Контактное лицо:jerry.he@wecistanche.com

Юто Мицухата1, Такая Абэ2, Казуё Мисаки3, Юна Накадзима1, Кейта Кирия1,

Мива Кавасаки4, Хироши Киёнари2, Масатоши Такеичи4*, Мика Тоя1,4,5,6*&

Масамицу Сато1,6,7

Цистанхе может улучшить функцию почек

Эпителиальные клетки организуют упорядоченный массив нецентросомных микротрубочек, минус-концы которых регулируются CAMSAP3. Однако роль этих микротрубочек в эпителиальных функциях плохо изучена. Здесь мы показываем, чтопочкимышей, у которых мутирован Camsap3, развиваютсякистыв проксимальных извитых канальцах (ПКТ). PCT были сильно расширены у мутантапочки, и они также проявляли усиленную пролиферацию клеток. В этих ПКТ эпителиальные клетки утолщались вместе с нарушением массивов микротрубочек, а также некоторых субклеточных структур, таких как встречно-пальцевые базальные отростки. Кроме того, в этих мутантных клетках ПКТ были активированы YAP и PIEZO1, которые известны как механочувствительные регуляторы формирования и пролиферации клеток. Эти наблюдения предполагают, что сети микротрубочек, опосредованные CAMSAP3, важны для поддержания надлежащих механических свойств клеток ПКТ, а их потеря вызывает деформацию и пролиферацию клеток посредством активации механосенсоров, что приводит к расширению ПКТ.

Эпителиальные клетки являются основными компонентами различных органов. Они демонстрируют апикально-базальную полярность, что связано с их функциями, такими как абсорбция и секреция. В дифференцированных эпителиальных клетках большинство микротрубочек не являются центросомными и выровнены вдоль апикально-базальной оси 1-3. CAMSAP3 является членом семейства calmodulin-regulated spectrin-associated protein (CAMSAP)/Nezha/Patronin и важен для организации эпителиальных микротрубочек 4-8 . CAMSAP3 связывается и стабилизирует минус-концы микротрубочек4,6,9. В клетках тонкого кишечника мышей CAMSAP3 концентрируется в апикальных областях коры, прикрепляя минус-концы нецентросомных микротрубочек к этим участкам10,11, что приводит к образованию массивов микротрубочек, ориентированных в апикобазальном направлении с плюс-концами, направленными к основанию. . Однако эта характерная организация микротрубочек утрачивается у мышей, несущих мутантный ген, кодирующий укороченный Camsap3 (мыши Camsap3dc/dc), у которых делетирован С-концевой домен, связывающий микротрубочки. Эпителиальные клетки кишечника у этих мышей имеют различные цитологические дефекты, включая уменьшенную высоту клеток и неправильное расположение органелл, таких как ядро ​​и аппарат Гольджи10. Несмотря на такие большие нарушения внутриклеточной архитектуры, эпителиальные клетки сохраняют нормально выглядящие двумерные листы 10,12, а мутировавший кишечник не имел явных физиологических дефектов.

канальцы (ПКТ), петля Генле, дистальные извитые канальцы и собирательные трубочки. Эти субструктуры нефрона состоят из одного слоя эпителия, который выполняет функции фильтрации, реабсорбции и секреции.

A почечный кистаявляется распространенным патологическим поражениемпочки. Кистозное поражение вариабельно; либо очаговые, либо множественные кисты формируются с одной или двух сторон в почках, демонстрируя различную степень симптомов13–15. несколько врожденных кистозныхпочечныйзаболевания, в том числе поликистозпочказаболеваний (PKD), гломерулокистозной болезни почек (GCKD) и медуллярно-кистознойпочкаболезни (MCKD), как известно, вызывают множественныепочечныйкисты двусторонних почек. При поликистозной болезни кисты равномерно распределяются по всему органу, включая ПКТ, тогда как при GCKD и MCKD кисты развиваются в капсулах Боумена и собирательных трубочках (в основном в области мозгового вещества) соответственно16–19.

Что касается PKD, известны две основные причины: 1) мутации в гене Pkd1 или Pkd2 и 2) мутации в генах, необходимых для биогенеза первичной реснички. Pkd1 и Pkd2 кодируют polycystin1 и polycystin2 соответственно, которые являются неселективными катионными каналами 20, которые локализуются в нескольких клеточных компартментах, включая первичные реснички 21,22 . У мышей, несущих мутантную форму PKD1 или PKD2, белки polycystin не локализуются в ресничках 23 . Гены, необходимые для биогенеза первичных ресничек, включают If88 и Kif3a, которые участвуют во внутрифагеллярном транспорте 24-26 . Мутации в этих генах также приводят кпочечныйкистозные заболевания 24–27 . Хотя взаимосвязь между этими двумя каузальными путями сложна 23 , один путь, который, как было показано, индуцирует PKD, включает эффектор передачи сигналов Hippo Yap28 . У мышей с мутацией Pkd1 коактиватор транскрипции YAP/TAZ и его эффектор c-Myc активируются и способствуют цистогенезу28. Тем не менее механизмы, лежащие в основе развития поликистозапочкиостаются во многом неизвестными.

В настоящем исследовании мы исследовали роль CAMSAP3 впочкаструктура и функция. Наши наблюдения показывают, что апикально локализованный CAMSAP3 способствует правильной ориентации нецентросомных микротрубочек, а также установлению внутриклеточной архитектуры эпителиальных клеток в ПКТ, как это наблюдается в тонком кишечнике. Однако, в отличие от кишечного эпителия, CAMSAP3дисфункциявызывал аномалии на уровне органов в двусторонних почках, то есть образование кист при ПКТ. Потеря функции CAMSAP3 приводит к активации механочувствительных регуляторов, которые обычно помогают сохранить целостность тканей. Наше исследование предполагает, что CAMSAP3-опосредованная нецентросомная организация микротрубочек важна для поддержания механочувствительных свойств ПКТ, а потеря этой системы вызывает образование регионарных кист в почках.

Полученные результаты

Кистаформирование впочкимышей с мутацией Camsap3. Фенотипический анализ мутантных мышей Camsap3dc/dc показал, чтопочкиу старых (~ 2 лет) мышей Camsap3dc/dc были гипертрофические и обесцвеченные (рис. 1а). Для дальнейшего анализа аномалий в Camsap3dc/dcпочкимы исследовали более молодых мышей. На 21-й день после рождения (P21) почки Camsap3dc/dc имели нормальный вид. Тем не менее, разрез почки выявил кистозные структуры в кортикальных областях (рис. 1b и дополнительная рис. S1a), что подтверждается расчетом кистозного индекса, который представляет собой отношение областей, содержащих кисты, к общей площади почки (рис. 1с). Мы исследовали мутантные эмбрионы, чтобы определить, когда кисты начинают формироваться во время развития, что выявило признаки повышенного образования кист примерно на 17,5 эмбрионального дня (E17.5) (дополнительный рисунок S1a, стрелки). На P0 кортикальные кисты стали легко различимы (дополнительный рисунок S1a, стрелки), а их размер и количество увеличились на P21 (рис. 1b, дополнительный рисунок S1a, стрелки). По мере взросления мышей кистозные фенотипы становились более очевидными, хотя степень образования кист у разных людей различалась (рис. 1с и дополнительная рис. S1b). Кроме того, соотношение веса почек и тела было выше у мышей Camsap3dc/dc, чем у мышей дикого типа (WT) на протяжении всей их жизни (рис. 1d и дополнительные рис. S1c, d). Таким образом, в почках Camsap3dc/dc наблюдалось образование кист, которое со временем усиливалось, что приводило к гипертрофии в старых почках.

