Клонирование, функциональная идентификация и анализ экспрессии халконсинтазы из Cistanche Tubulosa Ⅱ

3 Результаты и анализ

3.1 Клонирование гена CtCHS

Четыре последовательности, обозначенные как «халконсинтаза», были отобраны с использованием данных транскриптома цветков Cistanches Tubeulosa. С помощью сравнения Blast NCBI было обнаружено, что только одна последовательность имела полную длину гена CHS и имела FPKM более 10. На основе этой последовательности были разработаны специальные праймеры, а фрагмент длиной около 1200 п.о. был получен с помощью ПЦР-амплификации с использованием кДНК цветка цистанчи трубчатой ​​в качестве матрицы (рис. 1). Продукт ПЦР извлекали из геля и соединяли с вектором pCE2TA/Blunt-Zero. Результаты секвенирования соответствовали результатам транскриптомного анализа. Ген получил название CtCHS. Длина последовательности составляет 1173 п.о. и кодирует 390 аминокислот.

Служба поддержки Wecistanche — крупнейшего экспортера цистаншей в Китае:

Электронная почта:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Телефон:+86 15292862950

Магазин для получения дополнительных технических характеристик:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

3.2 Биоинформатический анализ CtCHS

3.2.1 Физические и химические свойства CtCHS и анализ трансмембранных доменов

Онлайн-программа ProtParam использовалась для анализа физических и химических свойств белка, кодируемого геном CtCHS. CtCHS кодирует 390 аминокислот, молекулярная формула C1908H3041N511O562S22, относительная молекулярная масса 42 836,54, теоретическая изоэлектрическая точка 5,85, он нестабилен. Коэффициент II равен 43,24, что соответствует нестабильному белку, а общая средняя гидрофильность (GRAVY) равна -0,052, что соответствует гидрофильному белку. Онлайн-инструмент Prot Scale далее использовался для анализа гидрофильности/гидрофобности белка. Результаты анализа показали, что максимальное значение гидрофильности/гидрофобности белка CtCHS составило 2,422 (342), а минимальное значение - -2,489 (119). Аминокислотная пептидная цепь, кодируемая геном CtCHS, имеет больше гидрофильных аминокислотных остатков, чем гидрофобных аминокислотных остатков, поэтому это гидрофильный белок. Онлайн-программное обеспечение TMHMM использовалось для прогнозирования трансмембранной структуры белка. Белок CtCHS не имеет трансмембранного домена.

Рис. 1. ПЦР-амплификация гена CtCHS.

3.2.2 Прогнозирование вторичной и третичной структуры белка CtCHS

Онлайн-инструмент SOPMA использовался для прогнозирования вторичной структуры белка. Результаты показаны на рисунке 2-A. Вторичную структуру белка CtCHS составляют 44,87% -спирали, 31,03% случайные клубки, 15,64% - вытянутые цепи и 8,46% -листы. уровневая структура. Программное обеспечение онлайн-анализа SWISS-MODEL использовалось для прогнозирования третичной структуры белка, а кристаллическая структура рисового CHS1 использовалась в качестве матрицы для прогнозирования трехмерной структуры белка CtCHS. Результаты показаны на рисунке 2-B. Консистенция CtCHS Cistanche Tubeulosa и CHS1 риса составляет 83,55%.

3.2.3 Сравнение последовательностей, анализ и применение филогенетического дерева

Программное обеспечение DNAMAN выполняет сравнение гомологии между CtCHS и аминокислотными последовательностями CHS других видов. Результаты показаны на рисунке 3-C. Аминокислотная последовательность CtCHS соответствует Sesamum indicum L. (XP_011091402.1) и Antirhinum majus L. (P06515.1), Mazus pumilus (NL Burman)Steenis (AAN05791.1), Erythranthe lewisiiG. L. Nesom & NS Fraga (AHJ80976.1), Perilla frutescens (L.) Britton (O04111.1) и Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (НП_196897.1). Аминокислотные последовательности CHS очень схожи: сходство составляет 90,93%, 90,68%, 90,18%, 89,42%, 89,42% и 81,61%.

