Циклопентанон проявляет активность против меланогенеза и против морщин при меланоме B16F10

Контакт:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Хи Джин Чон 1, А Кён Ли 1,2, Ё Джин Пак 1,2, Сангвон Ли 1,2, Донгван Кан 1,2, Ён Сок Чжон 1,2, Хэ Ён Чон 1,2 и Хён Рён Мун 1, 2,*

Абстрактный:Воздействие ультрафиолетового (УФ) излучения является основной причиной внешнего старения кожи, что приводит к ее гиперпигментации и образованию морщин. В этом исследовании мы исследовали отбеливающий эффект (2E,5E)-2,5-бис(3-гидрокси-4-метоксибензилиден)циклопентанона (BHCP) на меланому B16F10 и его анти- активность морщин на клетках фибробластов Hs27. Было обнаружено, что BHCP сильно ингибирует тирозиназу со значениями концентрации 50-процентного ингибирования (IC50) 1,10 мкМ и 8,18 мкМ формикофенолята (L-тирозина) и дифенолазы (L-DOPA), а исследование кинетики фермента показало, что BHCP является ингибитором тирозиназы конкурентного типа. . Кроме того, BHCP значительно ингибировал содержание меланина и активность клеточной тирозиназы, а также снижал уровни фактора транскрипции, ассоциированного с микрофтальмом (MITF), уровни фосфорилирования белка, связывающего ответный элемент цАМФ (CREB), и тирозиназы в индуцированном -меланоцитстимулирующим гормоном (-MSH) гормоне. Клетки меланомы B16F10. Кроме того, BHCP ингибировал фосфорилирование p65 и экспрессию матриксных металлопротеиназ (MMP-1, MMP-9, MMP-12 и MMP-13) в фибробластах Hs27. стимулировали УФ-излучением. Таким образом, наши результаты показывают, что BHCP может быть хорошим кандидатом для разработки терапевтических средств для заболеваний, связанных с гиперпигментацией и морщинами.

Ключевые слова: (2E,5E)-2,5-бис(3-гидрокси-4-метоксибензилиден)циклопентанон (BHCP); ингибитор тирозиназы; антимеланогенез; против морщин

Цистанхе этопротив морщин.

1. Введение

Старение кожи представляет собой сложный и прогрессирующий процесс, который приводит к функциональным и эстетическим изменениям кожи, за которые отвечают как внутренние, так и внешние факторы [1]. Внешнее старение кожи вызывается агрессивными факторами окружающей среды, такими как ультрафиолетовое (УФ) излучение, стресс или курение. Однако в основном это вызвано повторным воздействием ультрафиолетового излучения солнца, что называется фотостарением. Фотостарение кожи характеризуется грубыми и глубокими морщинами, толщиной, шероховатостью, диспигментацией и гистологическими изменениями [2–4].

Тирозиназа (EC 1.14.18.1), также известная как полифенолоксидаза, является одним из многофункциональных медьсодержащих ферментов, участвующих в синтезе меланина, и широко распространена в природе [5]. Тирозиназа обычно присутствует в большинстве микроорганизмов, растений, и животные. В растениях тирозиназа действует путем окисления монофенолов в дифенолы (микофенолятная активность) и участвует в окислении о-дифенолов в о-хиноны (дифенолазная активность) с последующим окислением хинонов в темно-коричневые пигменты [6].

Меланогенез представляет собой превращение L-тирозина в 3,4-дигидроксифенилаланин (L-ДОФА), при этом L-ДОФА превращается в ДОФА-хинин [7]. Следовательно, тирозиназа играет важную роль в производстве меланина в меланоцитах, а ингибирование тирозиназы является привлекательной мишенью для улучшения нарушений, связанных с пигментацией, и для разработки отбеливающих агентов [8,9]. Синтез меланина индуцируется несколькими стимулами, такими как ультрафиолетовое излучение и химические вещества, включая изобутилметилксантин (IBMX) и альфа-меланоцитстимулирующий гормон (-MSH). -МСГ связывается со своим рецептором меланокортина 1 (MC1R), впоследствии повышая уровень цитоплазматического циклического АМФ (цАМФ). Повышенный уровень цАМФ активирует протеинкиназу А (PKA), которая индуцирует экспрессию фактора транскрипции, ассоциированного с микрофтальмом (MITF), посредством фосфорилирования белка, связывающего элемент ответа цАМФ (CREB). MITF индуцирует экспрессию тирозиназы, родственного тирозиназе белка (TRP)-1 и TRP-2, что в конечном итоге приводит к усилению синтеза меланина [10]. MITF считается ключевым транскрипционным фактором меланогенеза; поэтому было проведено множество исследований по контролю экспрессии MITF для ингибирования меланогенеза [11].

