Анализ состава и иммунологической активности олигосахаридов, выделенных из Cistanche Deserticola

Контактное лицо: emily.li@wecistanche.com

Абстрактный.Олигосахарид (CDOS) был получен изЦистанхе пустыннаящелочной (pH{{0}}} экстракцией, осаждением этанолом и фракционированием на две очищенные фракции (т.е. CDOS-1 и CDOS-2) с помощью сефадекса G-100 и колоночной фильтрационной хроматографии на Sephadex G-25. Моносахаридный состав CDOS анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Было обнаружено, что CDOS-1 состоит только из сахарозы, а CDOS-2 в основном состоит из сахарозы, рамнозы и маннита с мольным соотношением 1:0,73:3,61. Иммунологические тесты показали, что CDOS оказывает значительное влияние на индекс селезенки мыши, повышая фагоцитарную активность макрофагов и стимулируя пролиферацию антителопродуцирующих клеток. Есть надежда, что CDOS превратится в функциональное питание или лекарство.

Ключевые слова:Цистанхепустыня, олигосахарид, очистка, состав, иммунологическая активность.

Цистанхе пустынная имеет много эффектов, нажмите здесь, чтобы узнать больше

1. Введение

Цистанхепустынная YCMa. (семейство Orobanchaceae) — низкорослое паразитическое растение, произрастающее на северо-западе Китая. Целое высушенное растение (без цветков) известно как тонизирующее средство и называется «Rou Congrong». В восточной медицине оно классифицируется как сладкое и соленое на вкус, согревающее по своей природе и относящееся к каналам почек и толстой кишки, с функциябодрящийвпочкаи дополняющая эссенция, увлажняющая кишечник и расслабляющая кишечник [1]-[3]. Современные фармакологические исследования показали, что он может стимулировать синтез ДНК и отсрочивать процесс старости, усиливать антиоксидантное действие [4], предотвращать и лечить сердечно-сосудистые заболевания [3]. Кроме того, он также может оказывать обезболивающее ианти-воспалительныйэффекты [5], улучшают обучение и память, индуцируя факторы роста нервов [6]. Некоторые исследования показали, что экстракты C. Deserticola могут активировать фагоцитарную функцию внутрибрюшных макрофагов у мышей [7]-[9] иулучшитьтело's иммунитет[10]. Согласно предыдущим исследованиям, это растение содержит несколько активных компонентов, включая фенилэтаноидные гликозиды, иридоиды, лигнаны, сахариды, алкалоиды и т. д. [11] Поскольку C.пустыняфенилэтаноидгликозидыи полисахариды признаны основными активными компонентами, многочисленные исследования были сосредоточены на их структуре и биологической активности в течение последних десятилетий [12]-[17]. Что касается ценных олигосахаридов вС. пустынный, отчеты весьма ограничены. Олигосахариды, сахариды с короткой цепью, содержащие гомо- или гетеросахариды, хорошо известны своим благотворным влиянием на жизнь человека и широко используются в течение длительного времени [18]. Функциональные олигосахариды, обладающие такой физиологической функцией, как низкая кариесогенность и фактор роста бифидобактерий [19], улучшают здоровье человека и животных. Они были использованы в качестве пищевого ингредиента. Недавно сообщалось о новых функциях олигосахаридов, обладающих способностью модулировать иммунную систему человека, животных и рыб [20]. В этой статье мы сообщаем первую часть результатов исследовательской программы, фракционирование суммарных олигосахаридов, полученных из щелочного экстракта C. Deserticola путем сочетания ультрафильтрации и гель-проникающей хроматографии, и анализ их состава методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Кроме того, мы также представляем иммунологическую активность олигосахаридов C. Deserticola. Насколько нам известно, опубликовано несколько отчетов об исследованиях иммуностимулирующей активностиС. пустынныйолигосахариды.

