Research Histology division. Colon scoring was done in a blinded manner with the following rubric scales: percentage of colon crypt loss (0.5 (5%) - 7 (>75%)), crypt loss severity (1 (partial loss) – 5 (full loss)) and inflammatory aggregates (1 (1-3) – 3 (>7)).

Липокалин-2 (LCN-2) ИФА

Протокол выполнялся в соответствии с протоколом производителя (Fischer Scientific DY1857-05). Вкратце, фекалии собирали, взвешивали и растирали в HBSS 1X в концентрации 100 мг/мл. Затем образцы вращали при 50 g в течение 5 минут для удаления крупных частиц. Затем супернатант удаляли, помещали в новую пробирку и вращали при 8000 g в течение 5 минут для осаждения бактерий. Этот супернатант затем разбавляли в зависимости от заболевания животных, но обычно варьировали от 1:100- 500 (здоровые) до 1:500-1000 (обработанные DSS). Измерение мочевой кислоты. Концентрацию мочевой кислоты проводили в соответствии с инструкциями производителя (набор для анализа активности мочевой кислоты/уриказы Invitrogen™ Amplex™Red, кат. номер A22181). Вкратце, кровь собирали у мышей дикого типа или Clec12a-/- путем пункции сердца в пробирки с сепаратором сыворотки с золотым верхом. Пробиркам давали свернуться в течение 30 минут, а затем вращали при 1300 g в течение 10 минут. Сыворотку удаляли и помещали в пробирки Эппендорфа емкостью 1,5 мл, быстро замораживали и хранили при -80 градусах Цельсия до проведения тестирования. Анализ фекалий мочевой кислоты проводили путем получения свежих фекальных гранул от мышей WT и Clec12-/-. Осадки взвешивали и записывали, а затем растирали в 1 мл 1x реакционного буфера. После физического затирания пробирки вращали при 50 g в течение 5 минут для удаления крупного мусора. Оставшуюся фекальную суспензию анализировали на мочевую кислоту.

Экспериментальный колит с переносом Т-клеток

Селезенку дикого типа выделяли и растирали в среде RPMI, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, пенициллин и стрептомицин. Клетки вращали при 367×g для выделения клеток. Полученный осадок затем суспендировали в 1x буфере для лизиса RBC на 5 минут в темноте при комнатной температуре. Полученные лейкоциты затем пропускали через колонку MilteNY CD4+ MACS для выделения CD4+ Т-клеток. Затем Т-клетки окрашивали CD4 и CDRB и сортировали на FACS Aria Fusion (BD Biosciences). Клетки CD4+ CDRBhi собирали и вводили в TCRb-/- или TCRb-/-; Мышам Clec12a-/- внутрибрюшинно (IP). Каждая мышь получила 5×105 клеток. Тяжесть и развитие колита контролировали еженедельно путем оценки потери веса. В конечной точке эксперимента MLN и толстую кишку удаляли, а толстую кишку измеряли от слепой кишки до прямой кишки для оценки тяжести заболевания.

Выделение лейкоцитов из собственной пластинки толстой кишки.

Мышиные толстые кишки с прикрепленными слепыми кишками собирали и помещали в 1X PBS в 6-луночные планшеты на льду. Весь видимый оставшийся жир и соединительную ткань удаляли, а слепую кишку отсекали от толстой кишки. Двоеточие раскрывали и осторожно удаляли слизь и фекалии из толстой кишки перед тем, как поместить обратно в 6-луночный планшет. После того как все толстые кишки были расправлены и соскоблены, каждую толстую кишку нарезали кубиками на крышке чашки Петри с помощью лезвия бритвы и помещали в отдельную пробирку емкостью 5 0 мл. Добавляли 10 мл предварительно нагретого раствора для диссоциации (1X HBSS без Ca+ и Mg+, 1,5 мМ DTT, 10 мМ HEPES и 30 мМ ЭДТА) и кратковременно перемешивали пробирки на встряхивании. Колонки инкубировали примерно 25 мин. при 37 градусах и встряхивании со скоростью 150 об/мин до тех пор, пока растворы не станут мутными в результате разделения IEC. Образцы встряхивали 3 раза и перемешивали на вортексе в течение 15 секунд, затем выливали на 100-мМ фильтр на коническом сосуде емкостью 50 мл для удаления неиммунных клеток, таких как IEC, и фильтры кратковременно промывали 2 мл ледяного 1X PBS. Оставшуюся ткань собирали на фильтре щипцами и перемещали в новый конический сосуд емкостью 50 мл. 15 мл предварительно нагретого раствора для расщепления (1X HBSS с Ca+ и Mg, 5% FBS, 50 ед/мл Dispase II [Millipore-Sigma, кат. № 4942078001], 0,5 мг/мл ДНКазы I [Worthington Biochemical, кат. № LS002139] и 0,5 мг/мл коллагеназы D [Millipore-Sigma, номер по каталогу 11088866001]), образцы кратковременно перемешивали на встряхивании и затем инкубировали в течение 45 минут. при 37 градусах при встряхивании со скоростью 150 об/мин или до тех пор, пока раствор не помутнеет. Затем образцы встряхивали 3 раза и перемешивали на вортексе в течение 15 секунд. Для сбора оставшихся иммунных клеток cLP переваренную ткань затем выливали на 40-мМ фильтр в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл 1X PBS. Затем образцы промывают и фильтруют с помощью 2 мл ледяного 1X PBS и центрифугируют при 800 g в течение 10 минут при температуре 4 градуса. Затем супернатант удаляли и отбрасывали с помощью вакуума. Затем клетки ресуспендировали в 500 мл полного RPMI и подсчитывали с помощью исключающего окрашивания трипановым синим.

