Разработка многофункционального косметического крема с использованием биоактивных материалов из Streptomyces

Рам Хари Дахал1 , Туан Мань Нгуен1,2, Донг Соп Шим3, Джун Ён Ким4, Чангюль Ли4 и Джайсу Ким1,*

Абстрактный:Различные косметические средства, имеющие одну функцию, все чаще используются, но косметические средства, обладающие многофункциональным действием, остаются ограниченными. Мы стремились разработать многофункциональный косметический крем, обладающийантиоксидант, антитирозиназное, омолаживающее и антимикробное действие. Антимикробное действие осуществляли диско-диффузионным методом. Клеточная токсичность и клеточная пролиферация оценивались в 96-луночном планшете с различными клеточными линиями, такими как HaCaT, RAW264.7, CCD-986Sk, B16F1 и B16F10. Были оценены ингибирование грибной тирозиназы, ингибирование эластазы и активность по удалению радикалов 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил (DPPH) и рассчитана IC50. Мезопористые частицы диоксида кремния были синтезированы с использованием Pluronic P123 и тетраэтилортосиликата (TEOS). Фотографии лица были получены с помощью VISIA-CR (Система визуализации лица для клинических исследований). Шероховатость изображения была проанализирована с помощью программного обеспечения PRIMOS, а яркость изображения была проанализирована с помощью Chromameter CR-400. Неочищенный продукт штамма T65 ингибировал различные патогенные для человека бактерии, такие как Bacillus subtilis, Escherichia coli, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus epidermidis. IC50 неочищенного продукта T65 для активности грибной тирозиназы, эластазы и DPPH по удалению радикалов составляла 58,73, 14,68 и 6,31 мкг/мл соответственно. Неочищенный продукт T65 пролиферировал коллаген типа I в клетках CCD-986Sk до 145,91 процента ± 9,11 процента (среднее значение ± стандартное отклонение; среднее значение за 24, 48 и 72 часа) при 250 пг/мл. Синтезированные мезопористые частицы (SBA-15) подтвердили устойчивую эффективность при контрольном высвобождении в течение трех дней. Формула функционального косметического крема, содержащая встроенный SBA-15 T65, значительно уменьшила шероховатость кожи на 4,670 процента и повысила яркость кожи на 0,472 процента после применения в течение 4 недель. Неочищенный продукт Т65 ингибировал как грамположительные, так и грамотрицательные патогены. Синтезированная мезопористая частица, SBA-15, подтвердила, что физиологически активное вещество высвобождается в условиях устойчивого высвобождения. Неочищенный продукт T65 показал безупречные антимикробные свойства,антиоксидант, омолаживающее и отбеливающее действие с нецитотоксическим действием на различные клеточные линии кожи человека.

Ключевые слова: антиоксидант; цитотоксичность; антитирозиназа; против старения; противомикробный; частицы мезопористого кремнезема; космецевтические составы; эстетическое применение

цистанхе потерянная империя травытакже имеетэффект отбеливания кожи.

1. Введение

Кожа является самым большим органом и наружным покровом человеческого тела. Внешний вид кожи позволяет оценить возраст, пол, здоровье, привлекательность и красоту [1,2]. Косметические продукты широко используются для улучшения внешнего вида кожи и уменьшения старения кожи. Кроме того, местное применение косметики демонстрирует, как повысить привлекательность, манипулируя факторами красоты, связанными с контрастом лица [3,4]. Косметическая промышленность постоянно ищет новые и натуральные биоактивные материалы с антивозрастными, антиоксидантными, антитирозиназными и противомикробными свойствами для космецевтических составов для улучшения подходов к уходу за кожей [5,6].

Старение кожи представляет собой сложный биологический процесс, вызываемый различными внутренними и внешними факторами, который приводит к физиологической дисфункции и потере структурной целостности кожи. Внутреннее старение, обычно известное как естественное старение (хронологическое старение) кожи, связано с гормональными изменениями в зависимости от возраста, тогда как внешнее старение связано с движением мышц, загрязнением окружающей среды, никотином, воздействием солнечной радиации, кофеином, температурой, образом жизни, такими как как диета (питание), недостаток сна, стресс и другие состояния здоровья [7–9]. Эластин помогает коже вернуться в исходное положение после движения, тогда как эластаза, вырабатываемая в ацинарных клетках, разрушает эластин и приводит к старению кожи [9]. Антиэластаза ингибирует эластазу и сохраняет эластин в его исходном состоянии, что предотвращает старение кожи. Косметические средства или средства по уходу за кожей с антивозрастными свойствами положительно влияют на старение кожи [10–13].

Свободные радикалы обычно образуются во время клеточного метаболизма. Активные формы кислорода (АФК) и активные формы азота (РНС), такие как анион-радикал, супероксид, пероксид, гидроксильный радикал, оксид азота (NO), пероксинитрит и хлорноватистая кислота, ответственны за окислительное повреждение клеток, липидов, белков, и ДНК, что приводит к атеросклерозу, канцерогенезу, сердечно-сосудистым заболеваниям, клеточному старению, хроническому воспалению, диабету, гипертонии, мутагенезу, нейродегенерации, ревматоидному артриту, инсульту, септическому шоку и другим дегенеративным заболеваниям [7,14–17]. Антиоксиданты предотвращают окисление белков и образование АФК и АФК, которые могут уменьшить повреждение нормальных тканей свободными радикалами путем борьбы с окислительным стрессом [17-19].

Кожа производит темный пигмент, известный как меланин. Производство меланина предотвращает повреждение кожи УФ-излучением [9]. Однако перепроизводство и накопление меланина вызывают гиперпигментацию кожи, что приводит к эстетическим осложнениям, таким как меланодермия, веснушки, сенильное лентиго, невус и эфелисы [9,20]. Тирозиназа представляет собой гликопротеин, обнаруженный в мембранах меланосом, который отвечает за биосинтез меланина путем гидроксилирования l-тирозиназы до 3,4-дигидроксифенилаланина (l-DOPA) и последующего окисления l-DOPA до допахинона [21]. В результате спонтанной полимеризации допахинон окончательно превращается в меланин [22]. Для поддержания целостности кожи следует контролировать чрезмерное производство меланина. Вот почему открытие новых ингибиторов тирозиназы для разработки космецевтических составов вызвало значительный интерес [23-25].

Антимикробные консерванты добавляют в косметические продукты для поддержания микробиологической чистоты в течение всего периода их применения [26]. Вместо использования косметических консервантов, таких как метилпарабен, натуральные антимикробные соединения, обладающие другими функциями, лучше и полезнее для здоровья человека [27–29]. Вторичные метаболиты, выделенные из бактериальных ресурсов, могут обладать как консервирующими, так и антимикробными свойствами, которые подавляют колонизацию бактериальных патогенов (Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus aureus) в коже [9,26,28].