НАТУРАЛЬНЫЙ ОРГАНИЧЕСКИЙ ЭКСТРАКТ ЦИСТАНШИ С 30% ЭХИНАКОЗИДА И 12% АКТЕОЗИДА

Кроме того, множественное выравнивание последовательностей также показало, что CtCHS имеет консервативные каталитические остатки Cys164, His303 и Asn336. Чтобы лучше понять эволюционное положение Cistanche Tubeulosa CtCHS в семействе CHS растений, с помощью программного обеспечения MEGA-X было построено филогенетическое дерево между белками CtCHS и CHS других растений. Результаты показаны на рисунке 3-DE lewisii AHJ80976.1). ElCHS тесно связан.

3.3 Прокариотическая экспрессия и очистка CtCHS

Плазмиду pET-28a-CtCHS трансформировали в экспрессирующий штамм E. coli BL21 (DE3), и экспрессию белка индуцировали IPTG при низкой температуре. Белок очищали, используя колонку для аффинной хроматографии с ионами никеля, и очищенный белок детектировали с помощью 10% SDSPAGE. Результаты показаны на рисунке 3. Полоса белка CtCHS появилась около 40,000, что соответствует относительной молекулярной массе белка CtCHS, равной 42 800.

3.4 Анализ активности фермента CtCHS

Чтобы определить функцию CtCHS, очищенный белок CtCHS инкубировали с малонил-КоА, 4-кумароил-КоА и продукты детектировали с помощью ВЭЖХ и МС. В природных условиях нарингенин-халкон неустойчив в растворе и легко циклизуется в нарингенин. Поэтому нарингенин-халкон и нарингенин были выбраны в качестве стандартного контроля.

Результаты теста ВЭЖХ показаны на рисунках 4-A и B. Время удерживания продукта ферментативной реакции аналогично времени удерживания стандарта нарингенина. Оба имеют максимальное поглощение при 289 нм в УФ-спектре поглощения, что отличается от времени удерживания нарингенин-халкона. Временные и УФ-спектры поглощения были разными, но в качестве отрицательного контроля продукт после инкубации высокотемпературно-инактивированного белка CtCHS с субстратом не содержал нарингенин, халкон и нарингенин. Дальнейшее обнаружение с помощью масс-спектрометрии, масс-спектр первого уровня (рис. 4-C, D) показало, что продукт ферментативной реакции имеет [MH]-пик m/z271.060 97, тогда как нарингенин имеет [MH]-пик m/z271.060 97. ]-пик m/z 271.060 91.

Сравнивая спектры MS2 (рис. 5-E, F), продукт ферментативной реакции CtCHS и нарингенин имеют характерные пики фрагментов при m/z 107, 151 и 177, что согласуется с литературным сообщением [19], что указывает на то, что CtCHS имеет халконовый комплекс. Ферментативная активность: он может катализировать реакцию малонил-КоА и 4-кумароил-КоА с образованием нарингенин-халкона.

3.5 Анализ субклеточной локализации

Для изучения роли белка CtCHS в клетках была сконструирована плазмида pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS, которая трансформирована в протопласты Arabidopsis thaliana для наблюдения за ее субклеточной локализацией. Результаты показаны на рисунке 5. В качестве контроля белок pCAMBIA1300-35S-GFP был распределен в ядре и цитоплазме, тогда как слитый белок pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS был в основном распределен в цитоплазме, что указывает на то, что белок CtCHS может функционировать в цитоплазме растительных клеток. Функция.

3.6 Анализ структуры экспрессии CtCHS

qRT-PCR использовали для обнаружения относительной экспрессии CtCHS в цветках Cistanche Deserticola трех цветов: белого, фиолетового и красного. Результаты показаны на рисунке 6. Экспрессия CtCHS в фиолетовых и красных цветках была значительно выше, чем в белых цветах. количество. По сравнению с белыми цветками уровень экспрессии CtCHS в фиолетовых цветках выше в 8,44 раза, а уровень экспрессии CtCHS в красных цветках выше в 3,21 раза. Эти результаты показывают, что изменения уровня экспрессии CtCHS могут быть связаны с разницей в окраске цветков Cistanche Deserticola. Чем выше уровень экспрессии, тем темнее цвет цветка. , чем ниже уровень экспрессии, тем светлее цвет цветка.