Мыши Camsap3dc/dc экспрессируют укороченный С-концевой домен CAMSAP3 (CAMSAP3-dc)10, который может быть вовлечен в наблюдаемый кистозный фенотип почек мышей. Чтобы исследовать эту возможность, мы создали мышь Camsap3–/– (Camsap 3-null) (дополнительный рисунок S2a,b) (подробно см. Также «Методы»). У этих мышей тожепочкис множественными кистами, и их фенотип был неотличим от наблюдаемого у мышей Camsap3dc/dc; примечательно, что у гетерозиготных (Camsap3 plus/–) мышей не было признаков поликистоза почек (дополнительная рис. S2c).

Образование кисты в ПКТ Camsap3dc/dcпочки. Чтобы определить, какие структуры стали кистозными у мутантапочки, мы провели иммуноокрашивание трех сегментов нефрона на три белка, а именно мегалин (локализируется на ПКТ), котранспортер Na+/Cl- (дистальные извитые канальцы) и аквапорин -2 (собирательные трубочки). Результаты показали, что расширение происходило исключительно в мегалин-положительных канальцах на P21 (рис. 1e и дополнительная рис. S1e), что указывает на то, что кистогенез был ограничен ПКТ. PCT подразделяются на три сегмента, а именно S1, S2 и S3, и мы различали их с помощью иммунного окрашивания переносчиков глюкозы SGLT1 и SGLT2, которые локализуются в сегментах S3 и S1/S2 соответственно 29,30 . Расширенные канальцы были отмечены исключительно SGLT2 (рис. 1f), что указывает на то, что кистогенез происходит в сегментах S1/S2. У старых мутантных мышей, однако, образование кист также распространялось на капсулу Боумена (Fig. 1g).

Дезорганизованная клеточная архитектура при кистозных ПКТ. Чтобы изучить дефекты клеточного уровня в кистозных ПКТ, мы сначала исследовали их с помощью сканирующей электронной микроскопии, обнаружив, что популяцияпочечныйканальцы заметно набухли в почках Camsap3dc/dc (рис. 2а), хотя степень набухания варьировала от положения к положению канальца. На поперечных срезах выявлено, что в набухших участках канальца его просвет расширен вместе с истончением эпителиального слоя, слагающего канальцы (рис. 2а). Количественное определение с использованием образцов, окрашенных гематоксилином и эозином, подтвердило, что высота клеток была уменьшена в расширенных канальцах (рис. 2b), тогда как апикальный периметр каждой клетки был увеличен (рис. 2c), что указывает на то, что мутантные клетки были толще, чем у WT.почки.

Затем мы исследовали, влияет ли мутация Camsap3 на клеточную архитектуру и/или субклеточные структуры PCT. Иммуноокрашивание на ДПП IV, маркер апикальной мембраны, и на Na+/K+-АТФазу, маркер базолатеральной мембраны, показало, что общая полярность клеток была нормальной в каждом случае.почечныйканальцевая клетка Camsap3dc/dc

Рисунок 1. Кистозное образование в проксимальных извитых канальцах Camsap3dc/dcпочки. ( а ) Морфология почек мышей WT ( плюс / плюс ) и мутантных мышей Camsap3 ( Camsap3dc / dc ) на P666. (b) Окрашивание H&E почек WT и Camsap3dc/dc на P21. Множественные кисты формируются в корковом веществе Camsap3dc/dc почек. ( c ) Изменение кистозного индекса мышей WT и Camsap3dc / dc с течением времени. 9 мышей исследовали на WT или Camsap3dc/dc. См. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ для определения кистозного индекса. (d) Отношение почки к массе тела. 11 мышей исследовали на WT или Camsap3dc/dc. (e) Иммуноокрашивание на маркеры проксимальных извитых канальцев (PCT) (мегалин), дистальных извитых канальцев (DCT), котранспортера NaCl и собирательных трубочек (CD) (аквапорин -2; AQP2) у WT и Camsap3dc/ Округ Колумбияпочкина Р21. Изображения мегалина в увеличенном виде показывают делокализованный мегалин в кистозных клетках в почках Camsap3dc/dc, как указано стрелкой. Пунктирные и сплошные линии обозначают апикальный и базальный края клетки соответственно. (f) Иммуноокрашивание маркеров сегментов S1/S2 (SGLT2, зеленый) и сегмента S3 (SGLT1, красный) в почках WT и Camsap3dc/dc на P21. Изображения увеличенного изображения SGLT2 показывают снижение интенсивности сигнала SGLT2 в кистозных клетках в почках Camsap3dc/dc, как указано стрелками. (g) Морфология клубочка на P21 и P487. Стрелки указывают на расширенный клубочек. См. также рисунки S1 и S2.

Рисунок 2. Дезорганизованная клеточная архитектура в кистозных клетках ПКТ. (а) Изображения сканирующей электронной микроскопии ▸