Известно, что образование морщин тесно связано с деградацией внеклеточного матрикса кожи, а УФ-излучение активирует ядерный фактор-κB (NF-κB), тем самым увеличивая продукцию фрагментации коллагена и металлопротеиназ матрикса (MMP) [2]. MMP представляют собой цинк-зависимые эндопептидазы, которые играют важную роль в ремоделировании структуры внеклеточного матрикса кожи. Таким образом, чрезмерная деградация коллагена и матрикса УФ-индуцированными ММП является характерной чертой фотоповрежденной кожи, и ММП используются в качестве основного маркера УФ-индуцированного фотостарения, а также воспаления кожи [12].

Куркуминоподобные производные диарилгептаноидного скелета включают антиоксиданты, сообщают о противоопухолевой активности, каркасах, включая (2E, 5E)-2,5-бис(3-гидрокси-4-метоксибензилиден)циклопентанон. (БГКП) (рис. 1),проявлять широкий спектр противовоспалительных и антимеланогенных свойств, особенно Leow et al. [19] сообщили о биологической активности и анти-тирозиназе [13–18] дибензилиден-циклопентаноне 2014, которые могут способствовать защитному действию на остеосаркому человека посредством регуляции сигнального пути Wnt/-catenin. Тем не менее, эффекты BHCP против меланогенеза и против морщин еще предстоит открыть, и молекулярные механизмы, лежащие в основе его активности, еще четко не установлены.

Рисунок 1. Структура (2E,5E)-бис(3-гидрокси-4-метоксибензилиден)циклопентанона (BHCP).

В настоящем исследовании мы исследовали потенциал BHCP против меланогенеза и против морщин и попытались определить задействованный механизм, особенно в отношении содержания меланина и активности клеточной тирозиназы, которые были изучены с помощью анализа ингибирования тирозиназы и анализа кинетики фермента. Кроме того, мы продемонстрировали, что BHCP оказывает ингибирующее действие на меланогенез и морщины, что связано с подавлением CREB/MITF/тирозиназы в -MSH-индуцированных клетках меланомы мыши B16F10 и ингибированием фосфорилирования p65 и экспрессии MMP в УФ-индуцированных фибробластах Hs27 человека.

цистанхе из драконьих трав

2. Результаты и обсуждение

2.1. Синтез (2E,5E)-2,5-бис(3-гидрокси-4-метоксибензилиден)циклопентанона (BHCP)

Раствор {{0}}гидрокси-4-метоксибензальдегида (100 мг, 0,66 ммоль, изованилин) и циклопентанона (0,03 мл, 0,33 ммоль) в 1 н. растворе HCl-уксусной кислоты (0,02 мл) перемешивали при 25°С в течение 2 часов. После отстаивания в течение суток реакционную смесь обрабатывали холодной водой в присутствии небольшого количества метанола, фильтровали и промывали холодной водой с получением БГКП (65,9 мг) с выходом 56,9%. БГКП идентифицировали спектроскопическими методами, в том числе 1H и 13C-ЯМР, а также сравнением с опубликованными спектральными данными и анализом тонкослойной хроматографии (ТСХ) [19]. Структура показана на рисунке 1.

BHCP: желтый аморфный порошок (CHCl3); 1H-ЯМР (500 МГц, ДМСО-d6) δ: 9,25 (с, 2H, 2 × OH), 7,28 (с, 2H, 2×виниловый H), 7,14 (д, 2H , J=2.0 Гц, 2 × 2-H), 7,11 (дд, 2H, J=8,5, 2,0 Гц, 2 × 6- H), 7,01 (д, 2H, J=8,5 Гц, 2 × 5-H), 3,81 (с, 6H, 2 × OMe), 3,01 (с, 4H, 2 × CH2) ; 13С-ЯМР (100 МГц, ДМСО-d6) δ: 195,5, 149,9, 147,2, 136,0, 133,1, 129,1, 124,3, 117,5, 112,8, 56,3, 26,6; ESI-MS: m/z 351 (M-H)-.