Биоактивные соединения, продуцируемые почвенными или морскими бактериями, особенно актинобактериями, не изучены и до сих пор не изучены [23,30]. Различные биологически активные соединения, применимые в космецевтической и косметической промышленности, в том числе с антивозрастными, антиоксидантными, антитирозиназными, антимикробными и нецитотоксическими свойствами, имеют большой потенциал для новых применений.

Существует множество исследований биоактивных материалов, выделенных из растений, которые в настоящее время используются в космецевтических препаратах, но доступно очень мало исследований биоактивных материалов из бактерий [9,21,24–27,31]. Это исследование было направлено на оценку космецевтического потенциала экстрактов этилацетата из бактериального штамма Streptomyces sp. T65 за антиоксидантную, антивозрастную, антитирозиназную и антибактериальную активность и любые цитотоксические эффекты на различные линии клеток мыши и человека. Кроме того, мы стремились синтезировать частицы мезопористого кремнезема. Наконец, основной целью данного исследования была разработка конечного косметического продукта для местного применения с использованием биоактивного материала, извлеченного из почвенных микроорганизмов.

2. Материалы и методы

2.1. Реагенты, клеточные линии и оборудование

Все используемые растворители были аналитической чистоты. Клеточная линия меланомы B16-F10, клеточная линия мышиной меланомы B16-F1 и клеточная линия кератиноцитов человека (HaCaT) были приобретены в Американской коллекции типовых культур (ATCC, Манассас, Вирджиния, США). Модифицированную Дульбекко среду Иглса (DMEM), пенициллин-стрептомицин и инактивированную нагреванием эмбриональную бычью сыворотку (HI FBS) приобретали у Gibco (Thermo Fisher Scientific Korea Ltd., Сеул, Южная Корея). Набор для подсчета клеток-8 (CCK-8) был приобретен у Dojindo (Кумамото, Япония). Клеточная линия мышиных макрофагов RAW264.7 и человеческие фибробласты CCD-986Sk были приобретены в Корейском банке клеточных линий (Сеул, Южная Корея). Липополисахарид (LPS, Escherichia coli, серотип O11:B4), сульфаниламид, нафтилэтилендиамин дигидрохлорид, грибная тирозиназа, свиная панкреатическая эластаза, L-тирозин, аскорбиновая кислота, арбутин, N-Succ-(Ala)3-p-нитроанилид , 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид (МТТ), коллаген типа I, твин 20, тетраметилбензидин (ТМБ ), тетраэтилортосиликат (TEOS), плюроник P-123 (поли(этиленгликоль)-блок-поли(пропиленгликоль)-блок-поли(этиленгликоль); ПЭГ-ППГ-ПЭГ) и -меланоцит -стимулирующий гормон (-МСГ) приобретали у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). 1,1-Дифенил-2-пикрилгидразил (DPPH) и олеаноловая кислота были приобретены у Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Первичное антитело COL1A1 (коллаген, тип I, альфа-1) и вторичное антитело, конъюгированное с HRP (пероксидазой хрена), были приобретены у компании Santa Cruz Biotechnology (Санта-Круз, Калифорния, США). Считыватель микропланшетов SpectraMax 340PC384 (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния, США) использовали для чтения 96-луночных планшетов.

2.2. Патогенные бактериальные штаммы

Staphylococcus epidermidis KACC 13234 и Pseudomonas aeruginosa KACC 10185 были приобретены в Корейской коллекции сельскохозяйственных культур (KACC, Чонджу, Южная Корея); Bacillus subtilis KEMB 51201-001, Escherichia coli KEMB 212-234 и Staphylococcus aureus KEMB 7301-069 были получены из Корейского банка экологических микроорганизмов (KEMB, Сувон, Южная Корея); и Propionibacterium acnes KCTC 3314 были приобретены в Корейской коллекции типовых культур (KCTC, Jeongeup, Южная Корея).

2.3. Изоляция и сохранение

Различные образцы почвы были взяты с мелиорированных пастбищ в Хвасоне (37°16′10" с.ш., 126°45′43" в.д.) и в лесу Университета Кёнги (37°18′1" с.ш., 127°2′20" в.д.) в Корее. Бактерии выделяли с помощью метода, описанного ранее [9]. Колонии высевали штрихами на чашки R2A каждую неделю для краткосрочного сохранения и хранили при температуре -80 ◦ C в виде суспензии в бульоне R2A с добавлением 20% (об./об.) глицерина для длительного хранения.

2.4. Скрининг, идентификация и филогенетическая позиция выделенных штаммов

Скрининг косметической и антимикробной активности выделенных штаммов проводили, как описано ранее [9]. Бактерии, обладающие функциями, идентифицировали с помощью секвенирования гена 16S рРНК. Геномную ДНК штаммов выделяли с помощью набора InstaGene Matrix (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) и амплифицировали ген 16S рРНК методом ПЦР с использованием универсальных бактериальных праймеров 27F и 1492R [32]. Продукт ПЦР очищали с помощью многоэкранного фильтрующего планшета (Millipore Corp., Бедфорд, Массачусетс, США) и секвенировали с помощью анализатора ДНК Applied Biosystems 3770XL с использованием набора для циклического секвенирования BigDye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, США). Калифорния, США). Почти полная последовательность соответствует программному обеспечению SeqMan (DNASTAR Inc., Мэдисон, Висконсин, США). Ближайший штамм из выделенных функциональных штаммов был идентифицирован с использованием EzBioCloud [33] и базы данных NCBI GenBank [34]. Родственные последовательности 16S рРНК были получены из GenBank, а филогенетический анализ выполнен с использованием MEGA7 [35].

2.5. Культура бактерий

P.acnes культивировали путем инкубации при 37 ◦C в течение 3–4 дней в анаэробных условиях в анаэробном бульоне Шедлера (Oxoid). Для анаэробной культуры использовали анаэробный сосуд BBL с газогенерирующей контейнерной системой GasPak EZ (Becton Dickinson, NJ, USA). S. epidermidis и S. aureus культивировали в среде TSB (триптический соевый бульон) (Oxoid) при 37°С в течение 24 ч в аэробных условиях. E. coli, P. aeruginosa и B. subtilis культивировали в среде LB (Luria-Bertani) (Oxoid). Выделенные штаммы бактерий культивировали в R2A при 28 ◦C в течение 4–5 сут.

2.6. Ферментация

Для процесса ферментации инокулят готовили в бульоне R2A при 28 ◦C в течение 4–5 дней в 150 часов. Штамм T65 ферментировали с использованием 1–2% инокулята в среде ISP2 (International Streptomyces Project 2) при 28°C в течение 1 недели в 140 часов.

