Конъюгат дендример-тесаглитазар вызывает фенотипический сдвиг микроглии и усиливает -амилоидный фагоцитоз† Часть 1

Переключение микроглии из усугубляющего заболевание, «провоспалительного» состояния в нейропротекторное, «противовоспалительное» фенотип является многообещающей стратегией борьбы с множественными нейродегенеративными заболеваниями.

Микроглия — это тип клеток центральной нервной системы, который в первую очередь отвечает за поддержание здоровья и функции нейронов. Они могут секретировать различные факторы роста и нейротрофические факторы и поддерживать нормальную метаболическую активность нейронов, удаляя отходы вокруг нейронов. Исследования последних лет показали, что микроглия тесно связана с памятью. Давайте посмотрим на это вместе.

Во-первых, микроглия может стимулировать нейроны и способствовать их активации, тем самым улучшая память. Высвобождая ряд нейротрансмиттеров, таких как глутамат и аланин, микроглия может способствовать передаче сигналов между нейронами и усиливать сигнальный резонанс глиальных нейронов между пресинаптическими мембранами, дополнительно способствуя возбудимости нейронов и формированию памяти.

Во-вторых, микроглия также может очищать нейроны от отходов, поддерживать нормальную метаболическую активность нейронов и снижать смертность нейронов, тем самым способствуя улучшению памяти. Когда вокруг нейронов накапливается слишком много мусора, это влияет на нормальную метаболическую активность нейронов, что приводит к гибели нейронов и ослаблению их функций, тем самым снижая производительность памяти. Микроглия может поддерживать нормальную метаболическую среду нейронов и снижать смертность нейронов, поглощая и разлагая окружающие отходы, тем самым улучшая память.

Таким образом, микроглия тесно связана с памятью. Способствуя возбуждению нейронов и очистке окружающих отходов, микроглия может еще больше улучшить память и сохранить наш мозг здоровым и активным. Мы должны обратить внимание на защиту здоровья микроглии, чтобы улучшить память. Видно, что нам нужно улучшить память, а цистанхе может значительно улучшить память, потому что цистанхе — это традиционное китайское лекарственное средство, обладающее множеством уникальных эффектов, одним из которых является улучшение памяти. Эффективность Цистанхе обусловлена ​​различными содержащимися в ней активными ингредиентами, в том числе дубильной кислотой, полисахаридами, флавоноидными гликозидами и т. д. Эти ингредиенты могут способствовать здоровью мозга различными способами.

Нажмите «Узнай 10 способов улучшить память»

Провоспалительная микроглия способствует прогрессированию заболевания, выделяя нейротоксические вещества и ускоряя накопление патогенного белка. Было показано, что PPAR и агонисты PPAR переключают микроглию с провоспалительного («M1-подобного») фенотипа на альтернативно активированный («M2-подобный») фенотип. Такие стратегии изучались в клинических испытаниях при неврологических заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, но, вероятно, не увенчались успехом из-за плохого проникновения через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ).

Было показано, что полиамидоаминовые дендримеры с гидроксильными концевыми группами (без присоединения каких-либо нацеливающих лигандов) пересекают поврежденный ГЭБ в месте нейровоспаления и накапливаются в активированной микроглии.

Следовательно, дендримерная конъюгация PPAR/двойного агониста может обеспечить целенаправленное переключение фенотипа активированной микроглии. Здесь мы представляем синтез и характеристику нового конъюгата дендример-PPAR/двойной агонист (D-тесаглитазар).

In vitro D-тесаглитазар вызывает сдвиг фенотипа «M1 на M2», снижает секрецию активных форм кислорода, увеличивает экспрессию генов фагоцитоза и ферментативного расщепления патогенных белков (например, -амилоида, -синуклеина) и увеличивает -амилоидный фагоцитоз.

Эти результаты подтверждают дальнейшее развитие D-тесаглитазара для лечения множественных нейродегенеративных заболеваний, особенно болезней Альцгеймера и Паркинсона.

Введение

Только в Соединенных Штатах в настоящее время насчитывается более 5,3 миллиона человек с болезнью Альцгеймера (БА) и 1 миллион человек с болезнью Паркинсона (БП).1 Поскольку возраст является крупнейшим фактором риска для многих нейродегенеративных заболеваний, распространенность и стоимость лечения этих заболеваний будет продолжать увеличиваться по мере старения населения.

Более того, отсутствие недавних успехов в разработке новых лекарств для лечения этих заболеваний подчеркнуло необходимость разработки инновационных методов лечения.2,3 Эти клинические неудачи подчеркивают трудности в разработке лекарства, включая доставку достаточно высокой концентрации лекарства в мозг для достижения эффективности без вызывая неблагоприятные побочные эффекты.