Проточной цитометрии

Лейкоциты, выделенные из cLP, окрашивали на жизнеспособность с использованием зомби-красителя 510 (AmCyan) в течение 10 минут при комнатной температуре в темноте. Затем образцы блокировали Fc-рецептор с помощью CD-16/32 в течение 20 минут при 4 градусах в темноте. После центрифугирования при 367 g в течение 5 минут декантированные клетки окрашивали в течение 30 минут в темноте при 4 градусах. Все антитела использовали в разведении 1:250, если не указано иное. Милелоидная панель состояла из CD45-BV421, CD11b-PerCpCy5.5, MHCII-BV605, CD64-BV711, CX3CR1-BV785, Ly6C-FITC, CD38-PE- Cy7, Ly6G-CF-594, Clec12a-PE (1:500), EGR2-APC (внутриклеточный, 1:50). Т-клетки различали по: красителю Zombie 510 (AmCyan), CD45-BV421, CD3e-BV711, CD4-FITC, Foxp3-APC (внутриклеточный 1:50), IL{{ 50}}PE (внутриклеточный 1:50), IFN-g (BV605) (внутриклеточный 1:50), RORgt-PE610 (внутриклеточный 1:50), IL-17A-BV785 (внутриклеточный 1:50). После окрашивания клетки промывали 2 раза по 5 минут буфером для колонок (1X HBSS без Ca2+, Mg2+ и HEPES, EDTA, FBS). Клетки фиксировали O/N с помощью 2% PFA, если внутриклеточное окрашивание не требовалось, а затем промывали колоночным буфером 2X перед прохождением на проточном цитометре. Если было необходимо внутриклеточное окрашивание, использовали набор FoxP3 / Transcription Factor Staining Buffer (Tonbo Biosciences) и протокол. Затем все образцы ресуспендировали в 300 мкл колоночного буфера и анализировали на BD LSR Fortessa после компенсации с помощью UltraComp eBeads (ThermoFisher Scientific) и использования контрольных образцов с одним окрашиванием.

Бактерии, окрашивающие IgA

Бактерии выделяли из фекальных гранул путем затирания HBSS с Ca2+ и Mg2+ в концентрации 100 мг фекалий на мл HBSS. Затем размятые фекалии вращали при 50 g в течение 5 минут для удаления крупных остатков. Супернатант удаляли и помещали в новую пробирку. Затем его вращали при 8000 g в течение 5 минут для осаждения бактерий. Супернатант удаляли и осадки промывали HBSS с Ca2+ и Mg2+. Наконец, осадки ресуспендировали в HBSS в концентрации 100 мг/мл, 10 мкл этого вещества помещали в 96-луночный планшет и блокировали HBSS с содержанием Ca2+ и Mg2+. 10% FBS в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем непосредственно к образцу добавляли 100 мкл анти-IgA (PE) и инкубировали в течение 30 минут при 4°C в темноте. Затем клетки промывали раствором HBSS+FBS 2 раза и, наконец, ресуспендировали в HBSS+1x Sybr®-зеленый и оставляли инкубироваться в течение 20 минут в темноте при комнатной температуре. Затем образцы непосредственно считывали на проточном цитометре.

Выделение костного мозга

Костный мозг выделяли, как описано ранее. Вкратце, длинные кости животных C57Bl/6 дикого типа или Clec12a-/- извлекали и очищали бумажным полотенцем, осторожно протирая. Чистые кости хранились на льду во время обработки животных. Концы костей были слегка подрезаны, чтобы обнажить костный мозг. Кость вставляли (открытым концом вниз) в пробирку Эппендорфа 0,5 мл, которую прокалывали иглой массой 18 г. Эту пробирку Эппендорфа 0,5 мл затем помещали в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл и вращали при 13,000 x g в течение 1 минуты. Пропущенный через костный мозг препарат затем подвергался лизису эритроцитов с использованием буфера для лизиса эритроцитов (Biolegend) в соответствии с рекомендациями производителя. После лизиса эритроцитов клетки ресуспендировали в полной модифицированной среде Игла Дульбекко (DMEM), содержащей: 10% FBS, 1 мг/мл Pen/Strep, 10 мМ HEPES, 1 заменимую аминокислоту, 1 мМ пирувата натрия. Затем клетки вращали при 367×g в течение пяти минут для осаждения клеток. Изолированные клетки затем использовались для разработки BMDM или для дальнейшего выделения моноцитов.

