Часть 2|Актеозид подавляет RANKL-опосредованный остеокластогенез, ингибируя индукцию C-Fos и путь NF-kB, а также ослабляя продукцию АФК
Mar 06, 2022
Для получения дополнительной информации свяжитесь с ali.ma@wecistanche.com
Часть 2|Как актеозиды способствуют росту костей?
Click to Cistanches с актеозидом
Обсуждение
Ремоделирование кости жестко регулируется балансом между формированием кости остеобластами и резорбцией кости остеокластами. Длительная и чрезмерная резорбция костной ткани вызывает дисбаланс метаболизма скелета, что приводит к костно-резорбтивным заболеваниям. Для изучения эффектовактеозидпри остеокластогенезе мы использовали два макрофага, первично культивированные BMM и клетки RAW264.7. Эти клетки стимулировали с помощью RANKL для дифференцировки в остеокласты в присутствии и в отсутствиеактеозид. Мы впервые показали, чтоактеозидингибирует дифференцировку и образование остеокластов.актеозидсам по себе в исследованных концентрациях не вызывал снижения жизнеспособности первично культивируемых макрофагов как в условиях роста, так и в условиях дифференцировки.актеозидлечение также снижало резорбционную активность зрелых остеокластов. Эти результаты свидетельствуют о том, что актеозид подавляет образование остеокластов из макрофагов и резорбционную активность остеокластов. Результаты нашей системы культивирования, которая не включала остеобласты или стромальные клетки, также предполагают, что актеозид предотвращает образование остеокластов, непосредственно действуя на предшественники остеокластов. RANKL активирует MAPK, включая p38, ERK и JNK. Эти три киназы участвуют в ранней дифференцировке остеокластов и, таким образом, их ингибирование фармакологически или с помощью доминантно-негативной трансфекции JNK подавляет RANKL-индуцированный остеокластогенез [29]. Наши результаты показали, чтоактеозидпредварительная обработка ингибировала все эти киназы, указывая на неспецифическое подавление МАРК. Этот результат частично отличался от предыдущего отчета о том, что EGCG, основное противовоспалительное соединение в зеленом тройнике, специфически ослаблял активацию JNK, не влияя на активацию p38 в RANKL-стимулированных BMM [7]. Сообщалось также, что паэонол, противовоспалительное соединение, полученное из китайской травы, ингибирует ERK и p38, но не нежелательное фосфорилирование в RANKL-стимулированных клетках RAW264.7 [30]. Напротив, силибинин, новый ингибитор в костях, ослаблял ранг-индуцированную активацию p38, ERK и JNK [31]. Эти данные свидетельствуют о том, что эффекты антирезорбтивных соединений на активацию MAPK с помощью RANKL зависят от соединения, хотя все три MAPK участвуют в раннем остеокластогенезе. Принимая во внимание наблюдение, что актеозид ослаблял уровни p-JNK в RANKL-стимулированных BMM, даже при 1 мм, блокада JNK, а не p38 MAPK или ERK, оказалась более специфическим событием вактеозид-опосредованный антиостеокластогенез в клетках. Хотя актеозид в той же концентрации не уменьшал количество остеокластов в BMM, наблюдалось значительное уменьшение образования ямок при обработке актеозидом. Мы также обнаружили, что предварительная обработка SP600125, фармакологическим ингибитором, специфичным для JNK, резко предотвращала образование остеокластов (данные не показаны). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что передача сигналов, опосредованная JNK, тесно связана с опосредованным актеозидами подавлением остеокластогенеза, стимулируемым RANKL. Передача сигналов NF-kB регулирует клеточные события, включая апоптоз, прогрессирование клеточного цикла, клеточную адгезию, продукцию цитокинов и выживание в макрофагах [32]. Передача сигналов NF-kB также необходима для развития остеокластов, что было продемонстрировано появлением остеопетроза у мышей с нокаутом NF-kB [33,34]. Таким образом, предполагается, что ингибирование NF-kB является эффективной мишенью для антирезорбтивных агентов для подавления активности остеокластов и лечения остеопороза. Посттрансляционная модификация белков подсемейства NF-kB имеет решающее значение для модулирования активности NF-kB. В частности, фосфорилирование субъединицы p65 и киназы IkB имеет решающее значение для NF-kB, чтобы индуцировать остеокластогенез [7]. Наши настоящие результаты показали, что стимуляция RANKL увеличивала ДНК-связывающую активность NF-kB и фосфорилирование субъединицы p65 и Ikea как в клетках BMM, так и в клетках RAW264.7. Предварительное лечение актеозидом ингибировало это