Нейродегенеративные заболевания, такие как БА и БП, имеют три основных нейропатологических компонента: нейровоспаление, накопление патогенных белков и гибель нейронов. ), которые вызывают гибель нейронов по мере их образования, что предотвращает образование характерных агрегатов.

Однако у людей, у которых в конечном итоге развиваются нейродегенеративные заболевания, микроглия больше не удаляет эти белки эффективно и переходит в усугубляющий заболевание провоспалительный фенотип (обычно обозначаемый как M1).

Хотя классификация преимущественно провоспалительной/противовоспалительной (M1/M2) активации микроглии является чрезмерным упрощением спектра поляризации макрофагов, она все еще используется в качестве широкой номенклатуры для описания доминирующего фенотипа микроглии при нейровоспалении и ответе на терапию.

М1-подобная микроглия высвобождает активные формы кислорода и другие медиаторы воспаления, которые одновременно вызывают гибель нейронов и усугубляют патологию заболевания за счет увеличения производства патогенных белков (например, -амилоида, -синуклеина).

Более того, основные генетические факторы риска развития БА (TREM2 и APOE) экспрессируются на высоких уровнях в микроглии, а путь TREM2/APOE, как было показано, вызывает сдвиг фенотипа амикроглии при БА, боковом амиотрофическом склерозе (БАС) и рассеянном склерозе. модели животных.8

Эти результаты дополнительно демонстрируют роль микроглии в патологии множества нейродегенеративных заболеваний человека. Подход к манипулированию фенотипом микроглии позволит исследователям понять ее роль в нейродегенеративных заболеваниях, а также потенциально является эффективным терапевтическим средством.

Переключение микроглии с фенотипа M1 на противовоспалительный и нейропротекторный (M2) было предложено в качестве терапевтической стратегии для лечения множественных нейродегенеративных заболеваний. Сдвиг фенотипа M1 на M2 в макрофагах и микроглии in vitro и in vivo.

9,10 Было показано, что агонисты PPAR снижают индуцированную ЛПС секрецию активных форм кислорода за счет снижения активности NF-κB, индуцируя деградацию и экспорт NF-κB из ядра, а также лиганд-зависимую трансрепрессию.11

Более того, эпидемиологические исследования показали, что пациенты с диабетом, принимающие росиглитазон или пиоглитазон, имеют меньший риск развития АД и БП.12 Впоследствии росиглитазон и пиоглитазон исследовались в рамках III фазы клинических исследований по поводу БА, но безуспешно.13

Одним из вероятных объяснений неудач вышеупомянутых клинических испытаний является плохой транспорт этих препаратов через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), что ограничивает количество лекарств, достигающих мозга пациентов, участвующих в этих клинических исследованиях.14

Действительно, подсчитано, что ГЭБ предотвращает попадание в мозг около 98% всех низкомолекулярных лекарств, и только часть лекарств, попадающих в мозг, достигает микроглии.15

Кроме того, PPAR является еще одним ядерным рецептором семейства PPAR.16 Он играет роль в липидном гомеостазе и регулировании воспаления, а агонисты PPAR также проявляют противовоспалительные эффекты в микроглии.

Клинические исследования с использованием нейровизуализации, посмертного анализа тканей и биомаркеров спинномозговой жидкости предоставили доказательства того, что ГЭБ нарушается при БА и БП, а также при других нейродегенеративных заболеваниях.

Было показано, что 17 дендримеров полиамидоамина (G4-PAMAM-OH) с концевыми гидроксильными группами 17 поколения по своей природе обходят поврежденный ГЭБ и накапливаются в активированной микроглии без необходимости нацеливания на лиганды после системного введения в нескольких различных моделях нейровоспаления. , в том числе у грызунов, кроликов, собак и приматов.18–28 Примечательно, что G4-PAMAM-OH можно вводить системно и пересекать ГЭБ в моделях заболеваний с легким нарушением ГЭБ, таких как синдром Ретта.29

Кроме того, степень поглощения G4-PAMAM-OH в мозг прямо пропорциональна тяжести заболевания на кроличьей модели церебрального паралича.30 Преимущество дендримеров с гидроксильными концевыми группами заключается в том, что они доставляются неинвазивно по сравнению с высокоинвазивной местной доставкой через череп, необходимый в предыдущих исследованиях с другими наночастицами, такими как поли-эскапролактон и ПЭГ, отрицательно заряженные дендримеры ПАМАМ, квантовые точки и наносоставы, состоящие из полиэтиленимина (ПЭИ) и сульфата декстрана.31–35

Кроме того, эти гидроксильные дендримеры ПАМАМ идеально подходят для трансляции благодаря их масштабируемости и хорошей переносимости профиля безопасности in vivo.36–38 Благодаря положительным данным доклинической эффективности (G4-PAMAM-OH)-N- Конъюгат ацетил-цистеина в настоящее время оценивается в ранних клинических исследованиях детской церебральной адренолейкодистрофии (NCT03500627) и тяжелого воспаления, связанного с коронавирусной болезнью 2019 года (COVID-19) (NCT04458298).