Макрофаги костномозгового происхождения

Лейкоциты выделяли из костного мозга, суспендировали в полной DMEM и подсчитывали с помощью эксклюзионного окрашивания трипановым синим на гемоцитометре. Клетки высевали на обработанные тканевой культурой чашки диаметром 10 см в концентрации 5-8 x 106 клеток/планшет в 10 мл полной среды + M-CSF (20 нг/мл). Свежую среду, включая M-CSF, добавляли к существующей среде на 4-й и 7-й дни. Полностью дифференцированные BMDM использовали для экспериментального применения между днями 7-9.

Выделение моноцитов

Костный мозг собирали у животных дикого типа и Clec12a-/-, как описано ранее. Моноциты выделяли с помощью набора для выделения моноцитов (BM), мыши (MilteNY Biotec) и колонки LS MACS в соответствии с инструкциями производителя.

Совместное культивирование F. Rodentium BMDM и RNAseq

Культуры F. Rodentium количественно оценивали по OD 600 нм (с использованием 1 OD 600 нм=1 x 10^8 клеток/мл), дважды промывали стерильным PBS и совместно культивировали с 1 x 106 клеток/мл полностью дифференцированных BMDM при MOI 10 в 6-луночных планшетах для тканевых культур. После 24 часов совместного культивирования среду собирали и хранили при -20 C до дальнейшего использования. BMDM промывали холодным стерильным PBS, 2 раза. Затем непосредственно в каждую лунку добавляли реагент для стабилизации РНК Qiazol (Qiagen, номер по каталогу 79306). Лунки соскребали клеточным скребком, собирали в 1,5 пробирки Эппендорфа и замораживали при -20 градусах до выделения РНК. Экстракцию РНК проводили с использованием набора для минипрепаратов РНК Direct-zol (Zymo Research, кат. № R2070) в соответствии с инструкциями производителя, а библиотеки секвенирования были подготовлены в основном центре высокопроизводительной геномики Института рака Хантсмана. Тотальную РНК сначала гибридизовали с набором NEBNext rRNA Depletion v2 (NEB, кат. № E7400) для уменьшения количества рРНК в образцах. Библиотеки для секвенирования многоцепочечных РНК готовили с использованием набора для подготовки библиотеки направленных РНК NEBNext Ultra II для Illumina (NEB, кат. номер E7760L). Очищенные библиотеки оценивали на Agilent Technologies 4150 TapeStation с использованием анализа D1000 ScreenTape (Agilent, кат. № 5067-5582 и 5067-5583). Молярность молекул, модифицированных адаптером, определяли с помощью количественной ПЦР с использованием набора Kapa Biosystems Kapa Library Quant Kit (Roche, кат. № 07960140001). Отдельные библиотеки были нормализованы до 5 нМ при подготовке к анализу последовательности Illumina и секвенированы на NovaSeq 6000 с помощью цикла секвенирования парных концов 150-.

Цитокиновый анализ

BMDM выделяли и выращивали, как описано ранее. Полностью дифференцированные BMDM высевали из расчета 1×105 клеток/лунку в 12-луночные планшеты для тканевых культур. BMDM стимулировали 100 нг/мл ЛПС; 1 мкг/мл Pam3Cysk; или флагеллин 1 мкг/мл. Клетки стимулировали в течение 24 часов, среду собирали и сохраняли при -20 C для анализа. Цитокины анализировали с помощью LEGENDplex™ Mouse Inflammation Panel (13-plex) (Biolegend, кат. номер 740150). Данные анализировали с использованием программного обеспечения для анализа данных LEGENDplex™.

Секвенирование гена 16s рРНК

Фекальные осадки или содержимое подвздошной кишки собирали у отдельных мышей и немедленно замораживали при температуре {{0}} в пробирках с завинчивающимися крышками объемом 2 мл, содержащих 250 мг гранул граната размером 0,15 мм (MoBio, кат. № {{5) }}). ДНК экстрагировали с использованием набора для выделения фекальной ДНК Power (MoBio или QIAGEN) в соответствии с инструкциями к набору и включали 2 цикла взбивания шариков по 1 минуте при 4 градусах на Mini-Bead-Beater 16 (BioSpec Products). Области V3 и V4 гена 16S рРНК амплифицировали с помощью одного раунда ПЦР с использованием праймеров, которые содержали (описаны с 3' по 5') последовательность, нацеленную на ген 16S рРНК области V3/4, после чего следовала 2-нуклеотидная подушечка. последовательностями праймера Illumina, нуклеотидной индексной последовательностью 8- и оставшейся адаптерной последовательностью Illumina. Последовательности, нацеленные на V3/4 16S, были взяты из Takahashi (Takahashi et al., 2014), а индексы были взяты из Kozich (Kozich et al., 2013). Использовались полные олигонуклеотидные последовательности (индексы обозначены Xs): Prok16SV34_Для: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXACACTCTTTCCCTACACGACGCTC TTCCGATCTTGCCTACGGGNBGCASCAG; Prok16SV34_Ред.: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTGACT GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCC GATCTGCGACTACNVGGGTATCTAATCC. Условия цикла ПЦР были следующими: начальная денатурация при 98° в течение 2 минут; 26 циклов по 20 секунд, денатурация 98 градусов, 20 секунд отжиг, 51,5 градусов, 20 секунд, удлинение 72 градуса; и одно финальное разгибание на 72 градуса в течение 2 минут. Каждую ПЦР (выполненную в трех экземплярах для каждого образца) выполняли в объеме 25 мкл с использованием Q5 High-Fidelity 2X Master Mix (NEB, кат. номер M0492L), 5 пмоль каждого праймера и 50 нг матричной ДНК. После амплификации трипликаты ПЦР из каждого образца объединяли, 5 мкл пропускали на агарозном геле для подтверждения амплификации, а оставшийся объем очищали с помощью шариков для очистки Axygen AxyPrep MAG PCR (Corning, кат. № MAG-PCR-CL{{53) }}), разбавленного до 62,5% водой для эффективного удаления любого димера праймера, который будет предпочтительно секвенирован. Разбавленные шарики добавляли в 1,8-кратном объеме реакции ПЦР, очищали в соответствии с рекомендациями производителя и очищенные ампликоны элюировали 25 мкл 10 мМ Трис-Cl, pH 8,0. Затем ампликоны определяли количественно с помощью анализа дцДНК пико-зеленого цвета (ThermoFisher, кат. номер P11495) на микропланшетном ридере, а затем очищенные и проиндексированные отдельные библиотеки секвенирования равномерно мультиплексировали (по нг ДНК) и секвенировали на приборе Illumina MiSeq с парными концами. Режим 300 циклов в совместно используемом ресурсном центре высокопроизводительной геномики Института рака Хантсмана.