2.7. Добыча

Собранный культуральный бульон центрифугировали при 11 305×g в течение 20 мин при 4°C на центрифуге большой емкости 1736R (LABOGENE, Сеул, Корея). Супернатант культуры фильтровали через фильтровальную бумагу размером 150 мм (Whatman 1001-150, GE Healthcare, Мейдстон, Великобритания) для удаления клеточного дебриса и концентрировали на роторном испарителе при 40°С. Затем концентрированный неочищенный продукт дважды экстрагировали равным объемом с использованием пяти различных растворителей (н-гексан, диэтиловый эфир, дихлорметан, хлороформ и этилацетат). Было обнаружено, что этилацетат является лучшим растворителем, и дальнейшие анализы проводились с использованием экстракта этилацетата. Органический слой отделяли с помощью делительной воронки и упаривали досуха. Наконец, высушенный неочищенный продукт растворяли в метаноле для дальнейшей оценки.

экстракт цистанхе

2.8. Сбор активных фракций препаративной ВЭЖХ (преп-ВЭЖХ)

Активные фракции неочищенного культурального экстракта Т65 собирали с помощью препаративной ВЭЖХ (серии Agilent 1200). В качестве стационарной фазы использовали обратную колонку Shim-pack-PREP-ODS (K) C18 (внутренний диаметр 30 мм × 25 см) с размером частиц 15 мкм. В качестве подвижной фазы использовали 0,1-процентный раствор НСНООН в воде (растворитель А) и ацетонитрил (растворитель В). Концентрация растворителя В составляла от 10 процентов до 100 процентов от 0 до 60 минут и использовали 100 процентов от 60 до 75 минут. Скорость потока составляла 15 мл/мин. Использовался многоволновой детектор (MWD) с длинами волн 208, 230, 254 и 280 нм. Собранные фракции от 14 до 21 мин выпаривали досуха и растворяли в метаноле (неочищенный продукт Т65) для дальнейшей оценки.

2.9. Жизнеспособность клеток клеток HaCaT

Жизнеспособность клеток HaCaT определяли с помощью анализа CCK-8 (набор для подсчета клеток-8) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки HaCaT высевали в 96-луночные планшеты по 104 клеток на лунку, а затем инкубировали при 37°C в течение 24 ч в среде Иглса, модифицированной Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Клетки обрабатывали различными концентрациями сырого продукта Т65 (10 мг/мл, 1 мг/мл, 100 мкг/мл, 10 мкг/мл, 1 мкг/мл, 100 нг/мл и 1 нг/мл) и инкубировали. при комнатной температуре в течение 2 ч во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2, с добавлением 10 мкл реагента CCK-8. Поглощение реакционной смеси измеряли с помощью спектрофотометра для микропланшетов при 450 нм и рассчитывали процент жизнеспособности клеток.

2.10. Оценка антиоксидантной активности

2.10.1. Оценка токсичности в клетках RAW264.7

Клетки RAW264.7 поддерживали в среде DMEM, содержащей 1% FBS, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, при 37°C в инкубаторе с 5% CO2. Клетки RAW264.7 высевали в 96-луночный плоскодонный микротитровальный планшет с плотностью 104 клеток на лунку с различными концентрациями (0–1 мг/мл) сырого продукта T65 и инкубировали при 37 ◦C в течение 24 часов. ч в инкубаторе с 5% CO2. Через 24 ч инкубации клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), в каждую лунку добавляли по 190 мкл свежей среды и 10 мкл рабочего раствора МТТ (5 мг/мл), после чего планшет инкубировали при 37 ◦C в течение 4 ч в инкубаторе с 5% CO2. Затем супернатант удаляли, а образовавшиеся кристаллы формазана солюбилизировали, добавляя в каждую лунку по 150 мкл ДМСО (диметилсульфоксида) на 10 мин при 37 ◦C в инкубаторе с 5% CO2. Интенсивность растворенных кристаллов формазана количественно определяли с помощью устройства для считывания микропланшетов при 570 нм.

2.10.2. Определение оксида азота

Клетки RAW264.7 (105 клеток/мл) предварительно обрабатывали различными концентрациями неочищенного продукта Т65 (15,5–125 мкг/мл) в течение 30 минут с последующей стимуляцией 1 мкг/мл ЛПС в течение 24 часов. Концентрацию выделившегося из клеток NO определяли реактивом Грисса по стандартной кривой NO2– [36]. 100 мкл культурального супернатанта инкубировали со 100 мкл реактива Грисса (смесь N-1-нафтилэтилендиаминдигидрохлорида (NEDHC) и сульфаниламида) при комнатной температуре в течение 20 мин в темноте. Поглощение измеряли при 540 нм.

2.10.3. Анализ удаления свободных радикалов DPPH

Мероприятия по удалению свободных радикалов DPPH проводились в соответствии с ранее описанным методом [9]. Неочищенный продукт экстракта культуры Т65 разводили до концентраций 600, 200, 100, 20 и 4 мкг/мл в метаноле. Реакционную смесь объемом 180 мкл готовили из 90 мкл 0,1 мМ DPPH (растворенного в МеОН) и 90 мкл растворов образцов различной концентрации (таблица S1). Тестовые реакции тщательно перемешивали в 96-луночных планшетах, инкубировали при 37 ◦C в течение 30 мин и измеряли поглощение при 516 нм с помощью спектрофотометра. Процент ингибирования DPPH рассчитывали следующим образом:

Ингибирование (проценты)=[1 - (ODexp - ODcon) / (ODstd - ODbln)] × 100 (1)

где ODexp – оптическая плотность экспериментального образца; ODcon — поглощение контроля; ODstd — абсорбция стандарта; и ODbln — поглощение контрольного образца.

2.11. Оценка антивозрастной активности

2.11.1. Оценка цитотоксичности в клетках CCD-986Sk

Клеточная цитотоксичность различных концентраций (0–1 мг/мл) неочищенного продукта T65 в клетках фибробластов кожи человека (CCD-986Sk) определяли с помощью МТТ-анализа, как описано ранее для МТТ-анализа RAW264.7 клетки.

2.11.2. Пролиферация фибробластов человека с использованием клеток CCD-986Sk

Пролиферацию клеток дермального фибробласта человека (HDF) определяли в клетках CCD{{0}}Sk с использованием анализа CCK-8. Клетки CCD-986Sk высевали в 96-луночные планшеты в количестве 5 × 103 клеток/лунку, а затем инкубировали при 37°C в течение 24 ч в среде DMEM, содержащей 10% FBS. Клетки обрабатывали сырым продуктом Т65 различной концентрации (0–1 мг/мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2, с добавлением 10 мкл реагента CCK-8. Поглощение реакционной смеси измеряли с помощью устройства для считывания микропланшетов при 450 нм и определяли процент жизнеспособных клеток по сравнению с поглощением необработанных клеток.