Мы изучили конъюгат дендример-лекарственное средство тесаглитазара (Tesa), присоединенного к дендримеру ПАМАМ с концевыми гидроксильными группами -4 поколения. Тесаглитазар является мощным PPAR/двойным агонистом, который сочетает в себе полезные эффекты PPAR и агонистов PPAR. Он содержит функциональную группу карбоновой кислоты для ковалентной конъюгации с дендримером и для последующего высвобождения.

Были разработаны и клинически протестированы дополнительные гитары, но выбор пал на Tesa из-за большего соотношения активностей PPAR и PPAR, относительно простой химической структуры и профиля безопасности.39–43

Ранее Tesa достигла III фазы клинических испытаний диабета 2 типа в Соединенных Штатах Америки, но потерпела неудачу из-за дозозависимой токсичности, которую можно предотвратить, уменьшив необходимую дозу введения за счет контролируемой доставки дендримеров.39,40,44Поскольку Tesa является PPAR/двойной агонист, его целевая доставка к активированной микроглии в месте нейровоспаления может оказаться весьма полезной.

Здесь мы демонстрируем синтез и характеристику конъюгата дендример-тесаглитазар (D-Tesa) и демонстрируем способность этого соединения индуцировать сдвиг фенотипа от «M1 к M2» в микроглии и усиливать фагоцитоз флуоресцентно меченного -амилоида.

Материалы и методы

Материалы

1-[3-(Диметиламино)пропил]-3-этилкарбодиимидметиодид (EDC), 4(диметиламино)пиридин (DMAP), CuSO4·5H2O, аскорбат натрия, гексиновая кислота и бычий сывороточный альбумин (BSA) были приобретены у Sigma Aldrich, США и использованы в полученном виде (Сент-Луис, Миссури).

Тесаглитазар был получен от AstaTech Inc. (Бристоль, Пенсильвания). Дендример ПАМАМ с этилендиаминовым ядром (поколение 4 с 64 гидроксильными концевыми группами) был получен от Dendritech Inc. (Мидленд, Мичиган) в виде раствора в метаноле.

Дендример хранили в метаноле при 4 градусах и перед использованием выпаривали. Диализную мембрану с пороговой молекулярной массой (MWCO) 1 кДа приобретали у Spectrum Laboratories Inc. (Нью-Брансуик, Нью-Джерси).

Все остальные растворители использовали в безводном виде. Все реакции, за исключением реакции клик-катализируемого алкин-азидного циклоприсоединения (CuAAC) меди(I), проводили в безводных условиях в органической среде на высушенной в печи стеклянной посуде в атмосфере инертного азота. атмосфера.

Для клеточной культуры: модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM), фетальная бычья сыворотка (FBS), пенициллин-стрептомицин (P/S), 0,05% трипсин-ЭДТА и реагент МТТ были получены от Invitrogen (Карлсбад, Калифорния). , США).

Реагент Грисса был получен от Promega (Мэдисон, Висконсин), а TNF-ELISA был получен от R&D Systems (Миннеаполис, Миннесота). Метанол аналитической чистоты был приобретен у Sigma-Aldrich. Трипановый синий был получен от Corning (Манассас, Вирджиния, США).

Процедуры синтеза конъюгатов D-Tesa
Моноазид тетраэтиленгликоля (2) синтезировали по ранее опубликованному протоколу.45

Синтез и очистка Теса-ТЭГ-азида (3).
Tesa (950 мг, 2,32 ммоль) растворяли в 10 мл диметилформамида (ДМФ). К этому перемешиваемому раствору по каплям добавляли моноазид тетраметиленгликоля (2, 662,1 мг, 3,02 ммоль) в ДМФ (1 мл). Затем к реакционной смеси добавляли DMAP (255,4 мг, 2,09 ммоль) и EDC (577,5 мг, 3,02 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в атмосфере продувки азотом при комнатной температуре в течение 24 часов.