Биоинформатическая обработка данных о последовательностях

Необработанные чтения гена 16S рРНК были демультиплексированы, что позволило выявить несоответствия 0 в индексах, а затем обработали и проанализировали в рамках QIIME2 (Bolyen et al., 2019), как мы описали ранее (Stephens et al., 2021). Короче говоря, демультиплексированные и отфильтрованные по качеству последовательности сначала были удалены от последовательностей праймеров и линкеров с помощью плагина Cutadapt, а затем очищены от шума с помощью DADA2 (Callahan et al., 2016; Martin, 2011). Затем таксономии были назначены ASV с помощью метода classifysklearn в плагине классификатора объектов по эталонному набору GTDB (версия 89), обрезанному до усиленной области V3/4 и обученному с помощью метода fit-classifier-naive-bayes (Bokulich et al. , 2018; Паркс и др., 2018; Педрегоса и др., 2011). Показатели разнообразия, расстояния и статистическая значимость группировок бета-разнообразия по пермановым были рассчитаны в рамках QIIME2 (Anderson, 2001).

Для секвенирования РНК BMDM необработанные считывания подвергали первому качеству и обрезали адаптером с использованием изобилия обрезки, затем количественно определяли количество транскриптов с использованием Salmon против транскриптома из сборки GRCm38 (mm10) (Patro et al., 2{{ 16}}17). Количественные оценки уровня транскрипта считывались в R с использованием временного пакета и суммировались с подсчетами на уровне генов перед дифференциальным анализом экспрессии с помощью DESeq2 с использованием расчетной формулы «~ Генотип + Лечение + Генотип: Лечение» (Love et al., 2014; Love et al., 2020). Дифференциальные реакции на F.rodentium представляли собой разницу между реакцией каждого генотипа на обработку живыми F.rodentium по сравнению с клетками, обработанными контрольным носителем. Гены со значительной дифференциальной экспрессией определялись как гены со скорректированным значением p <0,05 и кратным изменением log2> |0,58| (1,5-кратное изменение). Затем списки генов с существенно пониженным и повышенным регулированием использовались для проверки обогащения терминов онтологии генов (GO) с использованием пакета кластераProfiler, включая функцию упрощения, чтобы уменьшить избыточность терминов GO и идентифицировать ключевые биологические процессы (S, 2020; Wu et al. ., 2021).

Вызов F. Rodentium DSS

F. Rodentium выращивали, как описано ранее, и количественно определяли до 1×109 КОЕ/мл в стерильном PBS. F. Rodentium фиксировали сначала двукратным промыванием в стерильном PBS, а затем ресуспендированием в 1 мл 10% раствора Fomalin-PBS в течение 10 минут. Затем клетки промывали еще два раза в 10 мл стерильного PBS для подготовки к пероральному зондированию. Нефиксированные клетки промывали, как фиксированные клетки, и хранили на льду до зондового зондирования. Мышам WT C57BL/6 SPF перорально вводили 100 мкл раствора, содержащего либо только PBS (носитель), F.rodentium (живой) или F.rodentium (фиксированный) с дней -3 до 10. Животным давали 3,0% DSS в дни 0-7; Свежую воду DSS заменяли через день. В качестве порога тяжести были установлены пределы тяжести, превышающие 20% потерю веса. В конце эксперимента MLN и толстая кишка были удалены. Для определения длины ободочную кишку измеряли от слепой кишки до прямой кишки. Затем ткани обрабатывали для гистологии, экстракции РНК или анализа проточной цитометрии.