****P＜0.000 1Рис. 6 Относительный уровень экспрессии CtCHS в цветках разной окраски

4. Дискуссия

CHS - этоКлючевой фермент в пути биосинтеза флавоноидови связано с этимРегулирование цвета цветкаво многих растениях. Например, цвет цветкаГвоздика китайскаяЛ.[20] и Петуния × гибрида Хорт. бывший Вилм.[22] все затронуты CHS. контроль.Цистанхи трубчатыев основном имеет три цвета цветов: белый, красный и фиолетовый, но о механизме регулирования цвета цветов еще не сообщалось. В этом исследовании ген CtCHS был клонирован с помощью RT-PCR черезанализ транскриптомных данных цветков Cistanches Tubeulosa, И его

Биоинформатический анализБыло проведено исследование, и результаты показали, что CtCHS имеет высокое сходство и тесное генетическое родство с аминокислотной последовательностью ElCHS Physalis nigra (AHJ80976.1). CHS представляет собой поликетидсинтазу III типа (PKSIII), и исследования показали, что CHS имеет консервативную каталитическую триаду Cys-His-Asn [23]. В этом исследовании анализ выравнивания аминокислотных последовательностей показал, что CtCHS имеет консервативные каталитические остатки Cys164, His303 и Asn336, что указывает на то, что CtCHS может выполнять типичную функцию халконсинтазы.

способный. Анализ ферментативной активности проводили с использованием прокариотической экспрессии белка CtCHS в Escherichia coli и детектировали методами ВЭЖХ и МС. Было обнаружено, что белок CtCHS может катализировать 4-кумароил-КоА и малонил-КоА с образованием нарингенин-халкона.

CHS участвует в синтезе флавоноидов у многих растений, однако его внутриклеточное расположение у разных видов различно. Например, Carthamustinctorius L. CtCHS1[24], Morus atropurpurea Roxb. MaCHS[25], Eupatorium adenophorum Spreng. Все EaCHS[26] расположены в цитоплазме, тогда как Paeonia delavayi var. lutea (Delavay ex Franch.) Finet et Gagnep. ПДЧС

[27], у баклажана Solanum melongena L. SmCHS [28] локализован в цитоплазме и ядре, а у винограда Vitis vinifera L. VvCHS локализован в цитоплазме, ядре и клеточной стенке [29]. В этом исследовании плазмиду pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS использовали для трансформации протопластов Arabidopsis thaliana, и было обнаружено, что белок CtCHS в основном локализован в цитоплазме и может катализировать выработку нарингенин-халкона в цитоплазме для способствуют накоплению флавоноидов.

Фенилпропаноидный путь разветвляется от 4-кумароил-КоА на путь синтеза флавоноидов и путь биосинтеза лигнанов. CHS катализирует 4-кумароил-КоА и малонил-КоА с образованием нарингенина и халкона для инициации флавоноидов. Путь биосинтеза соединений подобного типа является первым ключевым ферментом этого пути [30]. Следовательно, высоковыраженный CHS полезен для растений, поскольку позволяет накапливать более высокие уровни флавоноидов и производить более темные цветы. Например, уровень экспрессии CHS у пурпурноцветковых сортов Hosta plantaginea (Lam.) Aschers выше, чем у белоцветковых сортов. Хоста HpCHS трансформируется в табак для получения. По сравнению с табаком дикого типа, растения со сверхэкспрессией имеют более темные лепестки и более высокое общее содержание антоцианов [31].

В этом исследовании уровень экспрессии гена CtCHS связан с цветом цветков Cistanches Tubeulosa. Он сильно выражен в темно-фиолетовых и красных цветках и слабо выражен в светлых белых цветках. Разница в экспрессии CtCHS может быть связана с различиями в цветках Cistanches Tubeulosa. Одна из причин наличия разных костюмов и цветов. Таким образом, в этом исследовании клонировали ген CtCHS из цветов Cistanche Deserticola и провели его биоинформатический анализ. Рекомбинантный белок CtCHS был получен путем экзогенной экспрессии в Escherichia coli. Анализ ферментативной активности показал, что белок CtCHS может катализировать 4-кумароил-кофермент. А и малонил-коэнзим А образуют нарингенин-халкон. Было обнаружено, что ген CtCHS высоко экспрессируется в фиолетовых и красных цветках и низко экспрессируется в белых цветках. Эти результаты показывают, что ген CtCHS может регулировать образование цветов различной окраски у Cistanche Deserticola, что полезно для дальнейших исследований механизма регуляции окраски цветков Cistanche Tubeulosa и дает основу для последующих исследований роли CtCHS в регуляции цвет цветка Cistanche Deserticola.