Цистанхе может улучшить функцию почек

WT и Camsap3dc/dcпочкина Р21. Почечные канальцы в Camsap3dc/dcпочкичастично опухший. (б) Количественное определение высоты клеток в коре [плюс/плюс, n=121 клеток; dc/dc (расширенные), n=128 клеток; dc/dc (нерасширенные), n=66 клеток]. Столбики погрешностей указывают SD ***p<0.001, t-test.="" see="" materials="" and="" methods="" for="" the="" defnition="" of="" dilated="" and="" non-dilated="" tubules.="" (c)="" quantifcation="" of="" cell="" width="" in="" the="" cortex="" [+="" +="" ,="" n="26" tubules;="" dc/="" dc="" (dilated),="" n="8" tubules;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="14" tubules].="" error="" bars="" indicate="" s.d.="" ***p=""><0.001, t-test.="" (d)="" cell="" polarity="" markers="" were="" visualized:="" dpp="" iv="" (apical="" marker)="" and="" na+/k+-atpase="" (basal="" marker).="" te="" localization="" of="" cell="" polarity="" markers="" in="" camsap3dc/dc="" kidney="" is="" overall="" normal.="" te="" arrowhead="" indicates="" basal="" plasma="" membranes,="" whose="" invagination="" is="" not="" normal.="" (e)="" apical="" structures="" (actin="" and="" ezrin)="" and="" the="" golgi="" were="" visualized.="" arrowheads="" indicate="" disrupted="" structures="" such="" as="" the="" lack="" of="" actin="" signal="" and="" misplacement="" of="" the="" golgi.="" broken="" and="" continuous="" lines="" indicate="" the="" apical="" and="" basal="" margin="" of="" the="" cell,="" respectively,="" in="" d="" and="" e.="" (f)="" transmission="" electron="" microscopy="" images="" of="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" subcellular="" defects="" such="" as="" a="" fattened="" nucleus="" and="" misaligned="" mitochondria="" are="" observed="" in="" camsap3dc/dc="" kidneys.="" arrowheads="" indicate="" invaginated="" basal="" membranes.="" note="" that="" their="" extensive="" invagination="" is="" suppressed="" in="" camsap3dc/dc.="" asterisks="" denote="" mitochondria.="" drawings="" are="" the="" traced="" invagination="" in="" electron="" microscopy="" images.="" (g)="" quantifcation="" of="" the="" shape="" of="" the="" nucleus="" [+="" +="" ,="" n="72" cells;="" dc/dc="" (dilated),="" n="72" cells;="" dc/dc="" (non-dilated),="" n="71" cells].="" (h)="" immunostaining="" for="" acetylated="" tubulin,="" a="" marker="" for="" the="" primary="" cilium,="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" te="" primary="" cilium="" was="" present="" in="" both="" wt="" and="" camsap3dc/dc="">почки. (i) Количество первичных ресничек на ПКТ. Количество первичных ресничек рассчитывали, используя длину апикальной окружности поперечных срезов РСТ, наряду с количеством первичных ресничек и ядер. [ плюс / плюс , N=340 клеток, 63 поперечных среза ПКТ, число первичных ресничек=268; dc/dc, N=221 клеток, 29 поперечных срезов ПКТ, число первичных ресничек=133].

мыши (рис. 2г). Напротив, хотя Megalin накапливается в апикальных областях клеток WT, он диффундирует в цитоплазму некоторых кистозных клеток Camsap3dc/dc (рис. 1e, увеличенное изображение и рис. 2d). Флуоресцентное окрашивание F-актина, который накапливается с высокой плотностью в апикальных микроворсинках, позволяет предположить, что микроворсинки иногда были беспорядочными в ожиревших клетках мутантныхпочки(наконечник стрелки на рис. 2д), что подтверждается просвечивающей электронной микроскопией (рис. 2е). Эзрин, часть ERM-комплекса, который связан с апикальной плазматической мембраной31, был уменьшен или потерян в кистозных клетках Camsap3dc/dc.почки(Fig. 2e), предполагая, что цитоархитектоника была аномальной в мутантных клетках. Кроме того, в то время как Giantin-положительный аппарат Гольджи обычно распределяется в виде тонких тяжей, примыкающих к ядру в клетках WT, аппарат Гольджи иногда становится конденсированным в клетках Camsap3dc/dc (Fig. 2e). Трансмиссионная электронная микроскопия выявила дополнительные субклеточные дефекты в расширенных ПКТ Camsap3dc/dc.почки. В клетках WT PCT митохондрии были удлиненными, показывая упорядоченную ориентацию вдоль апико-базальной оси клетки, тогда как в кистозных клетках PCT митохондрии имели тенденцию быть круглыми, больше не демонстрируя какой-либо упорядоченной ориентации (Fig. 2f). В этих клетках базальная исчерченность также была дезорганизована, потеряв свои параллельные и глубокие инвагинации, которые являются обычными для клеток WT (рис. 2f, стрелки и штриховой рисунок), что также показало иммуноокрашивание на Na plus /K plus -ATPase (рис. 2d наконечники стрел). Более того, в кистозных клетках ядра были утолщены по сравнению с их округлой формой в клетках WT (рис. 2f, g). Первичные реснички были обнаружены на люминальной стороне клеток РСТ как в почках дикого типа, так и в мутантных почках (рис. 2h,i), в отличие от случая мутантных мышей с дефектом цилиогенеза, который вызывает поликистоз почек24–27, что позволяет предположить, что нарушение цилиогенеза является не вероятная причина

наблюдали поликистозные фенотипы у мышей Camsap3dc/dc. В совокупности эти наблюдения показали, чтодисфункцияCAMSAP3 нарушает субклеточную архитектуру кистозных клеток ПКТ.

Мыши Camsap3dc/dc обнаруживают некоторые физиологические дефекты. Затем мы исследовали, имеют ли почки Camsap3dc/dc какие-либо физиологические дефекты. Вышеупомянутые иммуноцитологические исследования показали, что мегалин, который функционирует как мультилигандный эндоцитарный рецептор32,33, имеет тенденцию диффундировать в цитоплазму клеток Camsap3dc/dc PCT (рис. 1e, наконечник стрелки и рис. 2d), в отличие от его четкой апикальной локализации в Клетки ПКТ дикого типа. Кроме того, хотя переносчик глюкозы SGLT2, ответственный за реабсорбцию глюкозы на 90 %, локализован в основном в апикальных областях клеток Camsap3dc/dc (что также наблюдается в клетках дикого типа), интенсивность его сигнала снижалась в определенных областях кистозных канальцев. рис. 1f, стрелки), что позволяет предположить, что физиология мутантных канальцев могла подвергнуться негативному воздействию. Поэтому мы провели анализы мочи и крови на мышах P396-–P424-старых. Анализы мочи выявили тенденцию к избыточному оттоку K plus , Mg2 plus и азота мочевины у мышей Camsap3dc/dc (дополнительная рис. S3a). Анализы крови более убедительно продемонстрировали, что у мышей Camsap3dc/dc были значительно более низкие уровни K plus и Mg2 plus по сравнению с мышами WT или Camsap3 plus/dc, хотя никаких изменений в уровнях азота мочевины и глюкозы обнаружено не было (дополнительная рис. S3b). . Уровни креатинина в моче и крови не различались между мышами дикого типа и мутантными мышами (дополнительная рис. S3c). Таким образом, у мышей Camsap3dc/dc мы наблюдали лишь частичные физиологические дефекты.