Анализ фагоцитоза

Перитонеальные макрофаги выделяли путем инъекции 5 мл стерильного PBS в брюшную полость. PBS осторожно перемешивали в полости каждые несколько секунд. Через 2 минуты PBS извлекали с помощью иглы калибра 28 и помещали в холодную полную DMEM. Клетки центрифугировали при 367×g и промывали полной средой. Затем клетки подсчитывали с помощью гемоцитометра и помещали в 12-луночные планшеты для культуры ткани в концентрации 2,5×105 клеток/мл. Клеткам давали возможность прилипать в течение ночи. На следующий день лунки осторожно перемешивали встряхиванием и аспирировали среду. Прикрепившиеся клетки затем дважды промывали 500 мкл холодного стерильного PBS. Затем к прикрепившимся (макрофагам) добавляли предварительно нагретый полный DMEM, содержащий F.rodentium с MOI 10. Затем планшеты осторожно вращали при 200 g при комнатной температуре в течение трех минут, а затем инкубировали в стандартных условиях культивирования клеток (37°C, 5% CO2) в течение 90 минут. F. родентиум готовили, как описано, для совместного культивирования BMDM только для секвенирования РНК, после промывания клетки ресуспендировали в 1x зеленом Sybr® (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3) при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем бактериальные клетки осаждали при 4000 об/мин в течение 5 минут, ресуспендировали в полной DMEM и предварительно нагревали для перитонеальных макрофагов. После 90-минутного совместного культивирования среду аспирировали и клетки дважды промывали холодным стерильным PBS. Прикрепившиеся клетки, содержащие окрашенные Sybr® зеленым F. Rodentium, фиксировали 2% параформальдегидом (PFA) в течение 10 минут. PFA аспирировали и на клетки помещали стерильный PBS. Затем клетки визуализировали на предмет фагоцитоза F. Rodentium.

Анализ изображений макрофагов

Светлопольные и флуоресцентные изображения культур макрофагов, обработанных F. Rodentium, были получены с использованием системы визуализации EVOS m7000 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс). Для каждой культуры было сделано от трех до пяти отдельных рандомизированных изображений, которые были выполнены в трех экземплярах.

Images were blinded and quantified using the software Fiji (Schindelin et al., 2012). Individual bacteria and macrophages were easily distinguished based on size. The total number of bacteria that were associated with (touching or overlapping with) single macrophages was quantified for a randomized subset of cells within the image. Equal numbers of cells were quantified between genotypes (n>200).

Конструкция слитого белка CLEC12A-Fc aи очищениена

кДНК, кодирующие внеклеточные домены мышиного Clec12a, амплифицировали с помощью ПЦР из лейкоцитов, выделенных из костного мозга C57Bl/6 WT SPF, и подтверждали секвенированием. кДНК были слиты с С-концом человеческого IgG1-Fc в векторе экспрессии pFuse-hIgG1- Fc2 (InvivoGen). Конструкции, содержащие Clec12a или пустой вектор, трансфицировали в клетки Lx293, культивированные с DMEM +10% FBS и Pen/strep (1 мг/мл). Секретируемые слитые белки собирали из среды 24-48 после трансфекции. Среду вращали при 367×g в течение 5 минут для удаления дебриса/мертвых клеток, а супернатант замораживали при -20 C до использования. Слитые белки Clec12a-Fc или только Fc выделяли с помощью набора Pierce™ Classic Magnetic IP/Co-IP (Thermo Fisher Scientific, номер по каталогу: 88804), количественно определяли с помощью набора для анализа белка Pierce™ BCA (номер по каталогу Thermo Fisher Scientific: 23227). и подтверждено вестерн-блоттингом с использованием антитела против Clec12a (Novus Biologicals NBP2-27346SS).

Анализ связывания Clec12a-Fc

Очищенные конструкции разводили до 0,4 мг/мл в HBSS с Ca2+ и Mg2+. Бактерии выращивали в соответствующих средах и аэробных условиях и нормализовали по OD 600 нм. Бактерии промывали HBSS с Ca2+ и Mg2+ и блокировали HBSS с Ca2+ и Mg2+ +10% FBS в течение 20 минут при комнатной температуре. Все процедуры окрашивания проходили в атмосферных условиях. 1×107 бактериальных клеток помещали в планшет с круглым дном 96-луночек, центрифугировали при 3,000 g и декантировали. 50 мкл конструкций помещали на бактериальные клетки, осторожно перемешивали и инкубировали при 4°С в течение 1 часа. Клетки бактерий промывали HBSS с Ca2+ и Mg2+ + 10% FBS, 2 раза. 50 мкл козьего античеловеческого Fc (PE) (каталог электронных наук № 12-4998-82) добавляли к клеткам и инкубировали при 4°С в течение 1 часа в темноте. Затем клетки промывали, как раньше, и помещали в HBSS с Ca2+ и Mg2+, содержащую 1x Sybr® green (Sigma-Aldrich CAS: 163795-75-3). Клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут в темноте и сразу же считывали на проточном цитометре BD LSR Fortessa.

Облучение и восстановление костного мозга

Костный мозг собирали у животных дикого типа и Clec12a-/-, как описано ранее. Полученных мышей-реципиентов смертельно облучали дозой 500 рад в день -1, а затем 400 рад в день 0. Через четыре часа после последнего облучения мышей-реципиентов помещали под анестезию изофлураном и изолировали 100 мкл клетки костного мозга, суспендированные в стерильном PBS (1×10 8 клеток/мл), доставляли через иглу калибра 28,5 в ретроорбитальное пространство. Нас интересовала микробиота, поэтому животным не давали антибиотики, а через 8 недель собирали фекальные осадки для переноса микробиоты животным GF.