2.2. Ингибирующее действие BHCP на активность тирозиназы грибов

Как показано в таблице 1, BHCP ингибировал тирозиназу со значениями IC50 1,10 ± 0,12 мкМ и 8,18 ± 0,44 мкМ, тогда как койевая кислота (положительный контроль) имела значения IC50 18,68 ± 1,40 мкМ и 33,89 ± 1,16. мкМ для монофенолазы и дифенолазы соответственно. В нашем предыдущем исследовании синтетических потенциальных ингибиторов тирозиназы мы с помощью молекулярного моделирования обнаружили механизм, согласно которому 3-гидрокси- и 4-метоксигруппы бензилидена имеют большую склонность к связыванию с активным центром тирозиназы [20]. В результате этого исследования было показано, что его функциональные группы (3-гидрокси и 4-метоксигруппы) были связаны со значительным увеличением ингибирующей тирозиназу активности.

Таблица 1. Ингибирующая активность тирозиназы и ферментативно-кинетический анализ BHCP.

Кроме того, механизм, ответственный за ингибирование тирозиназы BHCP, был исследован с помощью ферментативного кинетического анализа в настоящем исследовании (таблица 1 и рисунок 2). Графики Лайнуивера-Берка были построены с использованием данных, полученных в результате кинетических исследований, а константа ингибирования (Ki) была получена из графиков Диксона. Двойные реципрокные графики Лайнуивера-Берка указывали на ингибирование конкурентного типа. Как показано на рис. 2a–c, BHCP действовал как конкурентный ингибитор как L-тирозина, так и L-ДОФА. Кроме того, точки пересечения на оси X графиков Диксона обычно используется для определения типов констант ингибирования фермента (Ki) для комплекса фермент-ингибитор [21,22], где значение по оси x указывает значение -Ki. Как показано на рисунке 2b-d, значения Ki BHCP составляли 1,7 мкМ и 10,5 мкМ в качестве субстратов для L-тирозина и L-ДОФА соответственно. Поскольку значение Ki представляет собой концентрацию, необходимую для образования комплекса фермент-ингибитор, более низкое значение Ki предполагает более эффективное ингибирование тирозиназы.

Рисунок 2. Графики Лайнуивера-Берка (a, c) и Диксона (b, d) для ингибирования фермента тирозиназы BHCP.

2.3. Влияние BHCP на жизнеспособность клеток меланомы B16F10 и клеток фибробластов Hs27

Прежде чем определить, проявляет ли BHCP какую-либо активность против меланогенеза и против морщин, мы исследовали цитотоксичность BHCP по отношению к клеткам B16F10 и Hs27 путем обработки различными концентрациями BHCP в течение разных временных интервалов, а жизнеспособность клеток измеряли с помощью анализа EZ-Cytox. Как показано на рис. 3a,b, до 10 мкМ BHCP в течение 48 ч не снижало выживаемость ни клеток B16F10, ни клеток Hs27. Впоследствии были проведены дальнейшие исследования активности BHCP против меланогенеза и против морщин in vitro с 1, 5 и 10 мкМ.

2.4. Ингибирование BHCP в отношении содержания меланина и активности клеточной тирозиназы в клетках меланомы B16F10

Чтобы определить, оказывает ли BHCP ингибирующий потенциал на содержание меланина в клетках B16F10, индуцированных -MSH, клетки предварительно обрабатывали указанными различными концентрациями (1, 5 и 10 мкМ) BHCP или койевой кислоты (5 мМ) в течение 24 часов, а затем стимулировали. с -МСХ в течение 48 ч. Как показано на рисунке 4а, содержание меланина в клетках, обработанных BHCP в присутствии -MSH, снижалось в зависимости от концентрации, показывая 113 процентов при 1 мкМ, 106 процентов при 5 мкМ и 102 процента при 10 мкМ, по сравнению с контрольная группа, получавшая только -MSH (186 процентов). Интересно, что BHCP (1 мкМ) ингибировал содержание меланина сильнее, чем койевая кислота (5 мМ). Кроме того, был проведен анализ активности клеточной тирозиназы для измерения ингибирующего действия BHCP на клетки B16F10. Как показано на рисунке 4b, BHCP снижался в зависимости от концентрации с активностью тирозиназы на 120 процентов при 1 мкМ, 116 процентов при 5 мкМ и 105 процентов при 10 мкМ по сравнению с контрольной группой, получавшей только -MSH (181). процент). Ингибирующее действие BHCP было намного более мощным, чем у койевой кислоты; ингибирование BHCP при 1 мкМ было выше, чем у койевой кислоты при 5 мМ (131 процент). Эти результаты позволяют предположить, что BHCP оказывает отбеливающее действие за счет ингибирования биосинтеза меланина и внутриклеточного синтеза тирозиназы в меланоцитах B16F10.