Организация микротрубочек впочечныйэпителиальные клетки канальцев. Поскольку мутация Camsap3 приводит к дезориентации микротрубочек в эпителиальных клетках тонкой кишки10,12, мы исследовали, происходит ли это также впочкаэпителиальные клетки. Сначала мы иммуноокрашивали -тубулин вместе с Мегалином. Примечательно, что как в почках дикого типа, так и в почках Camsap3dc/dc мегалин-отрицательные канальцы, то есть либо дистальные извитые канальцы, либо собирательные протоки, демонстрировали более сильную интенсивность иммуноокрашивания -тубулина, чем наблюдаемая для -тубулина в мегалин-положительных ПКТ (рис. 3а, б) . Как было обнаружено в тонком кишечнике10, CAMSAP3 локализовался апикально во всех эпителиальных клетках дикого типа.почки, перекрывая апикальный конец микротрубочек, которые выровнены вдоль апико-базальной оси (Fig. 3c lef). Эпителиальные клетки почек Camsap3dc/dc также были в некоторой степени иммунопозитивными в отношении CAMSAP3, но в нерегулярных положениях (рис. 3c справа, стрелки), что свидетельствует о том, что мутировавший CAMSAP3 сохраняется в клетках, прикрепленных к некоторым неидентифицированным структурам. В кистозных клетках мутантных почек ряд микротрубочек был запутан и дезорганизован (Fig. 3c справа), как это наблюдалось в клетках кишечника Camsap3dc/dc мышей 10 . Однако в некистозных клетках организация микротрубочек не была нарушена.

Рисунок 3. Микротрубочки в эпителиальных клетках почечных канальцев. ( а ) Иммуноокрашивание на -тубулин, мегалин и ядра в почках WT и Camsap3dc/dc на P21. (b) Количественное определение интенсивности -тубулина в почках ПКТ и DCT/CD в почках дикого типа (ПКТ, n=28 канальцев; DCT/CD, n=18 канальцев) и Camsap3dc/dc в почках (ПКТ, n { {8}} канальцев; DCT/CD, n=9 канальцев). Столбики погрешностей указывают SD ***p<0.001, t-test.="" (c)="" immunostaining="" for="" α-tubulin,="" camsap3,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p21.="" arrowheads="" indicate="" camsap3-dc="" proteins="" anchoring="" to="" unidentifed="" structures.="" te="" apical="" localization="" of="" camsap3="" was="" absent="" in="" camsap3dc/dc="" cells.="" see="" also="" figure="">

даже в отсутствие функционального CAMSAP3, что может объяснить, почему эти клетки не обнаруживали цитологических аномалий. Кроме того, нулевые клетки эпителия почек Camsap3- также показали аналогичные дефекты микротрубочек, но только в кистозных клетках (дополнительная рис. S2d). В совокупности эти результаты показали, что CAMSAP3 играет роль в поддержании апико-базальной организации микротрубочек только для субпопуляции эпителиальных клеток почек.

Повышенная пролиферация клеток в ПКТ Camsap3dc/dc. Образование кист в почках тесно связано с повышенной пролиферацией почечных клеток34. Чтобы проверить, была ли изменена пролиферация клеток в почках Camsap3dc/dc, мы сравнили пролиферацию клеток PCT в почках дикого типа и мутантных почках с помощью совместного иммунного окрашивания на мегалин и Ki-67, маркер пролиферации клеток. Ki-67-положительные клетки редко наблюдались в ПКТ почек WT, тогда как они были легко видны в ПКТ-клетках почек Camsap3dc/dc. Однако Ki -67 был обнаружен как в нерасширенных, так и в расширенных канальцах (рис. 4a, b), что не показывает корреляции между пролиферацией клеток и образованием кист. Тус, CAMSAP3дисфункциядействительно способствовали пролиферации клеток, но этот процесс не всегда был связан с образованием кисты.

Изменения локализации YAP и немышечного миозина связаны с деформацией клеток. YAP является активатором транскрипции, который регулирует пролиферацию клеток 35, а также формирование клеток, зависящее от механического напряжения 36 . YAP активируется вместе с его ядерной локализацией в почках мышей с дефицитом Pkd1-, модели PKD37, и активация Yap способствует пролиферации клеток и дилатации канальцев в почках 28 . Поэтому мы проверили, активировался ли YAP в ПКТ почек Camsap3dc/dc. Иммуноокрашивание на YAP выявило его цитоплазматическую локализацию в ПКТ почек дикого типа. Примечательно, что YAP концентрировался в ядрах ПКТ Camsap3dc/dc, но только в их расширенных участках (рис. 5а), что подтверждается количественным определением (рис. 5б), предполагая, что наблюдаемое перераспределение YAP происходило в ответ на изменение клеточного состава. морфология, а не CAMSAP3дисфункциякак таковой.

YAP является нижестоящим эффектором пути Hippo, который регулируется механическими сигналами 38 . Фактически, кистозные клетки в почках Camsap3dc/dc выглядели растянутыми, что позволяет предположить, что они могли подвергаться повышенному натяжению.

Рисунок 4. Пролиферация клеток в ПКТ Camsap3dc/dc. ( а ) Иммуноокрашивание на Ki-67, мегалин и DAPI в почках WT и Camsap3dc/dc на P22. Стрелки указывают Ki-67-позитивные клетки в кистозных канальцах. (b) Процент Ki-67-позитивных клеток в эпителиальных клетках ПКТ [плюс/плюс, n=700 клеток; dc/dc (расширенные), n=224 клеток; dc/dc (нерасширенные), n=396 клеток]. Столбики погрешностей указывают SD * p<0.05,>

Поэтому мы исследовали, произошли ли какие-либо механические изменения в связи с образованием кисты. Поскольку немышечная активация миозина II является чувствительным к напряжению процессом39, мы оценили распределение легкой цепи 2 миозина (MLC2), которая участвует в активации миозина II, в почках. Хотя MLC2 диффундировал в цитоплазму клеток канальцев WT, он концентрировался вблизи апикальных частей кистозных клеток в почках Camsap3dc/dc (рис. 5c, наконечник стрелки), указывая на то, что эти клетки подвергались растягивающей силе. Клетки в нерасширенных ПКТ не показали такой концентрации MCL2. Эти находки согласуются с идеей, что YAP проникает в ядро, когда клетки механически растягиваются 40,41 .

Изменения в распределении PIEZO1 в ПКТ Camsap3dc/dc. Чтобы дополнительно проверить, подвергаются ли кистозные клетки силе растяжения, мы исследовали субклеточное распределение PIEZO1, механочувствительного ионного канала 42–45, так как это типичный маркер механического растяжения; Локализация PIEZO1 смещается с плазматической мембраны/цитоплазмы на ядерную оболочку, когда он воспринимает сигналы растяжения 46 . Иммуноокрашивание на PIEZO1 показало, что PIEZO1 в основном локализуется в цитоплазме клеток WT PCT, тогда как его локализация перекрывается с ядром в кистозных клетках Camsap3dc/dc PCT (рис. 6а). Иммуноокрашивание для YAP и PIEZO1 в последовательных срезах также показало, что их ядерная локализация совпадала при расширенных ПКТ (дополнительная рис. S4, стрелки). С другой стороны, в недилатированных ПКТ Camsap3dc/dc распределение PIEZO1 выглядело цитоплазматическим (рис. 6а). Однако тщательное наблюдение за изображениями иммунофлуоресценции, а также количественная оценка показали, что его ядерная локализация имеет тенденцию к увеличению в некоторой степени по сравнению с клетками WT (рис. 6а, б). Таким образом, в отличие от YAP, по-видимому, PIEZO1 начинает активироваться до выявляемой деформации клеток в ПКТ Camsap3dc/dc.