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

Андерсон, MJ (2001). Новый метод непараметрического многомерного дисперсионного анализа. Австрал Экол. 26, 32-46. DOI 10.1111/j.1442-9993.2001.01070.pp.x.

Бегун Дж., Лассен К.Г., Джиджон Х.Б., Бакст Л.А., Гоэл Г., Хит Р.Дж., Нг, А., Тэм Дж.М., Куо С.Ю., Виллабланка Э.Дж. и др. (2015). Интегрированная геномика варианта риска болезни Крона

определяет роль CLEC12A в антибактериальной аутофагии. Представитель ячейки 11, 1905-1918. 10.1016/j.celrep.2015.05.045.

Бландер Дж. М., Лонгман Р. С., Илиев И. Д., Зонненберг Г. Ф. и Артис Д. (2017). Регуляция воспаления путем взаимодействия микробиоты с хозяином. Нат. Иммунол. 18, 851-860. 10.1038/ни.3780.

Бокулич Н.А., Келер Б.Д., Райдаут Дж.Р., Диллон М., Болиен Э., Найт Р., Хаттли Г.А. и Капорасо Дж.Г. (2018). Оптимизация таксономической классификации последовательностей ампликонов маркерных генов с помощью плагина классификатора функций QIIME 2 ''sq2-. Микробиом 6. ARTN 90 10.1186/s40168-018-0470-z.

Больен Э., Райдаут Дж.Р., Диллон М.Р., Бокулич Н., Абнет К.С., Аль-Галит Г.А., Александер Х., Алм Э.Дж., Арумугам М., Асникар Ф. и др. (2019). Воспроизводимая, интерактивная, масштабируемая и расширяемая наука о данных микробиома с использованием QIIME 2. Nat. Биотехнология. 37, 852-857. 10,1038/с41587-019-0209-9.

Браун, Дж.Д., Уиллмент, Дж.А., и Уайтхед, Л. (2018). Лектины С-типа в иммунитете и гомеостазе. Нат. Преподобный Иммунол. 18, 374-389. 10,1038/с41577-018-0004-8.

Браун, Х.П., Форстер, С.К., Анони, Б.О., Кумар, Н., Невилл, Б.А., Старс, МД, Гулдинг, Д. и Лоули, Т.Д. (2016). Культивирование «некультивируемой» микробиоты человека позволяет выявить новые таксоны и обширное спорообразование. Природа 533, 543-+. 10.1038/nature17645.

Кэдвелл К., Лю Дж.Ю., Браун С.Л., Миёши Х., Лох Дж., Леннерц Дж.К., Киши К., Кс В., Карреро Дж.А., Хант С. и др. (2008). Ключевая роль аутофагии и гена аутофагии Atg16l1 в клетках Панета кишечника мыши и человека. Природа 456, 259-263. 10.1038/nature07416.

Каллахан, Б.Дж., Макмерди, П.Дж., Розен, М.Дж., Хан, А.В., Джонсон, А.Дж.А. и Холмс, С.П. (2016). DADA2: Вывод выборки высокого разрешения на основе данных ампликона Illumina. Нат. Методы 13, 581-+. 10.1038/Нмет.3869.

Цао Ю.Г., Бэ С., Вильярреал Дж., Мой М., Чун Э., Мишо М., Ланг Дж.К., Гликман Дж.Н., Лобель Л. и Гарретт В.С. (2022). Faecalibaculum Rodentium ремоделирует передачу сигналов ретиноевой кислоты, регулируя эозинофил-зависимый эпителиальный гомеостаз кишечника. Клетка-хозяин и микроб 30, 1295- 1310 e1298. 10.1016/ж.чом.2022.07.015.

Чанг, Д.Х., Ри, М.С., Ан, С., Банг, Б.Х., О, Дж.Э., Ли, Гонконг, и Ким, Британская Колумбия (2015). Faecalibaculum Rodentium gen. ноябрь, сп. nov., выделенный из фекалий лабораторной мыши. Антони Ван Левенгук 108, 1309-1318. 10.1007/с10482-015-0583-3.

Кьяро Т.Р., Сото Р., Стивенс В.З., Кубинак Дж.Л., Петерсен К., Гогохия Л., Белл Р., Дельгадо Дж.К., Кокс Дж., Вот В. и др. (2017). Член микобиоты кишечника модулирует пуриновый метаболизм хозяина, усугубляя колит у мышей. наук. Перевод Мед. 9, .

Друэн М., Саенс Дж. и Шиффо Э. (2020). Лектиноподобные рецепторы C-типа: голова или хвост иммунитета к гибели клеток. Передний. Иммунол. 11. АРТН 251 10.3389/fimmu.2020.00251.

Фассарелла М., Блаак Э.Э., Пендерс Дж., Наута А., Смидт Х. и Зотендал Э.Г. (2021). Стабильность и устойчивость кишечного микробиома: выяснение реакции на возмущения с целью регулирования здоровья кишечника. Гут 70, 595-605. 10.1136/gutjnl-2020-321747.