2. Экспериментальный

2.1. Материалы

C. Deserticola выращивали и собирали в Алха Лиге (Внутренняя Монголия, Китай). Мыши Куньмин (класс II, возраст шесть недель) были приобретены в Фармакологическом экспериментальном центре Университета Внутренней Монголии. Сефадекс G-100, Сефадекс G-25, трифторуксусная кислота (TFA), 1-фенил-3-метил-5- пиразолон (PMP), D-глюкоза, D- галактозу, D-фруктозу, D-ксилозу, D-маннозу, D-галактуроновую кислоту, D-глюкуроновую кислоту, сахарозу, рамнозу, маннит, фукозу, рамнозу приобретали у Sigma (Сент-Луис, Миссури, США). Среду RPMI-1640 приобретали у Gibco Invitrogen Co. (Сан-Диего, Калифорния, США). Все остальные химические вещества были аналитической чистоты.

2.2. Экстракция олигосахаридов

Высушенные тела C. Deserticola нарезали на более мелкие кусочки и далее измельчали ​​в порошок на мельнице, экстрагировали безводным этанолом (3×5000 мл) при 70° в течение 3 ч при атмосферном давлении. Для удаления липидов устанавливали обратный холодильник. Остаток затем экстрагировали щелочью (pH=10) при 60° 3 раза (каждый раз по 2 часа). После центрифугирования (2000 g в течение 15 мин, при 20°) надосадочную жидкость концентрировали до одной десятой объема в роторном испарителе при пониженном давлении при 50° и фильтровали. Затем фильтрат депротеинизировали реактивом Севага [21] и обесцвечивали активированным углем.

2.3. Выделение и очистка олигосахаридов

Лиофилизированные сырые олигосахариды растворяли в дистиллированной воде, центрифугировали, а затем супернатант очищали на колонке с сефадексом G-100 (1×50 см), уравновешивая сверхчистой водой. После загрузки образца колонку элюировали сверхчистой водой со скоростью потока 5 мл/мин. Различные фракции собирали с помощью пробирок. Общее содержание углеводов в каждой пробирке измеряли при 490 нм методом фенол-H2SO4 [22]. Элюированный водой раствор разделяли на две фракции CDOS-1 и CDO-2. Две фракции дополнительно очищали соответственно на колонке Sephadex G-25 (2,7×85 см) с использованием сверхчистой воды (при скорости потока 1 мл/мин). После сбора очищенной фракции ее лиофилизировали.

2.4. Анализ моносахаридного состава

Моносахаридный состав CDO определяли анализом ВЭЖХ. CDO (2 мг) гидролизовали сначала безводным метанолом, содержащим 2 М HCl, при 80 градусах в течение 16 часов в атмосфере азота, а затем с 2 М ТФУ при 120 градусах в течение 1 часа. После удаления ТФУ выпариванием гидролизаты впоследствии дериватизировали ПМП в соответствии с описанным методом [23] и анализировали с помощью ВЭЖХ. ВЭЖХ-разделение проводили на ВЭЖХ-системе EF{8}} (фирма KNAUER, Германия). Производные ПМП хроматографировали с использованием объема Sugar-PAK (6,5×300 мм, компания Glass of Water, Америка) и измеряли оптическую плотность при 245 нм. Объем инъекции составлял 20 мкл, а подвижную фазу, состоящую из PBS (растворитель А) и ацетонитрила (растворитель В), использовали для изократического элюирования при объемном соотношении 82 процента (А) к 18 процентам (В). Общее время выполнения ВЭЖХ составляло 40 мин, а скорость потока составляла 0,5 мл/мин.