Обсуждение

В этом исследовании мы обнаружили, что мутация CAMSAP3 или ее потеря приводили к расширению клеток ПКТ, что приводило к тому, что поперечные сечения канальцев приобретали кистозный вид. Признак кистогенеза наблюдался уже на E17.5 с постепенным увеличением дилатации во время старения и ее возможным распространением на капсулу Боумена. Эпителиальные клетки в расширенных областях стали тоньше, проявляя различные цитологические дефекты, как это наблюдается в клетках тонкого кишечника мышей Camsap3dc/dc10,12. Также наблюдались некоторые специфичные для почек дефекты, в том числе нарушение выравнивания митохондрий и базального паттерна плазматической мембраны. Эти изменения совпали с нарушением расположения микротрубочек, предполагая, что сети микротрубочек, опосредованные CAMSAP{8}}, ответственны за нормальную организацию этих субклеточных структур в клетках ПКТ, как и в других типах клеток. С другой стороны, хотя CAMSAP3, по-видимому, экспрессировался во всех эпителиальных клетках почечных канальцев, аберрантные структурные фенотипы наблюдались только в ПКТ, что указывает на существование избыточного механизма (механизмов) для поддержания сетей микротрубочек в отсутствие CAMSAP3. Возможно, что молекулы, отличные от CAMSAP3, такие как другие CAMSAP, могут участвовать в поддержании целостности сетей микротрубочек в этих клетках. Клетки ПКТ имели относительно более низкую плотность микротрубочек, чем другие клетки канальцев. Вероятно, это способствовало деформации клеток, так как сетей микротрубочек, оставшихся после потери CAMSAP3, могло быть недостаточно для поддержания

правильную клеточную архитектуру. Однако даже в клетках ПКТ, по-видимому, существуют механизмы, которые компенсируют потерю CAMSAP3, поскольку дилатация ПКТ происходит неравномерно.

Рисунок 5. Локализация YAP и немышечного миозина, связанного с деформацией клеток. ( а ) Иммуноокрашивание на YAP, мегалин и DAPI в почках WT и Camsap3dc / dc на P22. Сигналы флуоресценции DAPI и YAP сканировали вдоль линии, проведенной на увеличенных изображениях, и пространственные изменения интенсивности флуоресценции показаны синим цветом для DAPI и зеленым цветом для YAP. Пунктирные линии указывают приблизительную площадь ядра. Стрелки указывают положение ядра в репрезентативных клетках. ( б ) Отношение интенсивности ядерной YAP к цитоплазматической интенсивности YAP [плюс / плюс, n=81 клеток; dc/dc (расширенные), n =43 клеток; dc/dc (нерасширенные), n=53 клеток]. Коробчатые диаграммы показывают значения первого квартиля, медианы и третьего квартиля. ***п<0.001, t-test.="" (b)="" immunostaining="" for="" mlc2,="" actin,="" and="" dapi="" in="" wt="" and="" camsap3dc/dc="" kidneys="" at="" p22.="" arrowheads="" indicate="" apical="" accumulation="" of="" mlc2="" in="" cystic="">

Рисунок 6. Изменение распределения PIEZO1 в Camsap3dc/dc PCT. ( а ) Иммуноокрашивание на PIEZO1, мегалин и DAPI в почках WT и Camsap3dc/dc на P22. Сигналы флуоресценции DAPI и PIEZO1 сканировали вдоль линии, проведенной на увеличенных изображениях, и пространственные изменения интенсивности флуоресценции показаны синим цветом для DAPI и зеленым цветом для PIEZO1. Пунктирные линии указывают приблизительную площадь ядра. Стрелки указывают положение ядра в репрезентативных клетках. ( б ) Отношение интенсивности ядерного пьезо1 к интенсивности цитоплазматического пьезо1 [ плюс / плюс , n=66 клеток; dc/dc (расширенные), n =44 клеток; dc/dc (нерасширенные), n=81 клеток]. Коробчатые диаграммы показывают значения первого квартиля, медианы и третьего квартиля. ***п<0.001, **p=""><0.01, t-test.="" see="" also="" figure="">

Как же тогда происходило региональное расширение РСТ, сопровождающееся отложением жира эпителиальными клетками? Примечательно, что образование кист стало обнаруживаться на E17.5, и это время коррелирует с началом первичной продукции мочи у мышей 47 . Следовательно, мы можем предположить, что «поток мочи» является потенциальным механическим фактором, вызывающим расширение почечных канальцев. Вероятно, клетки ПКТ, утратившие цитоскелет микротрубочек, 3-опосредованный CAMSAP, были механически более восприимчивы к внешним силам, т. е. более деформируемы, по сравнению с клетками ПКТ дикого типа. Таким образом, силы, создаваемые потоком мочи в почечных канальцах, могут вызывать расширение канальцев, вызывая их утолщение. Такие силы могут быть неравномерными, что приводит к разной степени дилатации вдоль ПКТ. Эта идея, разумеется, не исключает других возможных механизмов дилатации ПКТ.

Наши наблюдения продемонстрировали, что PIEZO1 перемещается из цитоплазмы в ядерную область в расширенных клетках PCT почек Camsap3dc/dc, указывая на то, что этот механосенсор активируется в ответ на деформацию клеток, скорее всего, на 'растяжение' клеток, как сообщалось ранее 46 . Растянутое состояние расширенных клеток ПКТ было подтверждено наблюдением, что MLC2 был увеличен в их кортикальных областях. Наш анализ также показал, что PIEZO1 уже был в некоторой степени активирован в недилатированных клетках ПКТ, предполагая, что даже эти клетки претерпевают механические изменения, несмотря на их нормальный вид. Другой механосенсор, YAP, также активировался в клетках ПКТ, но его активация, по-видимому, происходила только в растянутых клетках.

Как же тогда эти механочувствительные регуляторы вносят вклад в деформацию клеток, а также в клеточную пролиферацию, которая стимулировалась в отсутствие CAMSAP3? Было показано, что индуцированная растяжением активация PIEZO1 способствует клеточной пролиферации в эпителиальных клетках 46, предполагая, что этот механизм также работает в клетках PCT почек Camsap3dc/dc. Эта идея согласуется с нашим наблюдением, что усиленная пролиферация клеток и частичная активация PIEZO1 происходили вместе, даже в недилатированных клетках Camsap3dc/dc PCT. Что касается YAP, то его активация была отсроченной, не обнаруживая четкой корреляции с началом усиления клеточной пролиферации. YAP известен не только как фактор роста клеток, но и как регулятор механического гомеостаза, как показано ранее 36,48 . Поэтому возможно, что YAP, перемещенный в ядро ​​вместе с деформацией клеток ПКТ, мог бы регулировать их форму, т. е. восстанавливать поврежденную форму этих клеток. В противном случае YAP может сотрудничать с PIEZO1 в усилении пролиферации расширенных клеток, т.к. известно, что YAP участвует в формировании поликистозных почек посредством усиления клеточной пролиферации 28 .