Гкуску К.К., Делигианни К., Цацанис К. и Элиопулос А.Г. (2014). Микробиота кишечника на мышиных моделях воспалительного заболевания кишечника. Границы клеточной и инфекционной микробиологии 4. ARTN 28 10.3389/fcimb.2014.00028.

Хан Ю.М., Чжан М.Х., Ли Н., Чен Тай, Чжан Ю., Ван Т. и Цао ХТ (2004). KLRL1, новый лектиноподобный рецептор клеток-киллеров, ингибирует цитотоксичность естественных клеток-киллеров. Кровь 104, 2858-2866. DOI 10.1182/кровь-2004-03-0878.

Илиев И.Д., Фунари В.А., Тейлор К.Д., Нгуен К., Рейес К.Н., Стром С.П., Браун Дж., Беккер К.А., Флешнер П.Р., Дубинский М. и др. (2012). Взаимодействие между комменсальными грибами и рецептором лектина С-типа дектин-1 влияет на колит. Наука 336, 1314-1317. 10.1126/science.1221789.

Джейсон Л. Кубинак, WZS, Рэй Сото, Чарисс Петерсен, Тайсон Кьяро, Лаша Гогохия, Рикеша Бел1, Надим Дж. Аджами, Джозеф Ф. Петрозино, Линда Моррисон4, Уэйн К. Поттс, Питер Э. Дженсен, Райан М. О' Коннелл и Джун Л. Раунд (2015). Вариации MHC формируют индивидуализированные микробные сообщества, которые контролируют восприимчивость к кишечным инфекциям. Природное общение. 0.1038/нкоммс9642.

Коно Х., Чен С.Дж., Онтиверос Ф. и Рок К.Л. (2010). Мочевая кислота способствует острой воспалительной реакции на гибель стерильных клеток у мышей. Дж. Клин. Вкладывать деньги. 120, 1939-1949. 10.1172/Jci40124.

Козич Дж. Дж., Уэсткотт С.Л., Бакстер Н.Т., Хайлендер С.К. и Шлосс П.Д. (2013). Разработка стратегии двухиндексного секвенирования и конвейера курирования для анализа данных о последовательностях ампликонов на платформе секвенирования MiSeq Illumina. Прикладная и экологическая микробиология 79, 5112-5120. 10.1128/Аэм.01043-13.

Кубинак Дж.Л., Петерсен К., Стивенс В.З., Сото Р., Бэйк Э., О'Коннелл Р.М. и Раунд Дж.Л. (2015). Передача сигналов MyD88 в Т-клетках направляет IgA-опосредованный контроль микробиоты для укрепления здоровья. Клетка-хозяин Микроб 17, 153-163. 10.1016/ж.чом.2014.12.009.

Ли К., Нойманн К., Духан В., Наминени С., Хансен А.Л., Вартевиг Т., Кургис З., Холм К.К., Хайкенвальдер М., Ланг К.С. и Руланд, Дж. (2019). Кристаллический рецептор мочевой кислоты Clec12A усиливает реакцию интерферона I типа. Proc Natl Acad Sci USA 116, 18544-18549. 10.1073/пнас.1821351116.

Лю, Дж.З., ван Зоммерен, С., Хуанг, Х., Нг, С.К., Альбертс, Р., Такахаши, А., Рипке, С., Ли, Дж.К., Джостинс, Л., Шах, Т. и др. . (2015). Анализ ассоциаций идентифицирует 38 локусов восприимчивости к воспалительным заболеваниям кишечника и подчеркивает общий генетический риск среди населения. Нат. Жене. 47, 979-986. 10.1038/нг.3359.

Лав М.И., Хубер В. и Андерс С. (2014). Умеренная оценка кратности изменения и дисперсии данных секвенирования РНК с помощью DESeq2. Геном Биол. 15. АРТН 550 10.1186/с13059-014-0550-8.

Лав, М.И., Сонесон, К., Хики, П.Ф., Джонсон, Л.К., Пирс, Н.Т., Шеперд, Л., Морган, М. и Патро, Р. (2020). Tximeta: контрольные суммы эталонных последовательностей для идентификации происхождения в RNA-seq. Plos Вычислительная биология 16. ARTN e1007664 10.1371/journal.pcbi.1007664.

Луо Ю., Такер С.С. и Касадевалл А. (2005). Активация рецепторов Fc и комплемента стимулирует прогрессирование клеточного цикла клеток-макрофагов от G1 до SJ Immunol. 174, 7226- 7233. 10.4049/jimmunol.174.11.7226.

Макферсон А.Дж., Гатто Д., Сэйнсбери Э., Гарриман Г.Р., Хенгартнер Х. и Зинкернагель Р.М. (2000). Примитивный, независимый от Т-клеток механизм реакции IgA слизистой оболочки кишечника на комменсальные бактерии. Наука 288, 2222-+. DOI 10.1126/science.288.5474.2222.

Маглинао М., Эрикссон М., Шлегель М.К., Циммерманн С., Йоханнссен Т., Гоце С., Зеебергер П.Х. и Лепенис Б. (2014). Платформа для скрининга углеводов, связывающих рецепторы лектина C-типа, и их потенциала для клеточно-специфического нацеливания и иммунной модуляции. Журнал контролируемого выпуска 175, 36-42. 10.1016/j.jconrel.2013.12.011.