Цистанхе борется со старением.

2.11.3. Анализ синтеза коллагена I типа

Синтез коллагена I типа оценивали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Клетки CCD-986Sk высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 5 × 103 клеток/лунку в среде DMEM, содержащей 10 процент FBS, и инкубировали при 37 ◦ С в течение 24 часов. Различные концентрации неочищенного продукта Т65 (31,25–25{{30}} пг/мл) добавляли в среду, не содержащую FBS, на 24 часа. Затем в покрытые коллагеном 96-луночные планшеты добавляли по 1{35}}0 мкл культуральной среды и коллагена I типа и инкубировали при 37 ◦C в течение 24, 48 и 72 часов. Каждую лунку промывали 0,05% фосфатно-солевым буфером с 0,1% Tween 20 (PBST), добавляли первичное антитело COL1A1 и инкубировали в течение 1 часа. Лунки снова промывали 0,05% PBST, добавляли вторичное антитело, конъюгированное с HRP (пероксидаза хрена), и инкубировали в течение 1 часа. Каждую лунку промывали 0,05% PBST и добавляли ТМВ (тетраметилбензидин). После получения желаемой интенсивности окраски (синий) реакцию останавливали добавлением 0,5 н. H2SO4, что окрашивало раствор в желтый цвет. Поглощение измеряли при 450 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов и определяли продукцию коллагена I типа.

2.11.4. Анализ ингибирования эластазы

Активность ингибирования свиной панкреатической эластазы (PPE) оценивали в соответствии с ранее описанной процедурой [9]. Неочищенный продукт Т65 разбавляли до концентраций 30{{10}}0, 1000, 500 и 100 мкг/мл в метаноле. Реакционную смесь готовили с использованием 0,2 М Tris-HCl буфера (рН 8,0), 0,5 мМ N-Succ-(Ala)3-ρ-нитроанилида (SANA) в качестве субстрата, свиной панкреатической эластазы (3,5 ЕД/мл в 0,2 М Трис-HCl-буфер, рН 8,0) и ингибитор (образец). Каждый образец предварительно инкубировали при 37°С в течение 15 мин, а всю реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 20 мин. Поглощение измеряли при 400 нм. Общий объем реакционной смеси объемом 150 мкл был приготовлен, как показано в таблице S2. Конечные концентрации образца в реакционной смеси составляли 300, 100, 50 и 10 мкг/мл. Процент ингибирования PPE рассчитывали по формуле (1).

2.12. Оценка отбеливающих действий

2.12.1. Оценка цитотоксичности в клетках B16F1

Цитотоксичность неочищенного продукта Т65 по отношению к клеткам меланомы B16F1 определяли с помощью анализа МТТ. Клетки B16F1 высевали в 96-луночные планшеты по 104 клетки на лунку, а затем инкубировали при 37°C в течение 24 ч в среде DMEM, содержащей 10% FBS. Клетки обрабатывали различными концентрациями сырого продукта Т65 (0–1 мг/мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч во влажной атмосфере, содержащей 5% СО2. Поглощение реакционной смеси измеряли с помощью спектрофотометра для микропланшетов при 450 нм и рассчитывали процент жизнеспособности клеток.

2.12.2. Ингибирование синтеза меланина в клетках B16F10

Клетки B16F10 предварительно обрабатывали -MSH в 6-луночных планшетах по 105 клеток на лунку и инкубировали при 37°C в течение 24 ч в среде DMEM, содержащей 10% FBS, для стимуляции синтеза меланина. Клетки инкубировали с различными концентрациями неочищенного продукта Т65 (31,25–125 мкг/мл) и 100 мкг/мл арбутина в качестве положительного контроля в присутствии или в отсутствие -МСГ в течение 48 часов. Наблюдали ингибирование синтеза меланина в клетках меланомы B16F10.

Цистанхе ингибирует образование меланина.

2.12.3. Анализ ингибирования тирозиназы грибов

Активность ингибирования тирозиназы грибов определяли, как описано ранее [9]. Неочищенный продукт Т65 разбавляли до концентраций 3000, 1000, 500 и 100 мкг/мл в метаноле. Реакционную смесь готовили с использованием 0,1 М калий-фосфатного буфера (рН 6,8), 3 мМ раствора 1-тирозина [растворенного в ДВ (дистиллированной воде)] и 2000 ЕД/мл грибной тирозиназы (растворенной в 0,05 М калий-фосфатном буфере, рН 6,8). ; Sigma) в 96-луночных планшетах. Общая тестовая смесь объемом 150 мкл (120 мкл фосфатного буфера, 10 мкл л-тирозина, 15 мкл раствора образца и 5 мкл грибной тирозиназы; таблица S3) инкубировали при 37°C в течение 10 мин и измеряли поглощение при 475 нм. Конечные концентрации образца в реакционной смеси составляли 300, 100, 50 и 10 мкг/мл. Стандарт был без раствора образца, контроль был без 1-тирозина, а бланк был без 1-тирозина и раствора образца. Процент ингибирования тирозиназы рассчитывали по формуле (1).

2.13. Анализ аминокислот

Свободную аминокислоту в сыром продукте Т65 определяли методом GC-FID (газовая хроматография – пламенно-ионизационный детектор) в Корейском институте испытаний и исследований полимеров (Коптри). Для метода ГХ-ПИД использовалась установка Agilent 6890N GC-FID; колонка ZB-AAA (10 м × 0,25 мм); температура инжекторной части 250 ◦С; инъекционная колонка, 2 мкл; коэффициент деления 5:1; температурный режим, 110°С → 32°С/мин → 320°С; детектор, ПИД при 320 ◦C; носитель, газообразный азот, 1,5 мл/мин; производитель, Феноменекс; стандарт аминокислоты; концентрация 200 мкмоль/л.

Составные аминокислоты сырого продукта Т65 определяли методом GC-FID (газовая хроматография – пламенно-ионизационный детектор) в Корейском институте испытаний и исследований полимеров (Коптри). Для ГХ-ПИД использовалась установка Agilent 6890N GC-FID; колонка ZB-AAA (10 м × 0,25 мм); температура инжекторной части 250 ◦С; инъекционная колонка, 2 мкл; коэффициент деления 5:1; температурный режим, 110°С → 32°С/мин → 320°С; детектор, ПИД при 320 ◦C; носитель, газообразный азот, 1,5 мл/мин; производитель, Феноменекс; стандарт аминокислоты; концентрация 200 мкмоль/л.