2.5. Иммунобиологическая активность

2.5.1. Фагоцитарная функция моноцитов-макрофагов

Шестьдесят мышей Куньмин (степень II, возраст шесть недель) были приобретены в Фармакологическом экспериментальном центре Университета Внутренней Монголии и акклиматизированы в течение 1 недели перед использованием. Всех мышей случайным образом разделили на четыре группы, состоящие из контрольной группы с физиологическим раствором, группы с высокой дозой CDO, группы со средней дозой и группы с низкой дозой CDO. Мышам вводили внутрибрюшинно 0,5 мл раствора олигосахаридов один раз в день в течение 5 дней. Группа с высокой, средней или низкой дозировкой CDO получала 10{{10}}, 50 или 25 мг/кг/мт CDO соответственно; контрольной группе вводили 0,5 мл физиологического раствора. На седьмой день проводили эксперимент по очистке от углеродных частиц по Хоу [24] и измеряли индексы селезенки и тимуса. Вкратце, 0,05 мл/10 г/масса туши инъецировали каждой мыши через каудальную вену, затем 20 мкл крови получали из задней орбитальной вены через 3 и 7 минут после инъекции. Образцы крови помещали в пробирки с 2 мл 0,1% Na2CO3 и измеряли значения оптической плотности при 600 нм. Индекс клиренса (К), фагоцитарный индекс ( ) и индекс иммунных органов рассчитывали следующим образом (1), t2 и t1 означают 7 минут и 3 минуты соответственно.

2.5.2. Пролиферация клеток, продуцирующих антитела

Группы мышей Kunming (по пять на группу) иммунизировали внутрибрюшинной инъекцией 2×107 SRBC в 1,0 мл PBS с добавлением 50 мкг испытуемых материалов (в контроле ничего не было). Неделю спустя спленоциты (106 клеток на 2 мл на лунку) от мышей Kunming культивировали с тестируемыми материалами или без них в течение 72 ч в 10-процентной среде RPMI 1640 при 5-процентном СО2 в воздухе, в трех повторах для каждой культуры. Определяли количество ПФК против СРБК на 106 спленоцитов [25], [26].

2.6. статистический анализ

Данные выражали в виде средних значений ±SD. Разницу между тестируемыми группами и контролем анализировали с помощью t-критерия Стьюдента. P < 0.05="" считалось="">

3. Результаты и обсуждение

3.1. Выделение и очистка олигосахаридов

CDO были выделены из щелочного экстракта высушенных тел C. Deserticola с выходом 3,07%. Две фракции CDOS-1 и CDOS-2 были выделены из элюата дистиллированной водой на колонке с сефадексом G-100 соответственно (рис.1). Очищенные фракции CDOS-1 и CDOS-2 показали один пик на колонке Sephadex G-25, что указывает на отсутствие в образце других олигосахаридов. Результаты моносахаридных композиций показали, что CDOS-1 состоит только из сахарозы (рис. 2), а CDOS-2 в основном состоит из сахарозы, рамнозы и маннита (рис. 3) с молярным соотношением 1:0,73:3,61.

3.2. Иммунобиологическая активность CDO

Многие данные in vivo и in vitro продемонстрировали, что природные олигосахариды проявляют иммуномодулирующую функцию, стимулируя как клеточные, так и гуморальные клетки.иммунный ответы[27], [28]. В этой статье 100 мг/кг/мт CDO увеличивали индекс селезенки у мышей, но не было существенных различий в индексе тимуса между обработанными группами и контрольными группами (таблица 1). Макрофаги являются важным компонентом защиты хозяина от вирусной инфекции путем ингибирования внутриклеточной репликации вирусов и уничтожения инфицированных вирусом клеток [29]. При активации из макрофагов высвобождаются различные промежуточные соединения кислорода или азота и цитокины, которые участвуют в различных важных биологических функциях, таких как противовоспалительная и противоопухолевая активность [30]-[32]. Поэтому фагоцитарная активность макрофагов является важным показателем иммунных функций организма. В этом исследовании умеренные и высокие дозы CDO повышали фагоцитарную активность макрофагов (таблица 1). Пролиферацию клеток, продуцирующих антитела, индуцированную CDO, изучали путем изучения увеличения гемолитической PFC в селезенке мышей Kunming, которые были иммунизированы SRBC плюс испытуемый образец. Результаты показали, что умеренные и высокие дозы CDO значительно усиливают пролиферацию клеток, продуцирующих антитела (таблица 2). Высокие дозы CDO вызывали очень значимое увеличение количества префронтальной коры (P <>

использованная литература

[1] Дж. Ли, Ю. Цзян, Р. Фан. Распознавание биологического сигнала, смешанного на основе вейвлет-анализа. В: Ю. Цзян и др. (ред.). проц. британско-китайской мастерской спортивной инженерии. Ливерпуль: Всемирный академический союз. 2007 г., стр. 1-8.