Реакцию контролировали с помощью тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Реакционную смесь разбавляли 100 мл дихлорметана (ДХМ) и неочищенную реакционную смесь перемещали в делительную воронку, после чего органический слой трижды промывали насыщенным раствором бикарбоната натрия, затем насыщенным раствором хлорида аммония и, наконец, рассолом.

Органический слой затем сушили безводным сульфатом натрия. Растворитель из органического слоя затем удаляли с помощью ротационного испарителя, раствор повторно растворяли в 3 мл ДХМ и абсорбировали на силикагеле для очистки с помощью хроматографической системы CombiFlash®, используя градиентный метод с этилацетатом/гексаном в качестве растворителей, с получением 3 прозрачного раствора. - желтое масло.

Желаемый чистый продукт элюируется примерно 30–40% этилацетатом. (Выход: 70%). 1H ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ 7,27 (д, J=8,6 Гц, 2H), 7,15 (д, J=1,9 Гц, 2H), 7,08 (д, J=8,6 Гц, 2H), 6,73 (д, J=8,6 Гц, 2H), 4,25–4,14 (м, 2H), 4,07 (т, J {{ 33}}.8 Гц, 2H), 3,94 (дд, J =7.8, 5,2 Гц, 1H), 3,67–3,47 (м, 14H), 3,30 (дд, J=8.7 , 3,8 Гц, 2H), 3,06 (с, 3H), 3,02 (т, J=6.7 Гц, 2H), 2,91–2,84 (м, 2H), 1,08 (т, J=7 0,0 Гц, 3H).ESI-MS: теоретический C28H39N3O10S: 609,24, полученный (M + 1): 610,13.

Синтез и очистка D-YNE (5).

(480 мг, 4,22 ммоль) добавляли к перемешиваемому раствору G4-PAMAM-OH (2,5 г, 0,176 ммоль) в 20 мл безводного ДМФ. К этой смеси добавляли DMAP (430 мг, 3,52 ммоль) и EDC (1 г, 5,28 ммоль).

Реакционную смесь перемешивали под продувкой азотом в течение 24 часов при комнатной температуре. По завершении реакции реакционную смесь переносили в диализную трубку емкостью 1000 MWCO. Диализ в ДМФ проводили в течение 24 часов, и ДМФ меняли примерно каждые шесть часов.

Затем проводили диализ с деионизированной (ДИ) водой в течение 24 часов, при этом воду меняли примерно каждые шесть часов. Наконец, полученное содержимое диализной пробирки лиофилизировали в течение 48 часов, получая белый пушистый порошок. (Выход: 61%). 1H ЯМР (500 МГц, ДМСО) δ 8,10–7,67 (м, внутренний дендримерный амид H), 4,72 (с, поверхность дендримера OH), 4,01 (т,эфир –CH2), 3,32 (м, дендример –CH2), 3,06 (м, дендример и линкер –CH2), 2,85–2,58 (м, дендример –CH2), 2,56–1,89 (м, дендример и линкер –CH2), 1,78–1,61 (м, линкер –CH2). Синтез и очистка D-Tesa (6).

Теса-ТЭГ-азид (3177,8 мг, 0,3{{10}}3 ммоль) добавляли к перемешиваемой смеси D-YNE(5, 35{{2{{27}) }}} мг, 0,023 ммоль) в 5 мл смеси тетрагидрофурана (ТГФ) и воды в соотношении 1:1 с 0,5 мл ДМФ в безопасном для микроволнового реактора флаконе емкостью 20 мл. Для реакции клика CuAAC к реакционной смеси добавляли пентагидрат сульфата меди (11,6 мг, 0,0467 ммоль) и (+)-ласкорбат натрия (9,3 мг, 0,0467 ммоль).

Флакон герметично закрывали, а затем реакционный сосуд помещали в микроволновый реактор Biotage® Initiator и проводили реакцию под воздействием микроволнового излучения мощностью 20 Вт при перемешивании в течение 8 часов при 50 градусах. Реакционную смесь переносили в диализную пробирку с молекулярной массой 1000 CO и проводили диализ ДМФ в течение 24 часов, при этом ДМФ заменяли свежим растворителем примерно каждые 4 часа.

Затем содержимое диализной пробирки переносили в пробирку сокола и добавляли эквивалентное количество деионизированной воды. Дополнительно к содержимому пробирки сокола добавляли 200 мкл раствора динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты.

Эту смесь затем помещали в новую диализную пробирку с молекулярной массой 1000 MWCO и проводили диализ в течение 12 часов в 1000 мл деионизированной воды с добавлением раствора ЭДТА с последующим водным диализом в течение 12 часов.