2.14. Жирная кислота

Жирную кислоту сырого продукта Т65 определяли методом GC-FID (газовая хроматография – пламенно-ионизационный детектор) в Корейском институте испытаний и исследований полимеров (Коптри). Для ГХ-ПИД использовалась установка Agilent 6890N GC-FID; колонка Supelco SP-2500 (100 м × 0,25 мм × 0,20 мкм); температура инжекторной части 250 ◦С; инъекционная колонка, 1 мкл; коэффициент разделения 50:1; температурный режим, 100 ◦С (4 мин) → 3 ◦С/мин → 240 ◦С (15 мин); детектор, ПИД при 285 ◦C; носитель, газообразный азот, 0,8 мл/мин; производитель, SUPELCO 37 Component FAME Mix; концентрация 0,5 мг/мл.

2.15. Антимикробная активность

Ингибирование патогенных бактерий осуществляли диско-диффузионным методом. Сто микролитров культуры P. acnes с концентрацией 108 КОЕ (колониеобразующих единиц)/мл распределяли и инкубировали при 35°C в анаэробных условиях в течение 2–3 дней на чашках с агаром Шедлера вместе с диском диаметром 6 мм (Whatman), содержащим 15 мкг сырого экстракта растворяли в метаноле и измеряли зоны ингибирования. Аналогично, 100 мкл S. epidermidis, S. aureus, B. subtilis, E. coli и P. aeruginosa в концентрации 108 КОЕ/мл распределяли и инкубировали при 35°C в аэробных условиях на чашках R2A или LBA в течение 1-2 дней и измеряли зоны ингибирования.

2.16. Синтез частиц мезопористого кремнезема

Структурообразующий полимер растворяли в деионизированной воде для приготовления раствора мицелл. Материалы мезопористого кремнезема синтезировали по методикам, описанным в литературе [37]. Для синтеза частиц мезопористого кремнезема (SBA-15) 10 г Pluronic P123 (EO20PO70EO20, BASF Corporation, Florham Park, NJ, USA) растворяли в 55 мл 2 М HCl с последующим перемешиванием при комнатной температуре. температура в течение 30 мин. Далее к раствору добавляли 22 г тетраэтилортосиликата (ТЭОС), перемешивали еще 30 мин и выдерживали при 36 ◦C в течение 24 ч, а затем помещали в печь, в которой поддерживали температуру 100 ◦C, и оставляли для 4 дня в статическом состоянии. Через 4 дня раствор превратился в мутный раствор во флаконе. Мутный раствор фильтровали через два слоя целлюлозной фильтровальной бумаги и промывали EtOH (два раза) и DI (деионизированной) водой (два раза). Полученный отфильтрованный порошок сушили в конвекционной печи при 120 ◦C и помещали в муфельную печь (Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd., Сеул, Южная Корея). Было синтезировано шесть образцов в тех же условиях, но в другой партии. Просвечивающие электронные микрофотографии (ПЭМ) синтезированного SBA-15 были получены в Сеульском национальном университете с помощью просвечивающей электронной микроскопии (Talos L120C; FEI).

2.17. Анализ площади поверхности по методу БЭТ

Размер частиц диоксида кремния измеряли с помощью Mastersizer 2000 (Malvern Instruments Lt., Малверн, Великобритания). Для пробоподготовки для анализа БЭТ (Брунауэра-Эммета-Теллера) 5 г P-123 добавляли к 76 г 2М HCl и перемешивали при 250 об/мин в течение 24 часов. Через 24 часа, когда P-123 полностью растворялся, добавляли 160 мл DI (деионизированной) воды и ТЭОС равномерно (15 мл/мин) и перемешивали при 750 об/мин в течение 24 часов. После этого образовавшийся порошок отделяли фильтрованием, а отделенный порошок помещали в наперсток и промывали раствором Сокслета в течение 24 часов. Затем его промывали деионизированной водой и обжигали в муфельной печи (Hanyang Scientific Equipment Co., Ltd., Южная Корея). Анализы площади поверхности по БЭТ были проведены для подтверждения характеристик порошка, полученного путем синтеза SBA-15. Анализы BET были завершены Университетом Инха и Национальным университетом Чханвон.

Анализатор газовой сорбции (Autosorb iQ, Quantachrome Instruments, Ashland, OR, USA) использовали для исследования площади поверхности и распределения размеров пор приготовленных материалов из мезопористого кремнезема. Площадь поверхности и распределение пор по размерам рассчитывали с использованием программного обеспечения ASiQwin (Anton Paar Quanta Tech Inc., Бойнтон-Бич, Флорида, США) на основе изотерм адсорбции-десорбции. Исходные синтезированные частицы дегазировали при 300 ◦C/3 ч, затем измеряли изотермы адсорбции и десорбции N2 при температуре –196 ◦C. Для расчета общей площади поверхности применялся многоточечный анализ БЭТ.

2.18. Оценка устойчивости

Чтобы подтвердить присутствие Т65 во встроенном SBA-15, были проведены следующие действия: 12 г SBA-15 и 1,2 г неочищенного продукта T65 смешивали в 500 мл ацетонитрила. Раствор перемешивали в течение 18 ч при 30 ◦C. После фильтрации смесь фильтровали и отфильтрованные частицы сушили в конвекционной печи при 100 ◦ C. Чтобы найти саму частицу Т65 в SBA-15, 1 г высушенного T65, заключенного в SBA-15, растворяли в ацетонитриле и добавляли 25 мл 3 М плавиковой кислоты. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч, пока раствор не стал прозрачным. Затем раствор фильтровали, и раствор фильтрата использовали в качестве пробы. Образцы, полученные в вышеописанных экспериментах, анализировали с помощью ВЭЖХ.

Чтобы определить свойство контролируемого высвобождения, 35 мл встроенного SBA-15 выливали в 50 мл минерального масла (M3516; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и хорошо перемешивали. Затем к смеси добавляли 50 мл деионизированной воды и встряхивали при комнатной температуре в течение 6 часов, а затем оставляли на столе на 12 часов. Когда жидкий слой отделяли, водный слой отбрасывали, а 1 мл масляного слоя собирали в качестве образца для ВЭЖХ-анализа. Тот же самый эксперимент повторяли на второй и третий день, и образец снова анализировали с помощью ВЭЖХ.

2.19. Косметическая рецептура и применение

2.19.1. Состав и тест на стабильность

Косметический продукт был составлен из крема типа эмульгатора. Стабильность косметического состава определяли путем выдерживания косметического продукта при различных температурах (37, 45 и 60 ◦С), в том числе в морозильной камере, холодильнике и при комнатной температуре до 28 дней. Стабильность косметического крема наблюдалась на первой, второй, третьей и четвертой неделях.