Мы обнаружили, что у мышей Camsap3dc/dc были значительно более низкие уровни K plus и Mg2 plus в крови, что позволяет предположить, что их почки могли страдать от какого-то аномального функционирования. С этой аномалией могут быть связаны серьезные цитологические дефекты, которые мы наблюдали в апикальной и базальной плазматических мембранах клеток ПКТ, где расположен аппарат активного транспорта. Однако мы не можем исключить возможность того, что другие части почечных канальцев или других органов также могут быть функционально дефектными, индуцируя этот фенотип. Кроме того, мы не получили каких-либо доказательств того, что фильтрационная функция клубочка нарушена, так как уровень креатинина и азота мочевины в крови, которые экскретируются через клубочек, был в норме.

Нарушение биогенеза первичной реснички ведет к PKD24-27. В случае мутации Camsap3 образование первичных ресничек, по-видимому, не нарушено. Недавнее исследование показало, что потеря CAMSAP3 в многоресничных эпителиальных клетках носа влияет на формирование центральных пар микротрубочек в аксонеме, вызывая аберрантную подвижность подвижных ресничек 49 . Хотя первичные реснички на эпителиальных клетках неподвижны и лишены центральных пар микротрубочек 50, остается неясным, функциональны ли первичные реснички у мышей с мутациями Camsap3. Несмотря на эту неопределенность, аномалии у мутантов PKD и Camsap3 совершенно различны, так как образование кист происходит равномерно по всей почке в первых, тогда как во вторых это локальное явление. Это различие, скорее всего, связано с различным молекулярным фоном образования кист между ними.

Подводя итог, наше исследование показывает, что CAMSAP3 важен для поддержания структуры и функции почечных канальцев в проксимальных областях, вероятно, посредством регуляции нецентросомной сборки микротрубочек. Однако потребуются дальнейшие исследования для полного понимания того, как потеря этой системы организации микротрубочек влияет на физиологические функции почек.

материалы и методы

Все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими руководствами, правилами и одобрены Центром исследований динамики биосистем RIKEN и/или Комитетом по институциональной биобезопасности Университета Васэда.

Мыши. Мыши с мутацией Camsap3 (Camsap3dc/dc), используемые в этом исследовании, были созданы в нашем предыдущем исследовании 10 (инвентарный номер CDB0716K; http://www2.clst.riken.jp/arg/mutant Percent 20Mice Percent 20List.html). У этих мышей С-концевая область Camsap3, а именно экзоны 14-17, была удалена, и ранее мы подтвердили, что мышиные клетки экспрессируют нефункциональную C-концевую укороченную CAMSAP3 (CAMSAP3-dc)10. В настоящем исследовании в экспериментах использовали мышей N4 и 5 поколения.

Мыши с нокаутом Camsap3 (Camsap3–/–) (инвентарный номер CDB0033E), у которых отсутствует вся кодирующая область 22-kb Camsap3, были созданы с помощью CRISPR/Cas9-опосредованного редактирования генома с помощью электропорации зиготы51. Вкратце, две направляющие РНК и одноцепочечный олигодезоксинуклеотид (ssODN) были сконструированы для удаления области 22-kb, а сайт EcoRI был добавлен с целью распознавания для успешной вставки у мутантных мышей. Для электропорации кРНК, tracrРНК, ssODN и белок Cas9 вводили в зиготы C57BL/6. После электропорации зиготы переносили в псевдобеременных самок мышей ICR, а мышей-основателей подвергали скринингу с помощью ПЦР и секвенирования ДНК. Были получены мыши с нокаутом дерева (#4, #10, #23), и одна из них (#23) имела сконструированный нокаутный аллель EcoRI. Последовательности направляющих РНК были разработаны CRISPRdirect (https://crispr.dbcls.jp). Последовательности crРНК, tracrРНК и ssODN, используемые для редактирования генома, были синтезированы следующим образом: 5'-кРНК, 5'-UGA UCC CAC ACA UAU GCA GGg uuu uag agc uau gcu guu uug-3', 3'-кРНК , 5'-CAGCCCACCUCUGAUC UGACCguuuuagagcuaugcuguuuug-3'; tracrRNA, 5'-AAACAGCAUAGCAAGUUAAAAAUAAGGCUAGUCC

ГУУАУКААКУУГААААГУГГКАЧКАГУКГГУГКУ-3'; ssODN, 5'-TAGAACTTACTGTATAGTAAT

AGCCACAAACTCCATATGCATATGTGAACTCCACCTGAATTCACCTGGCAAGAGATTCCAGACCAG

CTCTCCTCTCCTGGGCCTCCTCCACCCCCACAT-3′ . Прописные и строчные буквы обозначают кодирующую и вспомогательную последовательности соответственно. Линию мышей #23 трижды скрещивали с C57BL/6, и в экспериментах использовали мышей поколения N3.

Эксперименты с использованием мышей были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Центра исследования динамики биосистем RIKEN или Университета Васэда и проводились в соответствии с протоколами, предоставленными этими комитетами. Исследование проводилось в соответствии с рекомендациями ARRIVE: https: //arriveguidelines.org.

Генотипирование. Генотипирование мышей проводили методом ПЦР. Для мышей Camsap3dc/dc мы использовали праймеры, описанные Toya et al. (2016). Для мышей Camsap3–/– мы использовали следующие праймеры для обнаружения аллеля дикого типа (WT) (P1/P2, 411 п.н.) или Camsap3–/– (P1/P3, 614 п.н.) (дополнительная рис. S2a, b) : P1, 5'-CATGTACCTACCACC ATCC-3'; P2, 5'-GGACCCTGGAGAGGCTTAG-3'; P3, 5'-GCAAGGCTGTAGTGAGCC-3'. Область P1/P3 у WT не амплифицировали в используемых условиях ПЦР.