[2] J. Ouyang, XD Wang, B. Zhao, et al. Влияние редкоземельных элементов на рост клеток Cistanche Deserticola и продукцию фенилэтаноидных гликозидов. JB io-technol, 2003, 102 (2): 129-134

[3] Сюй Чжаохуэй, Ян Цзюньшань, Лу Руимянь и др. Новый натуральный продукт от Cistanche Deserticola YCMA. Журнал китайских фармацевтических наук, 1999 г., 8(2):61-63.

[4] X. Wang, L. Li, Muhuyati, X. Wanag, N. Du. Антиоксидантное действие гликозидов Цистанхе в тканях мышей. Чжунго Чжун Яо За Чжи. 1998, 23(9):554-5.

[5] Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu C. Антиноцицептивная и противовоспалительная активность, вызванная Cistanche Deserticola у грызунов. J Этнофармакол. 2002, 83(3):177-82.

[6] Чой, Дж. Г.; Луна, М; Чон, ХУ; Ким, МС; Ким, С.Ю.; О, MS Cistanches Herba улучшает обучение и память, индуцируя фактор роста нервов. Поведенческие исследования мозга. 2011, 216 (2): 652–658.

[7] Zong G, He W, Wu G, Chen M, Shen X, Shi M. Сравнение между Cistanche Deserticola YC Ma и C, tubulosa (Shenk) Wight по некоторым фармакологическим действиям. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1996, 21(7):436-7.

[8] He W, Shu XF, Zeng GZ и др. Изучение усиления половой потенции C. Deserticola. J Chin Med.1996, 21(9): 534- 537.

[9] Zeng GZ, He W, Wu GL, et al. Сравнений между Cistanche Deserticola YC Ma и C.tubulosa масса по некоторым фармакологическим действиям. Дж. Чин Мед. 1996, 21(7): 436-438.

[10] Цзэн К.Л., Чжэн Ю.Ф., Лу З.Л. Иммуномодулирующие эффекты полисахарида Cistanche Deserticola YC Ma. J Zhejiang Univ, Med Sci. 2002, 31(4): 284- 287.

[11] Ли Юань, Сун Юаньюань, Чжан Хунцюань. Успехи в исследованиях химических компонентов и лекарственной активности цистанхе. Ресурсы дикорастущих растений Китая, 2010 г., 29(1):7-11.

[12] Du NS, Wang H, Yi YH. Выделение и идентификация фенилэтаноидных гликозидов из Cistanche Deserticola. Nat Prod R&D, 1993, 5(4): 5- 8.

[13] Лу Н.С., Лю Дж.Л. Определение фенилэтаноидных гликозидов в цистанхе пустынном методом спектрофотометрии макроретикулярной смолы. Nat Prod R&D, 1993, 5(3): 30-33.

[14] Xiong QB, Tezuka Y, Kaneko T, et al. Ингибирование оксида азота фенилэтаноидами в активированных макрофагах.

Европейский журнал фармакологии, 2000, 400: 137- 144.

[15] Чжао Вэй, Ян Хун, Лян Чжун-Ян и др. Структурный анализ водорастворимого полисахарида SPA, выделенного из стебля Cistanche Deserticola Ma. Химический журнал китайских университетов, 2005 г., 26 (3): 461-463.

[16] Ван Сянъянь. Исследование иммунной фармакологии и характера абсорбции полисахаридов Cistanche Deserticola. 2011 г., № S1, Медицина и медицинские науки, E057-235-1-70.