2.19.2. Клинические испытания, добровольцы и методы применения

Функциональный косметический крем, содержащий неочищенный продукт T65, был нанесен на 21 женщину-добровольца для определения уменьшения морщин и эффективности отбеливания за счет шероховатости и яркости кожи. Все экспериментальные процедуры для участия человека в этом исследовании были одобрены Институциональным наблюдательным советом Elad (IRB) (EL-P-7400). Информированное согласие было получено от всех отдельных участников. Испытания проводились до применения продукта, через 2 недели и через 4 недели. Приблизительно 5 мг косметического продукта наносили два раза в день (утром и вечером) на лицо после очищения лица и мягко распределяли по текстуре кожи. Добровольцам не разрешалось использовать какие-либо другие кремы или продукты за 1 неделю до испытания и во время испытания.

2.19.3. Методы захвата и обработки изображений

Фотографии были захвачены VISIA-CR. Шероховатость изображений анализировали с помощью программного обеспечения PRIMOS (версия PRIMOS 5.8E, Canfield Scientific, Inc., Parsippany-Troy Hills, NJ, USA). Средняя шероховатость (Ra) и максимальная глубина шероховатости (Rmax) рассчитывались по следующей формуле:

Коэффициент Ra или Rmax (в процентах)=(значение до лечения − значение после лечения)/значение до лечения × 100 (2)

Яркость изображений анализировали с помощью Chromameter CR-400. L* — параметр яркости, измеряемый по следующей формуле:

L* скорость увеличения (в процентах)=(значение до лечения − значение после лечения)/значение до лечения × 100 (3)

2.20. Статистический анализ

Статистические расчеты значения IC50 выполняли с помощью статистического программного обеспечения OriginPro 8.5 (OriginLab Corporation, Нортгемптон, Массачусетс, США). Все эксперименты были проведены в трех повторностях, и все результаты были представлены как среднее ± стандартное отклонение трех отдельных экспериментов. Данные анализировали с помощью одностороннего дисперсионного анализа t-критерия независимой выборки (one-way ANOVA) с последующим апостериорным тестом Тьюки с использованием OriginPro 8.5. Различия считали достоверными при p <>

3. Результаты и обсуждение

3.1. Выделение, селекция и филогения выбранных активных штаммов

Всего из собранных образцов почвы было выделено 2285 штаммов бактерий. Результаты скрининга показали, что 102 штамма бактерий обладают функциями, применимыми к космецевтикам (таблица S4). По результатам первичного скрининга Streptomyces sp. Было обнаружено, что T65 обладает более высокой активностью для всех косметических применений, а именно антиоксидантной, антиэластазной, антитирозиназной и противомикробной активностью. Наконец, штамм T65 был выбран для дальнейшей оценки, чтобы определить его потенциальное применение в космецевтике. Филогенетический анализ показал, что штамм T65 сформировал кладу со Streptomyces bungoensis DSM 41781T (наиболее близкий штамм на основе последовательности гена 16S рРНК) с сильным значением начальной загрузки (рис. S1).

3.2. Обнаружение и сбор биоактивного материала

Смешанные биологически активные материалы из этилацетатного культурального экстракта T65 собирали с помощью препаративной ВЭЖХ. Биоактивные материалы измеряли детекторами при длинах волн 208, 230, 254 и 280 нм. Фракции собирали по времени (от 14 до 21 мин). Собранные фракции выпаривали досуха и растворяли в метаноле (неочищенный продукт Т65) и использовали для всех оценок, включая антимикробную активность.

3.3. Цитотоксичность в клетках HaCaT

Жизнеспособность клеток линии клеток кератиноцитов человека (клеток HaCaT) не влияла на сырой продукт T65 до 10 мг/мл. С другой стороны, жизнеспособность клеток увеличивалась в зависимости от дозы при применении концентраций от 10 нг/мл до 10 мг/мл неочищенного продукта T65 (рис. S2). Этот диапазон концентраций приводит к более чем 100-процентной жизнеспособности клеток, что указывает на то, что он способствует пролиферации клеток HaCaT и, таким образом, не токсичен для линии клеток HaCaT.

3.4. Антиоксидантная активность

3.4.1. Цитотоксичность в клетке RAW264.7

Цитотоксичность неочищенного продукта Т65 оценивали по жизнеспособности клеток в макрофагах RAW264.7 методом анализа МТТ. Неочищенный продукт Т65 не проявлял цитотоксического действия на клеточные линии RAW264.7.

Напротив, неочищенный продукт T65 способствовал пролиферации клеток RAW264.7 дозозависимым образом при обработке от 13,5 до 1000 мкг/мл. Когда использовали 1000 мкг/мл неочищенного продукта T65, жизнеспособность клеток RAW264.7 составляла 118,7% (p<0,05). эти="" результаты="" показали,="" что="" сырое="" соединение="" т65="" нетоксично="" до="" 1="" мг/мл="" и="" может="" использоваться="" в="" космецевтических="">

3.4.2. Ингибирование образования оксида азота (NO)

Реактив Грисса использовали для определения уровня NO. Чтобы определить ингибирование NO, RAW264.7клетки обрабатывали 1 мкг/мл ЛПС (липополисахарида) вместе с различными концентрациями неочищенного продукта Т65. Клетки RAW264.7 активировали LPS, и продукцию NO измеряли по концентрации нитрита в культуральной среде. По сравнению с одним ЛПС, неочищенный продукт Т65 значительно (p<{5}},001) ингибировал="" концентрацию="" нитритов="" в="" стимулированных="" лпс="" клетках="" raw264.7="" в="" зависимости="" от="" концентрации="" при="" использовании="" от="" 15,5="" до="" 125="" мкг/мл="" (рис.="" 2).="" макрофаги="" проявляли="" lps-toll-подобную="" экспрессию="" индуцируемой="" no-синтазы="" (inos),="" сигнализируя="" об="" активации="" клеток="" через="" рецепторы="" [38].="" лпс="" является="" активатором="" макрофагов="" и="" играет="" важную="" роль="" в="" продукции="" no="" в="" клетках="" млекопитающих="" [39].="" no="" представляет="" собой="" свободный="" радикал,="" продуцируемый="" иммунокомпетентными="" клетками,="" такими="" как="" макрофаги="" [40].="" продукция="" no="" оказывает="" фагоцитарное="" действие="" на="" макрофаги.="" таким="" образом,="" для="" анализа="" антиоксидантов="" была="" выбрана="" клеточная="" линия="" макрофагов="" raw264.7.="" долгое="" время="" большое="" внимание="" уделялось="" поиску="" природных="" антиоксидантов="" для="" ингибирования="" продукции="" no="" [41].="" при="" концентрации="" 125="" мкг/мл="" неочищенный="" продукт="" т65="" значительно="" снизил="" уровень="" no="" на="" 57,4%="" по="" сравнению="" с="" уровнем="" no,="" продуцируемым="" lps="" с="" концентрацией="" 1="" мкг/мл.="" на="" основании="" ингибирования="" no,="" продуцируемого="" в="" клеточной="" линии="" макрофагов="" raw264.7,="" индуцированных="" липополисахаридами,="" экстракт="" культуры="" t65="" можно="" считать="" мощным="">