Затем смесь лиофилизировали в течение 48 часов и получали белый пушистый порошок. (Выход: 64%). 1H ЯМР (500 МГц, ДМСО) δ 8,2–7,6 (м, дендример интернамид H), 7,36 (д, Tesa ArH), 7,21 (д, Tesa ArH), 7,03 (д, TesaArH), 6,76 (д, Tesa ArH), 4,37 (с, Tesa H), 4,18–4,04 (м, линкер H), 3,96 (дд, Tesa и линкер H), 3,70 (м, Tesa и линкер H) ,3,58–3,14 (м, дендример –СН2), 3,14–2.86 (м, дендример–СН2), 2,87–2,49 (м, дендример и линкер –СН2), 2,25 (м, дендример –СН2) , 1,82–1,67 (м, линкер –СН2), 0,97 (т, Теза –СН3).

Методы характеристики

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Спектры ЯМР записывали на спектрометре Bruker 500 МГц при комнатной температуре. Химические сдвиги протонов (δ) указаны в ppm.

1H ЯМР использовался для определения количества молекул Tesa, присоединенных к каждой молекуле D-Tesa, методом протонной интеграции путем сравнения пиков внутренних амидных протонов дендримера при δ 7,6–8,2 м.д. с ароматическими протонами Tesa при δ 7,36–6,76 м.д. и метильных протонов Теза в алифатической области. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Использовали ВЭЖХ (Waters Corporation, Милфорд, Массачусетс), оснащенную бинарным насосом 1525, линейным дегазатором AF, автосамплером 717 plus, фотодиодным матричным детектором 2998 и мульти-λ-флуоресцентным детектором 2475, сопряженным с программным обеспечением Waters Empower.

Использовали обращенно-фазовую колонку Symmetry C18 (Tosoh, Япония) с размером частиц 5 мкм, длиной 25 см и внутренним диаметром 4,6 мм. Соединения контролировали при 210 нм и 254 нм с использованием детекторов PDA.

Растворителем A была вода, пригодная для ВЭЖХ, с 0,1% трифторуксусной кислотой (TFA), а растворителем B был ацетонитрил (ACN) с 5% воды и 0,1% TFA. Используемый метод начинался с 1{ {7}}0 : 0 (ACN: вода), уменьшилось до 10: 90 (вода: ACN) за 5 минут, осталось на этой полярности в течение 15 минут и вернулось к 100 : 0 (ACN: вода) через 5 минут. минут. Скорость потока поддерживали на уровне 1 мл/мин. Масс-спектроскопия.

ESI-MS проводили на масс-спектрометре BrukermicroTOF-II с использованием системы растворителей ацетонитрил/вода (9:1). Для подтверждения брутто-формулы использовали молекулярные ионы в виде протонированных пиков [M + nH]n+ или аддуктов [M + nX]n+ (X=Na, K или NH4).

Динамическое рассеяние света и ζ-потенциал. Для определения размера частиц и распределения ζ-потенциала использовали Zetasizer NanoZS (Malvern Instrument Ltd, Вустер, Великобритания), оснащенный 50 мВт He-Ne-лазером (633 нм). D-Tesa растворяли в DI-воде до концентрации 0,2 мг/мл для DLS и в 10 мМ хлориде натрия до концентрации 0,1 мг/мл для ζ-потенциала.

Измерения проводились под углом 25 градусов с использованием угла рассеяния 173 градуса, как описано ранее.27,46 Исследование высвобождения лекарственного средства. D-Tesa растворяли в концентрации 1 мг мл-1 либо в фосфатном буферном растворе (рН 7,4), чтобы имитировать условия плазмы, либо в растворе цитрата натрия (рН 5,5), чтобы имитировать лизосомальные условия.

Эстеразы из свиной печени (от Sigma Aldrich) добавляли к раствору цитрата натрия в начале исследования высвобождения и пополняли примерно каждые 3 дня во время исследования.

В каждом флаконе содержалось 15 мл образца, и их постоянно встряхивали при 37 градусах на протяжении всего эксперимента. В разные моменты времени собирали дубликаты образцов по 200 мкл для каждого значения pH и впоследствии гасили активность эстеразы добавлением 200 мкл метанола. В качестве контроля служили образцы в нулевой момент времени.

Образцы хранили при температуре -80 градусов, чтобы избежать гидролиза. Образцы дополнительно анализировали с помощью ВЭЖХ и рассчитывали площадь под кривой (при 210 нм) пика свободного лекарственного средства. Площадь под кривой коррелировали с количеством высвободившегося лекарственного средства с использованием калибровочной кривой, в которой известные концентрации свободного Tesa определяли с помощью ВЭЖХ при 210 нм.

For more information:1950477648nn@gmail.com