Гистология: подготовка срезов замороженных тканей. Рассеченную ткань почки фиксировали в 2-процентном растворе параформальдегида (Termo Fisher)/0,1 М сорбита (Nacalai Tesque)/РЕМ-буфере в течение 1 ч при комнатной температуре. Рецепт для PEM: 100 мМ PIPES (Nacalai Tesque), 5 мМ EGTA (Nacalai Tesque) и 5 ​​мМ MgCl2 (Wako), доведенный до pH 6,9 с помощью 2 M KOH. После фиксации ткань почки трижды промывали ФЭМ в течение 10 мин. Десять, криозащиту проводили с помощью сахарозы/ПЭМ: 15-процентная сахароза в растворе ПОМ в течение 2 ч при 4 градусах, затем 20-процентная сахароза в растворе ПОМ в течение ночи при 4 градусах и замена 30-процентной сахарозой в растворе ПОМ в течение ~ 2 часов. на 4 степени. Ткань почки замораживали в смеси ОСТ в форме для заливки (Polysciences, Inc.) в жидком азоте и хранили при температуре -80°С. Замороженные образцы нарезали толщиной 5 мкм с помощью криостата CM1850 (Leica). Срезы на предметных стеклах хранили при температуре -80° до окрашивания.

Гистология: Приготовление срезов тканей, залитых парафином. Рассеченную ткань почки фиксировали в растворе Super Fix (Kurabo) в течение 2 ч при комнатной температуре, затем переносили на ночь при 4 градусах. Каждый образец подвергался воздействию трех водно-этанольных растворов возрастающей концентрации при комнатной температуре: 30 % этанол в течение 3{{20}}} мин дважды, 50 % этанол в течение 3{ {35}} мин и, наконец, 70 % этанола в течение 30 мин. Каждый образец обрабатывали с помощью процессора тканей ASP300 (Leica). В-десятых, образцы ткани почек заливали в парафин (Sakura Finetek) с помощью EG1160 (Leica) и хранили при 4°С. Образцы, залитые парафином, нарезали толщиной 6 мкм с помощью ротационного микротома RV240 (Yamato Kohki). Срезы на предметных стеклах хранили при 4 градусах до окрашивания. Иммунофлюоресцентное окрашивание. Замороженные срезы почек погружали в 0,1-процентный раствор Triton X-100 (Nacalai Tesque)/PEM на 10 мин при комнатной температуре. В-десятых, образцы были проницаемы путем нанесения 0,2% Triton X-100/PEM на 10 минут при комнатной температуре. Образцы снова погружали в 0,1-процентный раствор Triton X-100/PEM на 10 минут при комнатной температуре. Затем образцы блокировали 3-процентным раствором бычьего сывороточного альбумина (BSA; Roche)/0,1-процентным раствором Triton X-100/PEM в течение 30 минут при комнатной температуре с последующей реакцией на первичные антитела в течение ночи при 4°С. Первичные антитела разводили в 3-процентном растворе BSA/0,1-процентном растворе Triton X-100/PEM. Для первичных антител, выращенных у мышей, проводили дополнительное блокирование с помощью блокирующего реагента MOM (Vector Laboratories) перед блокированием в 3% BSA/0,1% Triton X-100/PEM. Блокирующий реагент MOM разбавляли 0,1% Triton X-100/PEM и наносили на образцы на 30 минут при комнатной температуре. После обработки МОМ образцы промывали 0,1-процентным раствором Triton X-100/PEM три раза в течение 5, 10 и 15 минут при комнатной температуре. После реакции с первичными антителами образцы промывали в течение 15 минут при комнатной температуре 0,1% Triton X-100/PEM три раза. Реакцию вторичного антитела проводили в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте. Вторичные антитела разводили в 3-процентном растворе BSA/0,1-процентном растворе Triton X-100/PEM. После реакции образцы промывали 0,1% раствором Triton X-100/PEM три раза в течение 5, 10 и 15 минут при комнатной температуре и герметизировали монтажной средой VECTASHIELD (Vector Laboratories). Антитела и реагенты. ДНК окрашивали раствором DAPI (Dojindo, D523, 1:1000). F-актин окрашивали фаллоидином Alexa Fluor 594 (Termo Fisher, A12381, 1:400). Микротрубочки окрашивали мышиным анти- -тубулином-FITC (DM1A; Sigma Aldrich, F2168, 1:200). Использовали следующие первичные антитела: козьи анти-мегалин (P{83}}; Santa Cruz Biotechnology, sc-16478, 1:200), кроличьи анти-NaCl котранспортеры (MERCK, AB3533, 1:500). ), кроличьи анти-аквапорины-2 (abcam, AB3274, 1:400), козьи анти-SGLT1 (M-19; Santa Cruz Biotechnology, подкожно-20582, 1:200) , анти-SGLT2 кролика (Novus Biologicals, NBP1-92384, 1:200), анти-эзрин мыши (3C12; abcam, ab4069, 1:500), анти-гигантин кролика (Covance, PRB-114 C, 1:700), кроличьи анти-aPKC (Santa Cruz Biotechnology, sc-216, 1:400), козьи анти-DPP IV (R&D Systems, AF954, 1:100), мышиные анти-Na плюс /К плюс-АТФаза (abcam, ab7671, 1:100), мышиный антиацетилированный тубулин (Sigma Aldrich, T6793, 1:200), кролик анти-CAMSAP3 (Tanaka et al., 2012, 1:400), мышь анти-тирозиновый тубулин (Sigma Aldrich, T9028, 1:200), кроличьи анти-Ki-67 (SP6; abcam, ab16667, 1:250), кроличьи анти-YAP (Cell Signaling, #4912, 1:100) ), кроличьи анти-миозиновые антитела 2 (Cell Signaling, #8505, 1:100), кроличьи анти-пьезо1 (Novus Biologicals, N BP1-78446, 1:100), крысиный анти-Е-кадгерин (52, 1:400) и кроличий антимерлин (Sigma Aldrich, HPA003097, 1:100). Использовали следующие вторичные антитела: ослиный Dylight 594-конъюгированный антикозий IgG (Jackson, 1:500), козий Alexa Fluor 488/594-конъюгированный антикроличий IgG (Termo Fisher, A-11034, A -11037, 1:500), козий Alexa Fluor 488/594-конъюгированный антимышиный IgG (Termo Fisher, A-11029, A-11032, 1:500) и козий Alexa Fluor 488–конъюгированный антикрысиный IgG (Termo Fisher, A-11006,