DPPPHrAddicial lsScacvaveenginginggpAerccteivnitages в различных концентрациях и значение IC50 неочищенного продукта T65 приведены в Таблице S5. Аскорбиновая кислота (витамин С) использовалась в качестве стандарта, поскольку она используется в лосьонах, кремах, сыворотках и пластырях, которые, как хорошо известно, обладают мощной антиоксидантной активностью для местного применения [42]. Было обнаружено, что IC50 активности DPPH по удалению радикалов для вторичных продуктов витамина C и T65 составляет 5,01 и 6,31 мкг/мл соответственно (рис. 3).

Существует лишь несколько исследований антиоксидантной активности бактериальных изолятов по сравнению с таковыми из растительных материалов, и большинство исследований были сосредоточены на хорошо зарекомендовавших себя растительных продуктах [43–49]. Концентрация продукта 10 мкг/мл была способна удалять 68,66 ± 2,83% свободных радикалов DPPH. IC50 неочищенного продукта T65 был почти сравним с самым сильным антиоксидантом витамином С, что показало, что его можно использовать в качестве антиоксиданта в составе космецевтических препаратов.

3.5.1. Цитотоксичность в клетках CCD-986Sk

Цитотоксичность неочищенных соединений Т65 в клетках фибробластов кожи человека (HDF) оценивали в клеточной линии CCD-986Sk с использованием анализа МТТ. При подаче концентрации неочищенного продукта Т65 от 0 до 1 мг/мл клетки HDF пролиферировали дозозависимым образом до концентрации 500 мкг/мл. Этот результат показал, что неочищенные соединения из T65 не были цитотоксичны для клеток HDF. Однако было обнаружено, что концентрация более 1 мг/мл является цитотоксичной, и только 81,34% клеток выжили по сравнению с контролем (рис. 4).

3.5.2. Распространение HDF

Пролиферацию клеток HDF определяли с использованием клеточной линии CCD{{0}}Sk. Неочищенный продукт T65 пролиферировал клетки HDF в зависимости от концентрации от 0 до 500 мкг/мл (рис. 5). Однако он был цитотоксичен в концентрации 1 мг/мл. Рост эпителиальных клеток дермы человека подтвердил способность уменьшать морщины за счет изменения первичных культивируемых клеток, выделенных из клеток дермы человека, и секретируемого коллагена [50,51].

3.5.3. Синтез коллагена I типа

Синтез коллагена I типа выявляли с помощью ИФА. Неочищенный продукт T65 в концентрации 250 мкг/мл увеличивал концентрацию коллагена I типа в зависимости от дозы до 145,91% ± 9,11% (среднее значение ± стандартное отклонение; среднее значение за 24, 48 и 72 часа). Результаты трех экспериментов через 24, 48 и 72 часа показали синтез коллагена типа I (рис. 6). Таким образом, секреция коллагена клетками дермы, сопровождаемая ростом эпителиальных клеток дермы человека, подтвердила способность соединений Т65 уменьшать морщины.

3.6. Отбеливающие мероприятия

3.6.1. Цитотоксичность в клетках B16F1

Результат цитотоксичности неочищенного продукта Т65 на клетках меланомы B16F1 с помощью анализа МТТ показан на Фигуре 8. Результат инкубации неочищенного продукта Т65 в клетках B16F1 показал нетоксическое действие при концентрации до 1 мг/мл. Клетки B16F1 пролиферировали дозозависимым образом до концентрации 62,5 мкг/мл, но было оценено значимое (p < 0.05)="" дозозависимое="" снижение="" жизнеспособности="" клеток="" от="" 125="" до="" 1000="" мкг/мл.="" однако="" при="" концентрации="" 1="" мг/мл="" наблюдалось="" 99,12%="" ±="" 4,16%="" жизнеспособных="" клеток="" (рис.="" 8).="" результаты="" экспериментов="" показали,="" что="" этилацетатный="" экстракт="" культуры="" штамма="" т65="" не="" обладает="" цитотоксичностью="" по="" отношению="" к="" клеточной="" линии="" меланомы="" b16f1="" и="" может="" быть="" использован="" в="" составе="" косметических="" средств="" для="" отбеливания="" кожи="">

3.6.2. Ингибирование синтеза меланина в клетках B16F10

Для подтверждения отбеливающего эффекта клетки B16F10, клеточная линия, которая секретирует и продуцируетмеланина в клетках. Для стимуляции синтеза меланина в B16F10 добавляли 1 мкг -MSH. В качестве положительного контроля использовали арбутин (100 мкг/мл; имеющийся в продаже отбеливающий агент). Микроскопическое наблюдение этого эксперимента показало почти полное ингибирование меланина при применении 125 мкг/мл экстракта культуры Т65 за 48 ч (рис. 9А, В). Этот эксперимент доказал, что экстракт культуры T65 обладает способностью ингибировать синтез меланина дозозависимым образом и может использоваться в качестве отбеливающего агента для приготовления косметических продуктов для местного применения.

3.7. Мезопористые кремнеземные материалы

Мезопористый материал представляет собой материал, содержащий поры диаметром от 2 до 50 нм в соответствии с номенклатурой IUPAC (Международный союз теоретической и прикладной химии), и, таким образом, мезопористый материал на основе кремнезема представляет собой материал на основе кремнезема с порами диаметром от 2 до 50 нм. Об этом материале впервые сообщалось в 1970-х годах в патентах США, но он не был широко известен в смежных областях, и поэтому аналогичный материал был независимо исследован и снова синтезирован Японией в 1990 году [69]. Более подробное исследование было проведено лабораториями Mobil Corporation, и они назвали этот материал MCM (Mobil christical material) с такими примерами, как MCM-41 или MCM-48, у которых диаметр мезопор колеблется от 2 до 6 мкм. нм [70,71]. Другой исследовательской группе из Калифорнийского университета в Санта-Барбаре удалось 6 лет спустя синтезировать мезопористый кремнезем с большим размером пор (5–30 нм) и назвать его SBA (аморфный материал из Санта-Барбары)-15 [72]. . Материал кремнезема Mesopore изначально был разработан для использования в качестве молекулярного сита из-за его собственной структуры, но в последнее время он нашел широкое применение в доставке лекарств, катализаторах, биосенсорах, накопителях энергии и т. д.