RANKL-индуцированное увеличение, что приводило к снижению активности NF-kB. Следовательно, эти результаты предполагают, что, в дополнение к MAPK, передача сигналов NF-kB является основной целью актеозида при ингибировании дифференцировки остеокластов и образования из макрофагов, стимулированных RANKL. В дополнение к передаче сигналов NF-kB, путь c-Fos/c-Jun/NFATc1 играет ключевую роль в развитии остеокластов, поэтому отсутствие любого из этих белков может остановить остеокластогенез [35,36]. В этом исследовании мы обнаружили, что актеозид предотвращает RANKL-индуцированную экспрессию c-Fos и NFATc1 на уровне мРНК и белка. JNK представляет собой восходящую киназу c-Jun, которая необходима для экспрессии NFATc1 и остеокластогенеза в ответ на RANKL [29]. . Блокирование пути JNK/c-Jun с помощью ингибитора JNK уменьшало RANKL-индуцированное образование остеокластов и экспрессию c-Fos и NFATc1 [7]. Наши результаты и предыдущие данные свидетельствуют о том, что ингибирование JNK-опосредованной передачи сигналов актеозидом тесно связано с предотвращением RANKL-опосредованной c-Fos и NFATc1.
экспрессия, которая подавляет дифференцировку остеокластов в макрофагах. Различия в эффектахактеозидна клетках BMM и RAW264.7, по крайней мере, частично из-за различий в чувствительности к ингибированию JNK. TNF-α может индуцировать остеокластогенез независимо от передачи сигналов RANKL-RANK [37]. IL -1 является мощным медиатором патологического разрушения костей, вызванного дефицитом эстрогена или воспалением [7]. Нарушение рецептора IL-1 типа I или передачи сигналов IL-1 может обратить вспять потерю костной массы, вызванную овариэктомией [38] или ревматоидным артритом [39]. Это исследование продемонстрировало способностьактеозиддля уменьшения продукции воспалительных цитокинов, таких как TNF-a, IL-1b и IL-6 в макрофагах. Считается, что актеозид ингибирует выработку воспалительных цитокинов путем подавления киназы p38 и передачи сигналов ERK, поскольку активация ERK1/2, p38 MAPK или обоих необходима для липополисахарид-индуцированной продукции этих цитокинов в макрофагах [40,41]. Сообщалось также, что лютеолин, воспалительное соединение, подавляет выработку медиаторов воспаления путем ингибирования активации p38 MAPK [42]. В этом исследовании мы также обнаружили, что актеозид ослаблял потерю костной массы у мышей после овариэктомии, о чем свидетельствует восстановление максимальной силы перелома. в середине диафиза правой бедренной кости и исчезновение остеопоротического кортикального слоя кости. Пероральное введение актеозида снижало вызванное удалением яичников повышение уровней IL-1b и IL-6 в сыворотке, но не ЩФ. Повышенные уровни кальция, TRAP и OC в сыворотке крови при OVX также ингибировались пероральным приемом актеозида, что свидетельствует о том, что актеозид ослабляет изменение биомаркеров, специфичных для формирования кости, а также для резорбции. Поскольку остеопороз характеризуется снижением плотности массы и ухудшением микроархитектоники трабекулярной кости, индуцированная OVX потеря трабекулярной кости и изменение морфометрических параметров значительно ингибировались пероральным введением актеозида. Эти выводы свидетельствуют о том, чтоактеозидможет использоваться в качестве антирезорбтивного средства для лечения остеопороза путем обращения вспять несбалансированной активации остеокластов. Тем не менее, остеобласты являются основным фактором, ответственным за образование новой кости. Таким образом, агент, способный увеличить пролиферацию или дифференцировку остеобластов, необходим для усиления формирования кости [30]. Напротив, мы обнаружили, что актеозид не влиял на дифференцировку или минерализацию остеобластов в клетках костного мозга, обработанных ДАГ. В совокупности наши результаты свидетельствуют о том, что актеозид оказывает антирезорбтивное действие, но не влияет непосредственно на формирование кости. Необходимы более подробные эксперименты по анализу специфических для кости параметров in vivo и in vitro, чтобы выяснить, оказывает ли актеозид положительное влияние на остеобластогенез. В настоящем исследовании подчеркивается ингибирующее действие актеозида на дифференцировку остеокластов и резорбцию кости путем подавления MAPK и нескольких транскрипционных факторов, таких как NF-kB. , c-Fos и NFATc1. Данные предполагают два возможных механизма, благодаря которым актеозид обладает этими преимуществами. Одна из возможностей заключается в том, чтоактеозид.