Рисунок 4. Ингибирование содержания меланина (а) и активности клеточной тирозиназы (б) BHCP на клетках меланомы B16F10.

2.5. Влияние BHCP на экспрессию MITF/тирозиназы и фосфорилированного CREB в клетках B16F10

MITF, специфический фактор транскрипции, играет ключевую роль в эффективной активации меланогенных генов, включая тирозиназу, катализирующую лимитирующую стадию биосинтеза меланина: TRP-1 и TRP-2. Экспрессия MITF может быть увеличено фосфорилированием CREB [23]. CREB является важным промотором MITF [24, 25], а фосфорилирование CREB в меланоцитах увеличивает экспрессию MITF за счет связывания с CREB (белком, связывающим элемент ответа c-AMP) в меланоцитах [26]. Чтобы выяснить молекулярные пути, ответственные за антимеланогенный эффект BHCP на клетки B16F10, мы исследовали уровни белков ключевых молекул, включая CREB и MITF, которые играют важную роль в меланогенезе, с помощью вестерн-блоттинга. Клетки обрабатывали BHCP или койевой кислотой и затем стимулировали -MSH в течение 48 часов. Временной интервал для измерений соответствовал методологии, описанной в предыдущих исследованиях [27]. Как показано на фиг. 5, уровни тирозиназы и MITF увеличивались с -MSH, но BHCP снижал эти уровни белка. Кроме того, фосфорилирование CREB значительно подавлялось BHCP. Известно, что регуляция -MSH-индуцированного фосфорилирования CREB потенциально важна для регуляции пигментации [28]. Эти результаты показывают, что антимеланогенные эффекты BHCP являются результатом подавления MITF и тирозиназы посредством подавления фосфорилированного CREB. Настоящее исследование предполагает, что выяснение механизма ингибирования BHCP тирозиназы и меланогенеза имеет решающее значение и должно быть дополнительно исследовано в будущем. Хотя клеточная линия меланомы B16F10, как правило, больше подходит для исследования механизмов передачи сигнала in vitro, клеточная линия B16F10 относится к меланоме грызунов. Следовательно, для подтверждения результатов потребуются дальнейшие исследования меланоцитов человека.

2.6. Влияние BHCP на УФ-индуцированную активацию NF-κB p-p65 в клетках Hs27

Затем мы исследовали влияние BHCP на УФ-индуцированную экспрессию медиаторов воспаления с использованием фибробластов Hs27. Ранее сообщалось, что фосфорилирование p65 (Ser536) необходимо для его способности трансактивировать гены [29]. Поэтому уровни белка p-p65 (Ser536) и p65 исследовали во фракции ядра с помощью Вестерн-блоттинга. Как показано на фиг. 6a,b, в клетках Hs27 УФ-излучение повышало уровни белка p-p65 (Ser536) в ядре, тогда как обработка BHCP снижала уровни белка p-p65 (Ser536) в ядре. Соответственно, общее количество p65 в цитоплазме уменьшалось под действием УФ и восстанавливалось под действием BHCP (рис. 6c, d). Хотя уровни экспрессии белка p65 были снижены в цитоплазме и повышены в ядре после УФ-индукции, предварительная обработка BHCP изменила эти тенденции дозозависимым образом. Таким образом, эти результаты предполагают, что ингибирование p-p65 с помощью BHCP может способствовать защитному действию на пигментацию кожи и разрушение коллагена от УФ-излучения.

Фигура 6. Влияние BHCP на уровни экспрессии p-p65 (Ser536) в клетках фибробластов человека Hs27, индуцированных УФ-излучением.

2.7. Влияние BHCP на экспрессию MMP в клетках Hs27.