Существуют различные различия в мезопористых материалах SBA-15 и MCM-41. Тем не менее, самый простой способ различить эти два состояния — это толщина стенок кремнезема. SBA-15 с более толстой кварцевой стенкой имеет более стабильную и жесткую структуру по сравнению с MCM-41, имеющей меньшую толщину стенки. Кроме того, синтетический метод SBA-15 проще, чем метод MCM-41. Из-за этих различий SBA-15 был выбран для переноса биоактивного неочищенного продукта T65 внутри мезопор кремнеземного материала.

3.8. Синтез частиц мезопористого кремнезема

После непрерывного прокаливания при 200°С в течение 2 ч и при 600°С в течение 3 ч был получен мезопористый порошок белого кремнезема. В этом процессе были синтезированы SBA-15 с порами 8 нм. Было обнаружено, что размеры частиц SBA-15 составляют 11,539–13,630 мм в диаметре (рис. S4) и были определены на двух разных объектах: в лаборатории Университета Инха и в лаборатории Чангвонского национального университета. Кроме того, все шесть образцов на рисунке S4 были синтезированы одним и тем же методом, но из другой партии.

Когда смесь выдерживали при 60 ◦C и оставляли на 4 дня в статических условиях по описанной выше методике, был знаком SBA-15 с порами 5 нм. Кроме того, при контроле температуры на уровне 120 ◦ C был синтезирован SBA-15 размером 10 нм. Согласно результатам, размер мезопор можно контролировать в зависимости от процесса старения [73]. SBA-15 с порами 10 нм (рис. 11) использовали для дальнейшей обработки, поскольку наноматериалы из мезопористого кремнезема с большими порами лучше доставляют биомолекулы, чем наноматериалы с узкими порами [74].

3.9. Устойчивая оценка производительности

Чтобы определить, обладает ли мезопористый SBA-15 способностью к контролируемому высвобождению, SBA-15 и неочищенный продукт T65 объединяли вместе в деионизированной воде, метаноле, ацетонитриле или растворителе этиленгликоля. Когда SBA-15 смешивали с водой, раствор превращался в суспензию из-за коагуляции между поверхностью кремнезема и водой. Метанол был хорошим растворителем как для диоксида кремния, так и для сырого продукта Т65. Однако из-за токсичности ацетонитрил заменили метанолом. Частицы для коэффициента погружения T65 определяли по значению PV (таблица S13). Как показано в таблице S13, значение PV SBA-15 уменьшилось после погружения в сырой продукт T65. Это показало, что материалы Т65 были хорошо погружены в частицы мезопористого кремнезема.

Чтобы определить, был ли Т65 внутри частицы, сам Т65 исследовали с помощью ВЭЖХ (рис. S5). Как показывают данные, было два специфических пика (внутри красной рамки), которые всегда были видны в случае экстрактов культуры Т65, даже несмотря на то, что партия препарата Т65 была изменена. Эти два пика имели время удерживания 10 мин и 12 мин при 230 нм. Образец фильтрата исследовали с помощью ВЭЖХ, чтобы определить, присутствует ли Т65 внутри встроенного SBA-15. Как показано на рисунке S6, два специфических пика наблюдались около 10 и 12 минут. Кроме того, небольшой пик наблюдался около 18 минут времени удерживания, что очень важно для отслеживания продуктов T65, которые высвобождаются во времени.

На рис. 12 представлен контролируемый выпуск устойчивого теста встроенной SBA T65-15 с 0 до 3 дней. Специфический пик Т65 был виден около 15 и 20 минут с 0 по 3 день. Неочищенные продукты Т65 были должным образом погружены и постепенно секретировались с течением времени. Кроме того, мезопористые материалы на основе диоксида кремния (SBA-15), предложенные в этом исследовании, могут нести физиологически активные вещества в сыром продукте T65, и подтвердили, что физиологически активные вещества высвобождаются в виде замедленного высвобождения после загрузки. Кроме того, мезопористый кремнеземный материал, предложенный в этом исследовании, может в будущем использоваться в качестве хорошего носителя для пропитки различных функциональных материалов и в качестве материала с замедленным высвобождением, поддерживая различные физиологически активные вещества.

4. Выводы

Вторичные биоактивные вещества, извлеченные из почвенных микроорганизмов, представляют интерес для косметических целей благодаря их антимикробной, антиоксидантной, против морщин, отбеливающей коже и противомикробной активности. В этом исследовании описывается новая активность этилацетатного экстракта культуры штамма T65 в отношении функциональных ингредиентов косметических составов. Неочищенный продукт T65 был нетоксичен для различных клеточных линий, таких как HaCaT (кератиноциты человека), RAW264.7 (клетки макрофагов), CCD-986Sk (клетки фибробластов кожи человека) и клетки меланомы B16F1 и B16F10. . Кроме того, неочищенный продукт T65 продемонстрировал усиление синтеза коллагена I типа, что очень важно для уменьшения морщин на коже. Кроме того, неочищенный продукт T65 в достаточной степени ингибирует патогенные бактерии человека, такие как B.subtilis, E.coli, P.acnes, S.aureus и S.epidermidis, что может помочь предотвратить порчу косметического продукта и колонизацию патогенными бактериями. образуя вульгарные угри на коже человека. Кроме того, неочищенный продукт T65 ингибировал тирозиназу грибов для отбеливающего эффекта и эластазу поджелудочной железы свиньи для антивозрастной активности, а также ингибировал радикалы NO и DPPH для антиоксидантной активности. Синтез частиц мезопористого диоксида кремния, SBA-15, доказал, что неочищенный продукт T65 будет эффективен в космецевтических рецептурах с эффективными свойствами контролируемого высвобождения. Наконец, применение косметического продукта in vivo вместе с необработанным продуктом T65 на лицах добровольцев доказало отбеливающий эффект T65 и против морщин. Однако химия различных биоактивных соединений и молекулярные механизмы, связанные с различной активностью ингибирования ферментов и ингибирования патогенов, еще предстоит открыть. В заключение, наше исследование убедительно подтвердило идею о том, что бактериальные ресурсы могут быть добавлены к косметическим продуктам для местного применения для отбеливающего эффекта, против образования морщин, антиоксидантного эффекта и антимикробной активности.

цистанхе фарма специальный

Для более подробной информации, пожалуйста, нажмите здесь.