Маршалл, А.С.Дж., Уиллмент, Дж.А., Лин, Х.Х., Уильямс, Д.Л., Гордон, С. и Браун, Г.Д. (2004). Идентификация и характеристика нового человеческого миелоидного ингибирующего лектиноподобного рецептора c-типа (MICL), который преимущественно экспрессируется на гранулоцитах и ​​моноцитах. Ж. Биол. хим. 279, 14792-14802. 10.1074/jbc.M313127200.

Мартин, М. (2011). Cutadapt удаляет адаптерные последовательности из операций высокопроизводительного секвенирования. EMBNet.journal 17. Мартинес-Лопес, М., Иборра, С., Конде-Гарроса, Р., Мастранжело, А., Данн, К., Манн, Э.Р., Рид, Д.М., Габорио-Рутио, В., Чапарро , М., Лоренцо, М.П. и др. (2019). Зондирование микробиоты по оси Минкля-Сика в дендритных клетках регулирует выработку интерлейкинов -17 и -22 и способствует целостности кишечного барьера. Иммунитет 50, 446-461 e449. 10.1016/j.immuni.2018.12.020.

Мартинон Ф., Петрилли В., Мэр А., Тардивель А. и Чопп Дж. (2006). Кристаллы мочевой кислоты, связанные с подагрой, активируют воспалительную сому NALP3. Природа 440, 237-241. 10.1038/nature04516.

Накадзима А., Фогельзанг А., Маруя М., Миядзима М., Мурата М., Сон А., Кувахара Т., Цуруяма Т., Ямада С., Мацуура М., и другие. (2018). IgA регулирует состав и метаболическую функцию микробиоты кишечника, способствуя симбиозу между бактериями. Дж. Эксп. Мед. 215, 2019-2034. 10.1084/jem.20180427.

Нойман К., Кастинейрас-Виларино М., Хоккендорф У., Ханнесшлагер Н., Лемеер С., Купка Д., Мейерманн С., Лех М., Андерс Х.Дж., Кастер Б. , и другие. (2014). Clec12a — это ингибирующий рецептор кристаллов мочевой кислоты, который регулирует воспаление в ответ на гибель клеток. Иммунитет 40, 389-399. 10.1016/j.immuni.2013.12.015.

Окай С., Усуи Ф., Ёкота С., Хори И.Ю., Хасегава М., Накамура Т., Куросава М., Окада С., Ямамото К., Нисияма Э. и др. ал. (2016). Высокоаффинный моноклональный IgA регулирует микробиоту кишечника и предотвращает колит у мышей. Nat Microbiol 1, 16103. 10.1038/nmicrobiol.2016.103.

Пабст О. и Слэк Э. (2020). IgA и кишечная микробиота: важность специфичности. Мукозальный иммунол. 13, 12-21. 10,1038/с41385-019-0227-4.

Паркс Д.Х., Чувочина М., Уэйт Д.В., Ринке К., Скаршевски А., Шомейль П.А. и Гугенхольц П. (2018). Стандартизированная таксономия бактерий, основанная на филогении генома, существенно пересматривает древо жизни. Нат. Биотехнология. 36, 996-+. 10.1038/нбт.4229.

Патро Р., Дуггал Г., Лав М.И., Иризарри Р.А. и Кингсфорд К. (2017). Salmon обеспечивает быструю количественную оценку экспрессии транскриптов с учетом предвзятости. Нат. Методы 14, 417-+. 10.1038/нмет.4197.

Педрегоса Ф., Варокво Г., Грамфор А., Мишель В., Тирион Б., Гризель О., Блондель М., Преттенхофер П., Вайс Р., Дюбур В., и другие. (2011). Scikit-learn: машинное обучение на Python. J Mach Learn Res 12, 2825-2830.

Пиз Э., Хейсамен К., Маршалл А.С., Гордон С., Тейлор П.Р. и Браун Г.Д. (2008). Характеристика мышиного MICL (CLEC12A) и доказательства наличия эндогенного лиганда. Евро. Дж. Иммунол. 38, 1157-1163. 10.1002/eji.200738057.

Раульф М.К., Йоханнссен Т., Маттизен С., Нейман К., Хахенберг С., Майер-Ламбертц С., Штайнбайс Ф., Хегерманн Дж., Зеебергер П.Х., Баумгартнер В., и другие. (2019). Рецептор лектина С-типа CLEC12A распознает плазмодийный гемозоин и способствует развитию церебральной малярии. Клетка Rep. 28, 30-38 e35. 10.1016/j.celrep.2019.06.015.

Рэй А. и Диттель Б.Н. (2015). Взаимосвязь дисбиоза микробиоты кишечника вследствие иммунодефицита и пенетрантности колита. Иммунология 146, 359-368. 10.1111/имм.12511.

Ределингхейс П., Уайтхед Л., Огелло А., Драммонд Р.А., Левеск Дж.М., Вотье С., Рид Д.М., Кершер Б., Тейлор Дж.А., Нигрович П.А. и др. (2016). MICL контролирует воспаление при ревматоидном артрите. Анна. Реум. Дис. 75, 1386-1391. 10.1136/annrheumdis-2014-206644.