ингибирует остеокластогенез благодаря своему антиоксидантному потенциалу. Многочисленные исследования продемонстрировали, что продукция АФК, опосредованная рецептором, может служить в качестве нижестоящего сигнального медиатора [43–45]. Некоторые киназы и факторы транскрипции чувствительны к окислительно-восстановительному состоянию клетки, которое влияет на различные клеточные события. RANKL стимулирует выработку АФК, которые опосредуют RANKL-индуцированные клеточные ответы на дифференцировку остеокластов [24]. Предварительное лечение антиоксидантами, такими как N-ацетилцистеин и глутатион, предотвращало RANKL-опосредованное образование АФК, указывая на то, что антиоксиданты уменьшают потерю костной массы за счет снижения RANKL-индуцированной репродукции [24]. В соответствии с этими выводами настоящее исследование показывает, чтоактеозидослабляет внутриклеточные АФК, продуцируемые в BMM во время дифференцировки остеокластов дозозависимым образом. Это наблюдение позволяет предположить, что ингибирование остеокластогенеза, по крайней мере частично, связано с антиоксидантным потенциалом актеозида. Мы также предполагаем, что актеозид может подавлять приток Са2 плюс, тем самым подавляя остеокластогенез. Недавно сообщалось, что актеозид ингибирует аллергию I типа путем подавления передачи сигналов NFAT и JNK в базофильных клетках [46]. Рецептор, чувствительный к кальцию, тесно связан с регуляцией остеокластогенеза [47]. Эта взаимосвязь предполагает, что кальциевый канал участвует вактеозидиндуцированное ингибирование дифференцировки и образования остеокластов. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования для изучения точных механизмов, посредством которых актеозид действует как антирезорбтивное средство посредством модуляции гомеостаза Са2+.
В заключение, наши настоящие результаты показывают, что актеозид ингибирует RANKL-индуцированную дифференцировку остеокластов из макрофагов BMM и RAW264.7 и подавляет резорбцию кости зрелыми остеокластами.актеозидтакже предотвращает RANKL-индуцированную активацию трех хорошо известных MAPK и факторов транскрипции, таких как NF-kB, c-Fos и NFATc1, а также продукцию воспалительных цитокинов, таких как TNF-a, IL-1b, и ИЛ-6. Кроме того, пероральное введение актеозида ослабляет остеопороз, вызванный овариэктомией, хотя и не влияет на остеобластогенез клеток костного мозга. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что сторона CTE играет полезную роль в снижении образования остеокластов и активности в качестве мощного антирезорбтивного агента.
Вспомогательная информация
Рисунок S1 Химическая структура актеозида.
(TIF)Рисунок S2актеозидпредотвращает RANKL-индуцированное образование ямок в BMM. BMM были предварительно обработаны указанными дозамиактеозидв течение 2 часов в покрытых костью 24-луночных планшетах и стимулировали 50 нг/мл M-CSF и 100 нг/мл RANKL в течение 7 дней. Образование ямок наблюдали под оптическим микроскопом. B, BMM культивировали с M-CSF и RANKL в присутствии различныхактеозидконцентрациях ({{0}}–20 мМ), а через 7 дней площадь резорбции определяли количественно из 3 независимых экспериментов и выражали в процентах от контроля (n=4 на эксперимент). *p, 0,05, **p, 0,01 и ***p, 0,001 по сравнению с клетками, культивируемыми с M-CSF, и ранжированием.