ММР играют жизненно важную роль в старении кожи. УФ-облучение изменяет соединительные ткани кожи, повышая экспрессию ММП [30,31]. MMP-1 представляет собой фермент, разлагающий коллаген, который ускоряет расщепление коллагена, синтезированного из проколлагена I типа. MMP-9 представляет собой фермент, разлагающий желатин, который расщепляет волокна коллагена, разрезанные MMP-1, увеличивая образование морщин и потерю эластичности. Чтобы изучить эффект BHCP против морщин против индукции ультрафиолета, мы определили уровни белков MMP-1 и MMP-9 с помощью вестерн-блоттинга. Кроме того, клетки, индуцированные УФ-излучением, показали значительно повышенный уровень ММР-13, который инициирует деградацию коллагена типа I и III вместо ММР-1 [32]. Мы исследовали увеличение количества ММР (ММР1, ММР9, ММР12 и ММР13) после обработки УФ-индуцированных клеток Hs27 BHCP в концентрации 1 и 10 мкМ. Как показано на рисунке 7, уровни экспрессии MMP-1, MMP-9, MMP-12 и MMP-13 увеличивались после УФ-индукции; однако обработка BHCP снижала экспрессию в дозе - зависимый способ. Наши результаты показывают, что BHCP может способствовать предотвращению образования морщин за счет снижения аномальной продукции MMP, вызванной воздействием УФ-излучения. Эти результаты подразумевают, что BHCP ингибирует экспрессию MMP в фибробластах Hs27, чтобы предотвратить разложение коллагена и, таким образом, образование морщин. Таким образом, BHCP обладает потенциалом для использования в качестве профилактического и лечебного препарата при кожных заболеваниях.

преимущества стебля цистанхе

3. Материал и методы

3.1. Химикаты и приборы

Грибная тирозиназа (EC 1.14.18.1), -MSH, L-тирозин, 3,4-дигидроксифенилаланин (L-DOPA), диметилсульфоксид (ДМСО) и койевая кислота были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, МО, США). Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), эмбриональная телячья сыворотка, стрептомицин и амфотерицин были приобретены у Gibco Life Technologies Inc. (Карлсбад, Калифорния, США). Антитела против MITF,CREB, p-CREB, p-p65 (Ser536), p65, тирозиназы, MMP-1, MMP-9, MMP-12, MMP-13, TFIIB , и -актин были приобретены у Santa Cruz Biotechnology (Санта-Крус, Калифорния, США). Мембраны из поливинилидендифторида (PVDF) были получены от Millipore Corporation (Бедфорд, Массачусетс, США). Стерильная пластиковая посуда для тканевых культур была приобретена у SPL Labware (Сеул, Корея). В качестве источника УФ-излучения использовалась установка Crosslinker серии 800 (UVP, Калифорния, США) с 6 лампами (8 Вт/лампа). Тонкослойная хроматография и силикагель 60 (меш 230–400) выполнялись на силикагеле F{{27} } пластины с предварительно нанесенным покрытием от Merck Millipore (Дармштадт, Германия). Спектры ЯМР регистрировали с использованием приборов Varian Unity INOVA 400 (400 МГц для 1H, 100 МГц для 13C) и Varian Unity AS 500 (500 МГц для 1H). Значения химического сдвига (δ) приведены относительно соответствующих пиков остаточного растворителя или дейтерированных (δH 2,50 и δC 39,51 для ДМСО). Данные масс-спектрометрии низкого разрешения были получены с помощью масс-спектрометра Expression CMS (Advion, Ithaca, NY, USA).

3.2. Анализ ингибирования тирозиназы грибов

Ингибиторную активность тирозиназы грибов определяли с использованием субстратов как L-тирозина, так и L-ДОФА, на основе процедуры, описанной Jung et al. [23]. Вкратце, добавляли 190 мкл фермента тирозиназы (1000 ЕД, разбавленных грибным тирозиназным буфером, включая 1 мМ L-тирозина и раствор L-ДОФА) в присутствии или в отсутствие соединений (конечная концентрация в диапазоне от 1 до 20 мкМ, растворенных в 100% ДМСО) в каждую лунку 96-луночного планшета, чтобы получить конечный объем 200 мкл. Планшет инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Активность тирозиназы количественно определяли путем измерения поглощения при 492 нм с использованием устройства для считывания микропланшетов (TECAN, Зальцбург, Австрия), а процентное ингибирование (проценты) получали из следующего уравнения:

процент ингибирования=(Ac - As)/Ac × 100 (1)

где Ac — поглощение контроля, а As — поглощение образца. Значения IC50 рассчитывали по логарифмическим кривым и их уравнениям. Показаны средние результаты для трех определений. В качестве положительного контроля использовали койевую кислоту.