[17] Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. Гепатопротекторная активность фенилэтаноидов из Cistanche Deserticola. Планта Мед. 1998, 64(2):120-5.

[18] Справочник по амилазам и родственным ферментам (под редакцией Японского общества исследования амилаз), Pergamon Press (1988).

[19] Арая, С. (ред.) Материалы 5-й конференции по кариесу зубов и связывающему сахару (на японском языке), Национальный институт здравоохранения, Токио (1980 г.)

[20] Кодо Отака. Функциональный олигосахарид и его новый аспект иммуномодуляции. Дж. Биол. макромол. 2006, 6(1), 3-9.

[21] Наварини Л., Гилли Р., Гомбак В., Абатанжело А., Боско М., Тоффанин Р. Полисахариды из экстрактов горячей воды жареных зерен кофе арабика: выделение и характеристика. углевод. Полим.1999, 40:71–81.

[22] Дюбуа М., Жиль К.А., Гамильтон Дж.К., Реберс П.А., Смит Ф. Колориметрический метод определения сахаров и родственных им веществ. Анальный. хим. 1956, 28: 350–356.

[23] Yang X, Zhao Y, Wang Q, Wang H, Mei Q. Анализ моносахаридных компонентов полисахаридов дягиля с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Анальная наука. 2005, 21:1177–1180.

[24] Юфанг Хоу, Юбао Хоу, Лю Яньян и др. Экстракция и очистка лектина из красной фасоли и предварительные исследования иммунной функции лектина и четырех полисахаридов китайских трав. Журнал биомедицины и биотехнологии, 2010 г.: 1-9.

[25] Каннингем, А.Дж., и А. Зенберг. Дальнейшие улучшения в методе бляшек для обнаружения одиночных клеток, образующих антитела. Иммунология. 1968, 14:599-600.

[26] Харухико Такада, Томохико Огава, Фуминобу Йошимура и др. Иммунобиологическая активность пориновой фракции, выделенной из Fusobacterium nucleatum ATCC 10953 [J]. Инфекция и иммунитет. 1988, 56(4): 855-863.

[27] Wang MQ, Guilbert LJ, Ling L, Li J, Wu YQ, Xu SR, Pang P, Shan JJ Иммуномодулирующая активность CVT-E002: запатентованный экстракт североамериканского женьшеня (Panax quinque folium). J Pharm Pharmacol.2001, 53:1515–1523.

[28] Nergard CS, Kiyohara H, Reynolds JC, Thomas-Oates JE, Matsumoto T, Yamada H, Patel T, Petersen D, Michaelsen TE, Diallo D, Paulsen BS Структуры и отношения структура-активность трех митогенных и связывающих комплемент пектиновые арабиногалактаны малийских противоязвенных растений Cochlospermum tinctorium A. Rich и Vernonia kotschyana Sch Bip. бывший Уолп. Биомакромолекулы. 2006, 7:71–79.

[29] Э.-М. Чой, А.-Дж. Ким, Ю.-О. Ким и Ж.-К. Хван, Иммуномодулирующая активность арабиногалактана и фукоидана in vitro. Журнал лечебной еды. 2005, 8(4):446–453.

[30] Ю. Чен, Дж.-А. Дуан, Д. Цянь и др. Оценка и сравнение иммунорегуляторной активности четырех водорастворимых фракций дягиля китайского in vitro на перитонеальные макрофаги мышей ICR. Международная иммунофармакология. 2010, 10:422–430.

[31] YS Lee, OK Han, CW Park, et al. Экспрессия генов провоспалительных цитокинов и регуляция оксида азота водным экстрактом корня астрагала в клетках макрофагов RAW 264.7. Журнал этнофармакологии. 2005, 100(3): 289–294.

[32] KY Lee и YJ Jeon. Полисахарид, выделенный из Poria cocos sclerotium, индуцирует активацию NF-κB/Rel и экспрессию iNOS в мышиных макрофагах. Международная иммунофармакология. 2003, 3 (10-11): 1353–1362.