Рисунок S3. Актеозид ослабляет выработку воспалительных цитокинов в RANKL-стимулированных клетках RAW264.7.
Клетки предварительно обрабатывали возрастающими концентрациями (0–10 мМ)актеозидв течение 2 часов с последующей стимуляцией 100 нг/мл RANKL в течение 48 часов. Уровни TNF-a, IL-1b и IL-6 определяли с использованием наборов ELISA. ***p,0.001 по сравнению с клетками без RANKL и актеозида. #p,0,05 и ##p,0,01 по сравнению с клетками, стимулированными только RANKL.
Вклад автора
Задумал и спроектировал эксперименты: S-YL J-CL. Выполнены опыты: S-YL K-SL S-HK SHY. Проанализированы данные: K-SL S-YL J-CL. Предоставленные реагенты/материалы/инструменты для анализа: S-YL SHY J-CL. Написал статью: S-YL SHY J-CL.
использованная литература
1 Rho J, Takami M, Choi Y (2004) Остеоиммунология: взаимодействие иммунной и скелетной систем. Молекулы и клетки 17: 1–9.
2. Del Fattore A, Capannolo M, Rucci N (2010)Кость и костный мозг: тот же орган. Архив биохимии Биофизика 503: 28–34.
3. Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC (2011) Остеопороз: настоящее и будущее. Lancet 377: 1276–1287.
4. Sturge J, Caley MP, Waxman J (2011)Костные метастазы при раке предстательной железы: новые терапевтические стратегии. Nature Reviews Clinical Oncology 8: 357–368.
5. Гольцман Д. (2002) Открытия, лекарства и скелетные заболевания. Nature ReviewsDrug Discovery 1: 784–796.
6. Родан Г.А., Мартин Т.Дж. (2002) Терапевтические подходы к заболеваниям костей. Наука 289: 1508–1514.
7. Lee JH, Jin H, Shim HE, Kim HN, Ha H и другие. (2010) Эпигаллокатехин-3-галлат ингибирует остеокластогенез путем подавления экспрессии c-Fos и подавления сигнала ядерного фактора-kappaB. Молекулярная фармакология 77: 17–25.
8. Kim HN, Lee JH, Jin WJ, Ko S, Jung K и др. (2012) MS-275, ингибитор бензамидгистоновой деацетилазы, предотвращает остеокластогенез путем подавления экспрессии Fos и подавляет потерю костной массы у мышей. Европейский журнал фармакологии 691: 69–76.
9. Kim T, Ha H, Shim KS, Cho WK, Ma JY (2013)Антиостеопоротический эффект Yijung-tang в модели крыс с овариэктомией, опосредованный ингибированием дифференцировки остеокластов. Журнал этнофармакологии 146: 83–89.
10. Nakanishi A, Litsuka N, Tsukamoto J (2013) Рыбий жир подавляет резорбцию кости путем ингибирования остеокластогенеза за счет снижения экспрессии M-CSF, PU.1, MITF и RANK у крыс с удаленными яичниками. Отчеты о молекулярной медицине 7: 1896–1903.
11. Бар-Шавит З. (2007) Остеокласты: многоядерные, гемопоэтические, костно-резорбирующие остеоиммунные клетки. Журнал клеточной биохимии 102: 1130–1139.
12. Takahashi N, Maeda K, Ishihara A, Uehara S, Kobayashi Y (2011)Регуляторный механизм остеокластогенеза по сигналам RANKL и Wnt. Границы бионауки 16: 21–30.
13. Жюль Дж., Чжан П., Эшли Дж. В., Вэй С., Ши З. и др. (2012)Молекулярная основа потребности в рецепторном активаторе передачи сигналов ядерного фактора-kB для интерлейкин 1-опосредованного остеокластогенеза. Журнал биологической химии 287: 15728–15738.
14. Li C, Yang Z, Li Z, Ma Y, Zhang L, et al. (2011)Маслиновая кислота подавляет остеокластогенез и предотвращает потерю костной массы, вызванную овариэктомией, путем регуляции опосредованных рангом сигнальных путей NF-kB и MAPK. Журнал исследований костей и минералов 26: 644–656.