3.3. Кинетический анализ ингибирования тирозиназы

Для определения кинетических механизмов были дополнительно использованы два кинетических метода (графики Лайнуивера-Берка и Диксона) [21,22,33]. Для двойных реципрокных графиков Лайнуивера-Берка (график зависимости 1/скорость фермента (1/V) от 1/концентрация субстрата (1/[S])) тип ингибирования определяли с использованием различных концентраций L-тирозина (1, 2, и 4 мМ) и L-ДОФА (0,5, 1 и 2 мМ) в качестве субстратов в присутствии различных концентраций BHCP. Концентрации BHCP были следующими: 0, 0,5, 1,{{20}} и 2,0 мкМ для L-тирозина; и 0, 2,5, 5 и 10 мкМ для L-ДОФА. График Диксона представляет собой графический метод (график зависимости 1/скорость фермента (1/V) от концентрации ингибитора (I)) для определения типа ингибирования фермента и использовался для определения константы диссоциации или Ki для комплекса фермент-ингибитор. Графики Диксона (одиночные реверсивные графики) ингибирования были получены в присутствии субстрата L-тирозина в концентрациях 1, 2 и 4 мМ и {{40}}, 0.5, 1.{ {47}} и 2,0 мкМ для BHCP; и субстрат L-DOPA при {{50}},5, 1,0 и 2,0 мМ и 0, 2,5, 5,0 и 10,0 мкМ для BHCP.

цистанхе растениеявляется ингибитором тирозиназы.

3.4. Клеточные линии и клеточная культура

Клетки мышиной меланомы B16F10 были получены из Корейского банка клеточных линий. Линия клеток фибробластов кожи человека Hs27 была приобретена в Американской коллекции типовых культур (ATCC, Манассас, Вирджиния, США). Эти клетки выдерживали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина во влажном инкубаторе с 5% CO2 при 37°C. Дермальные фибробласты на чашке диаметром 100 мм обрабатывали BHCP и подвергали воздействию УФ-излучения 50 мДж/см2 в бессывороточной среде DMEM (источник УФ-излучения, UVP). Клетки Hs27 культивировали до 70–80% слияния в чашке диаметром 100 мм и использовали между 5 и 15 пассажами.

3.5. Анализ жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток оценивали с помощью набора EZ-Cytox. Вкратце, клетки B16F10 и фибробласты Hs27 высевали в 96-луночный планшет при плотности 1 × 104 клеток/лунку и инкубировали при 37°C в течение 24 часов. Клетки подпитывали свежей бессывороточной средой DMEM, содержащей различные концентрации (0, 1, 2, 5 и 10 мкМ) BHCP, и инкубировали в течение 24 и 48 часов. Затем в каждую лунку вносили по 10 мкл раствора EZ-Cytox и инкубировали клетки в течение 2–4 ч. Измерение поглощения клеток в отсутствие какой-либо обработки расценивали как 100-процентное выживание клеток. Каждую обработку проводили трижды, и каждый эксперимент повторяли трижды.

3.6. Определение содержания меланина

Влияние BHCP на индуцированный -MSH меланогенез в клетках B16F10 основано на ранее использованном методе с небольшими модификациями [34]. Вкратце, клеткам B16F10 (5 × 104 клеток/лунку) в 6-луночных планшетах давали расти до 70–80% слияния. Затем клетки обрабатывали различными концентрациями BHCP (1, 5 и 10 мкМ) или койевой кислотой (5 мМ) в течение 24 часов, а затем стимулировали -MSH (5 мкМ) в течение 48 часов. После обработки клетки дважды промывали ледяным PBS, растворяли в 90 мкл 1 М раствора NaOH, включая ДМСО (5 процентов), при 60 ◦ C в течение 1 ч и измеряли оптическую плотность при 405 нм с помощью микропланшетного спектрофотометра (TECAN, Зальцбург). , Австрия). Чтобы измерить количество меланина в эксперименте, скорость ингибирования в группах лечения рассчитывали по поглощению известных концентраций синтетического меланина, которые корректировали до общего количества белка, который присутствовал в супернатанте клеточных лизатов. Поглощение необработанных клеток измеряли в трех повторностях.