1:400). Специфичность связывания антител против YAP (Cell Signaling, #4912) и против PIEZO1 (Novus Biologicals, NBP1-78446), использованных в исследовании, была подтверждена в предыдущей работе46,53. Окраска гематоксилином и эозином (H&E). Предметные стекла со срезами почек помещали на 55-градусную пластину на 30 мин, чтобы растянуть парафин. Затем образцы дважды погружали в ксилол на 15 мин с последующим погружением в серию 70–100 % этанола: 100 % этанол на 5 мин дважды, 90 % этанол на 5 мин, 80 % этанол на 5 мин и 70 % этанол. этанол в течение 5 мин. После ополаскивания в воде в течение 20 мин и в дистиллированной/деионизированной воде (ddH2O) в течение 1 мин образцы окрашивали в растворе гематоксилина Майера (Wako) в течение 5 мин. Образцы дважды погружали в ddH2O, затем промывали ddH2O в течение 10 мин. Образцы снова погружали в ddH2O и затем окрашивали раствором эозина (Merck) в течение 2 мин. Для отмывания образцы погружали в ddH2O на 30 с с последующим погружением в серию 70–100% этанола и ксилола: 70% этанол на 5 с, 80% этанол на 5 с, 90% этанол на 5 с, 100% этанол. дважды по 5 с и ксилол по 10 мин. Наконец, образцы были запечатаны в глицерине. микроскопия. Изображения были получены с помощью универсального флуоресцентного микроскопа BZ-X710 (Keyence) или лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM880 (Zeiss). Для BZ-X710 использовались объективы Nikon CFI Plan Apo λ 2×, 10×, 40×, 100× и Nikon CFI Plan Fluor 4×. Полученные изображения обрабатывали с помощью программного обеспечения BZ-X Analyzer. Te LSM880 был оснащен инвертированным микроскопом Axio Observer Z1 с масляным иммерсионным объективом Planapochromatum 63×/1,40 NA (Zeiss). Изображения обрабатывались и анализировались с помощью ImageJ и Adobe Photoshop CC2019. Анализ кистозного индекса. Кистозный индекс анализировали с помощью ImageJ с использованием окрашенных H&E изображений горизонтального среза почки. В качестве измерения площади, содержащей кисту, периметр расширенного просвета канальцев отслеживали с помощью функции «Выделения от руки», а его площадь измеряли с помощью функции «Измерение». Эту работу выполняли для всех кист в срезе почки, и площади всех кист складывали вместе, чтобы определить область, содержащую кисту. Таким же образом измеряли общую площадь почек. С помощью функции «Выделения от руки» прослеживали наружную окружность почки и оценивали ее площадь. Наконец, мы рассчитали кистозный индекс, разделив площадь, содержащую кисту, на общую площадь почки.

Определение расширенных канальцев и нерасширенных канальцев. В этом исследовании канальцы с площадью просвета более или равной 500 мкм2 были определены как «расширенные», тогда как канальцы с площадью просвета более<500 µm2="" have="" been="" defned="" as"non-dilated".="" when="" selecting="" a="" "dilated"="" tubule="" in="" camsap3dc/dc="" samples,="" we="" frst="" visually="" picked="" up="" a="" cyst="" that="" was="" not="" recognized="" in="" wt="" samples="" and="" then="" roughly="" measured="" its="" lumen="" area="" using="" imagej.="" if="" the="" value="" was="" ≧500="" µm2,="" it="" was="" regarded="" as="">

Электронная микроскопия. Для электронной микроскопии исследовали самцов мышей P21. Образцы для сканирующей электронной микроскопии готовили по Такахаши-Иванаге54 с некоторыми модификациями следующим образом. Мышей анестезировали изофураном и перфузировали 2% (масса/объем) формальдегида и 2,5% (объем/объем) глутарового альдегида в 0,1 М какодилатном буфере, рН 7,4. Каждую почку вырезали и разрезали на кубики, которые погружали в то же раствор на ночь, а затем промывали 0,1 М какодилатным буфером. Фиксированные образцы переносили через 30 водный раствор диметилсульфоксида в 60 % диметилсульфоксид, а затем разрушали в жидком азоте. Раздробленные образцы промывали 0.1 М какодилатным буфером и помещали в 6 N NaOH на 1{{30}}–20 мин при 60°С. После мацерации в растворе NaOH каждый образец промывали 0,1 М какодилатным буфером, содержащим 0,05% Tween 20, и постфиксировали 1% OsO4 в 0,1 М какодилатном буфере на льду в течение 2 часов. Постфиксированные образцы были: (1) промыты ddH2O и помещены в 1% водный тиокарбогидразид на 20 минут при комнатной температуре, и (2) промыты ddH2O и снова постфиксированы в 1% OsO4 в 0,1 М какодилатном буфере на 1 час при комнатной температуре. . После повторения шагов (1) и (2) образцы промывали ddH2O и окрашивали 0,5% раствором уранилацетата в течение ночи при комнатной температуре. Блоки ткани промывали ddH2O и обезвоживали через последовательную серию этанола, переносили в изопентилацетат и сушили в критической точке с использованием жидкого CO2. Высушенные образцы покрывали напылением осмия и исследовали на сканирующем электронном микроскопе JSM-5600LV при ускоряющем напряжении 10 кВ. Изображения обрабатывались с помощью Adobe Photoshop.

Для просвечивающей электронной микроскопии кубики рассеченных почек фиксировали не менее 2 ч в 2-процентном (вес/объем) формальдегиде и 2,5-процентном (объем/объем) глутаральдегиде в 0.1 М какодилатном буфере при комнатной температуре. Образцы промывали какодилатным буфером 0,1 М и подвергали постфиксации 1% OsO4 в {{10}},1 М какодилатном буфере на льду в течение 2 часов. Затем образцы промывали ddH2O и окрашивали в течение ночи 0,5% водным раствором уранилацетата при комнатной температуре. Окрашенные образцы обезвоживали этанолом с градуированной серией, переносили в пропиленоксид и заливали в Polybed 812 (Polysciences). Ультратонкие срезы вырезали алмазным ножом, дважды окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и наблюдали при ускоряющем напряжении 100 кВ с помощью просвечивающего электронного микроскопа (JEM-1010; JEOL), оснащенного камерой прибора с зарядовой связью ( BioScan модель 792; Гатан). Изображения обрабатывались с помощью Adobe Photoshop.

Анализ мочи и анализ крови. Для сравнения с мышами Camsap3dc/dc, мышей WT (плюс/плюс) и гетерозиготных (плюс/dc) мышей использовали в качестве контроля в этих анализах. Гетерозиготные мыши не проявляют признаков Camsap3.дисфункция10и имеют организованные апико-базальные массивы микротрубочек. Мыши были в возрасте 56–60 недель.

Мышей помещали в метаболическую клетку (TECNIPLAST). Образцы мочи собирали каждый день в течение пяти дней подряд, и собранные образцы хранили при температуре -80 градусов. Наконец, все пять образцов для каждой мыши смешивали так, чтобы конечная смесь отражала среднее состояние каждой мыши за этот период.

Для сбора крови мышам вводили {{0}},02 мл анестезии на грамм массы тела. Состав анестезии: Домитор (ZENOAQ) 30 мкл, Мидазолам (Сандоз) 80 мкл, Веторфале (Мейджи Сейка Фарма) 100 мкл и 0,9% водный раствор NaCl до 1 мл. Кровь забирали путем пункции сердца. Во избежание гемолиза шприц осторожно вводили и вынимали. Каждый образец крови выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч для коагуляции. Затем каждый образец центрифугировали (10,000×g, 25 градусов, 15 минут), собирали сыворотку и хранили при -80 градусах. Все образцы мочи и крови были проанализированы компанией Oriental Yeast Co.