15. Tomoda M, Miyamoto H, Shimizu N (1994) Структурные особенности и антикомплементарная активность rehmannan SA, полисахарида из корня Rehmannia glutinosa. Химический и фармацевтический бюллетень (Токио) 42: 1666–1668.
16. Ким Х., Ли Э., Ли С., Шин Т., Ким И. и др. (1998) Влияние Rehmannia glutinosa на аллергическую реакцию немедленного типа. Международный журнал иммунофармакологии 20: 231–240.
17. Шаповал Э.Э., Варгас М.Р., Чавес К.Г., Бриди Р., Зуанацци Дж.А. и соавт. (1998) Противовоспалительная и антиноцицептивная активность экстрактов и изолированных соединений из Stachytarpheta cayennensis. Журнал этнофармакологии 60: 53–59.
18. Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, et al. (1998) Гепатопротекторная активность фенилэтаноидов изЦистанхе пустынная. Планта Медика 64: 120–125.
19. Chun JC, Kim JC, Hwang IT, Kim SE (2002) Актеозид из глютена Rehmannia аннулирует активность параквата в Cucumis sativus. Биохимия и физиология пестицидов 72: 153–159.
20. Kim SS, Son YO, Chun JC, Kim SE, Chung GH, et al. (2005) Антиоксидантное свойство активного компонента, очищенного из листьев устойчивой к параквату Rehmannia glutinosa. Редокс-отчет 10: 311–318.
21. Сон Ю.О., Ли С.А., Ким С.С., Джанг Ю.С., Чун Дж.С. и др. (2011)Актеозид ингибирует меланогенез в клетках B16F10 за счет активации ERK и подавления тирозиназы. Журнал фармации и фармакологии 63: 1309–1319.
22. Yu JY, Lee SY, Son YO, Shi X, Park SS и другие. (2012) Постоянное присутствие H2O2 вызывает митохондриально-опосредованное, независимое от МАРК и каспазы ингибирование роста и цитотоксичность в фибробластах десен человека. Токсикология In Vitro 26: 561–570.
23. Lu J, Yu JY, Lim SS, Son YO, Kim DH и др. (2013)Клеточные механизмы цитотоксического действия метаболитов зеараленона а-зеараленона и b-зеараленона на макрофаги RAW264.7. Токсикология In Vitro 27: 1007–1017.
24. Ха Х., Квак Х.Б., Ли С.В., Джин Х.М., Ким Х.М. и др. (2004) Активные формы кислорода опосредуют передачу сигналов RANK в остеокластах. Экспериментальные исследования клеток 301: 119–127.
25. Чо Э.С., Ким М.К., Сон Ю.О., Ли К.С., Пак С.М. и др. (2012)Влияние розиглитазона на дифференцировку остеобластов, образование остеокластов и резорбцию кости. Молекулы и клетки 33: 173–181.
26. Son YO, Jang YS, Heo JS, Chung WT, Choi KC и другие. (2009)Фактор, индуцирующий апоптоз, играет критическую роль в независимой от каспазы пикнотической гибели клеток, подвергшихся воздействию перекиси водорода. Апоптоз 14: 796–808.
27. Kook SH, Jeon YM, Park S, Lee JC (2013)Пародонтальные фибробласты модулируют пролиферацию и остеогенную дифференцировку эмбриональных стволовых клеток посредством продукции факторов роста фибробластов. Журнал пародонтологии в прессе
28. Qi W, Yan YB, Lei W, Wu ZX, Zhang Y и др. (2012)Профилактика неупотребительного остеопороза у крыс с помощью экстракта Cordyceps Sinensis. Международный остеопороз 23:2347–2357.
29. Икеда Ф., Нисимура Р., Мацубара Т., Танака С., Иноуэ Дж. и др. (2004)Критическая роль передачи сигналов c-Jun в регуляции семейства NFAT и RANKL-регулирует дифференцировку остеокластов. Журнал клинических исследований 114: 475–484.
30. Tsai HY, Lin HY, Fong YC, Wu JB, Chen YF, et al. (2008)Паэонол ингибирует RANKL-индуцированный остеокластогенез, ингибируя путь ERK, p38 и NF-каппа B. Европейский журнал фармакологии 588: 124–133.