3.7. Анализ активности клеточной тирозиназы

Анализ активности клеточной тирозиназы проводили путем измерения скорости окисления L-ДОФА [35]. Клетки B16F10 при плотности 5 × 104/кл помещали в 6-луночные чашки и инкубировали в течение ночи. Затем клетки обрабатывали различными концентрациями BHCP (1, 5 и 10 мкМ) или койевой кислотой (5 мМ) в течение 24 часов, а затем стимулировали -MSH (5 мкМ) в течение 48 часов. Клетки промывали PBS и лизировали в растворе, содержащем 100 мкл 50 мМ фосфатного буфера (pH 6,5), 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) и 1 % Triton X-100. Затем клетки помещали в морозильную камеру (-80 ◦ C) на 30 мин. После размораживания клеток клеточные экстракты очищали центрифугированием при 12{26}} об/мин в течение 30 мин при 4°С. Всего в 96-луночный планшет добавляли 80 мкл супернатанта и 20 мкл L-ДОФА (2 мг/мл) и измеряли оптическую плотность при длине волны 492 нм каждые 10 мин в течение 1 ч при 37 ◦ C с помощью планшетного ридера ELISA (TECAN, Зальцбург, Австрия).

3.8. Получение цитозольных и ядерных экстрактов клеток Hs27

Клетки Hs27 промывали охлажденным льдом PBS и собирали. Для экстракции цитозольных фракций методом центрифугирование при 12,000 об/мин при 4 ◦C в течение 15 мин, ядерные фракции экстрагировали из осадка буфером, содержащим 10 мМ Трис, 50 ​​мМ KCl, 100 мМ NaCl и ингибиторы протеаз, инкубировали на льду в течение 30 мин, и затем центрифугировали при 13,000×g в течение 30 мин при 4 ◦C для получения ядерных фракций.

3.9. Вестерн-блоттинг

Образцы лизата кипятили в течение 10 мин в буфере для загрузки геля (125 мМ трис-HCl, 4% додецилсульфата натрия (SDS), 10% 2-меркаптоэтанола и 0,2% бромфенола). синий; рН 6,8) в объемном соотношении 1:1. Эквиваленты общего белка для каждого образца разделяли электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле (PAGE) с использованием акриламидных гелей на основе процедуры, описанной Laemmli [36], и переносили на мембраны PVDF при 80 В в течение 2 ч с использованием системы влажного переноса. Мембраны немедленно помещали в блокирующий буфер (5% нежирное молоко) в 10 мМ Трис, рН 7,5, 100 мМ NaCl и 0,1% Твин-20. Блоты блокировали для предотвращения неспецифического связывания при 25°С в течение 2 ч. Затем мембраны инкубировали со специфическими первичными антителами при 4°С в течение ночи, после чего инкубировали со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, при 25°С в течение 1 ч. . Мечение антител обнаруживали по усиленной хемилюминесценции в соответствии с инструкциями производителя. Количественное определение белка проводили с использованием системы визуализации хемилюминесценции Davinch-Chemi TM CAS-400SM (Core Bio, Сеул, Корея). Для определения молекулярной массы использовали предварительно окрашенные белковые маркеры.

3.10. Статистический анализ

Все данные представлены как среднее ± SEM. Данные были проанализированы с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) для различий между обработками с последующим апостериорным тестом Бонферрони. Значение p < 0,05="" считалось="" статистически="">

4. Выводы

Таким образом, результаты настоящего исследования показали, что BHCP оказывает эффект отбеливания кожи за счет ингибирования тирозиназы, которая является ключевым ферментом для биосинтеза меланина в меланоцитах B16F10, индуцированных MSH. Кроме того, BHCP снижал уровни экспрессии белка MMP в фибробластах, индуцированных УФ-излучением, что, как ожидается, будет иметь эффект против морщин. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы подтвердить отбеливающие и разглаживающие морщины эффекты BHCP с помощью животных и клинических исследований. Наконец, было установлено, что BHCP обладает как отбеливающим действием, так и эффектом против морщин, что указывает на его потенциал для разработки терапевтических средств для заболеваний, связанных с гиперпигментацией и морщинами.

что такое цистанхе

Для большей информации, пожалуйста нажмите сюда.