31. Kim JH, Kim K, Jin HM, Song I, Youn BU и др. (2009)Силибинин ингибирует дифференцировку остеобластов, опосредованную членами семейства TNF. Молекулы и клетки 28: 201–207.
32. Napetschnig J, Wu H (2013) Молекулярная основа передачи сигналов NF-kB. Ежегодный обзор биофизики 42: 443–468.
33. Franzoso G, Carlson L, Xing L, Poljak L, Shores EW, et al. (1997) Потребность в NF-kappaB в развитии остеокластов и В-клеток. Гены и развитие 11: 3482–3496.
34. Иотсова В., Каамано Дж., Лой Дж., Ян Ю., Левин А. и др. (1997) Остеопетроз у мышей, лишенных NF-kappaB1 и NF-kappaB2. Природная медицина 3: 1285–1289.
35. Teitelbaum SL (2004) RANKing c-Jun в развитии остеокластов. Журнал клинических исследований 114: 463–465.
36. Takayanagi H (2005) Механизм понимания дифференцировки остеокластов в остеоиммунологии. Журнал молекулярной медицины (Берл) 83: 170–179.
37. Чо Э.С., Ли К.С., Сон Ю.О., Джанг Ю.С., Ли С.И. и др. (2010)Сжимающая механическая сила усиливает остеокластогенез макрофагами костного мозга посредством активации c-Fms-опосредованной передачи сигналов. Журнал клеточной биохимии 111: 1260–1269.
38. Лоренцо Дж. А., Напрта А., Рао Ю., Аландер С., Глаккум М. и соавт. (1998) Мыши, у которых отсутствует рецептор интерлейкина I типа -1, не теряют костной массы после овариэктомии. Endocrinology 139: 3022–3025.
39. Abramson SB, Amin A (2002) Блокирование эффектов IL-1 при ревматоидном артрите защищает кости и хрящи. Ревматология (Оксфорд) 41: 972–980.
40. Хван Дж. М., Ю Дж. Ю., Чан Й. О., Ким Б. Т., Хван К. Дж. и др. (2010)Соединение фенольной кислоты и фенетилмочевины ингибирует липополисахарид-индуцированное производство оксида азота и провоспалительных цитокинов в клеточной культуре. Международная иммунофармакология 10: 526–532.
41. Фанг М., Ли С.Ю., Пак С.М., Чой К.С., Ли Ю.Дж. и др. (2011) Противовоспалительный потенциал Phaseolus calcaratus Roxburgh, восточной медицины, на необработанных макрофагах 264,7, смоделированных LPS. Журнал фармации и фармакологии 63: 120–128.
42. Lee JW, Ahn JY, Hasegawa S, Cha BY, Yonezawa T, et al. (2009)Ингибирующее действие лютеолина на дифференцировку и функцию остеокластов. Цитотехнология 61:125–134.
43. Cosentino-Gomes D, Rocco-Machado N, Meyer-Fernandes JR (2012) Передача сигналов клетками посредством окисления и активации протеинкиназы C. Международный журнал «Молекулярные науки» 13: 10697–10721.
44. Lee JC, Son YO, Pratheeshkumar P, Shi X (2012)Окислительный стресс и канцерогенез металлов. Свободнорадикальная биология и медицина 53: 742–757.
45. Nguyen Ngoc TD, Son YO, Lim SS, Shi X, Kim JG, et al. (2012)Фторид натрия индуцирует апоптоз в эмбриональных стволовых клетках мышей через АФК-зависимые и каспазо- и JNK-опосредованные пути. Токсикология и прикладная фармакология 259: 329–337.
46. Motojima H, Villareal MO, Iijima R, Han J, Isoda H (2013) Актеозид ингибирует аллергию I типа посредством подавления сигнальных путей Ca/NFAT и JNK MAPK в базофильных клетках. Журнал натуральных лекарств в прессе
47. Caudrillier A, Hurtel-Lemaire AS, Wattel A, Cournarie F, Godin C, et al. (2010) Ранелат стронция снижает активатор рецептора индуцированной лигандом ядерного фактора-kB дифференцировки остеокластов in vitro: участие рецептора, чувствительного к кальцию. Молекулярная фармакология 78: 569–576.
