Дифференциальный контроль человеческих Treg и эффекторных Т-клеток в опухолевом иммунитете с помощью Fc-инженерного антитела против CTLA-4

mAb против CTLA-4 эффективны в усилении противоопухолевого иммунитета у людей. CTLA-4 экспрессируется обычными Т-клетками при активации и конститутивно встречающимися в природе клетками FOXP3 плюс CD4 плюс Treg, что поднимает вопрос о том, как анти-CTLA-4 mAb может дифференцированно контролировать эти функционально противоположные популяции Т-клеток в опухолевый иммунитет. Здесь мы показываем, что эффекторные Treg-клетки FOXP3 с высоким потенциалом подавления были в изобилии в тканях меланомы, экспрессируя CTLA-4 на более высоких уровнях, чем проникающие в опухоль CD8 плюс Т-клетки. При стимуляции опухолевым антигеном in vitro мононуклеарных клеток периферической крови здоровых людей или больных меланомой Fc-участок-модифицированные mAb против CTLA-4 с высокой антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (ADCC) и клеточным фагоцитозом (ADCP ) активность избирательно истощала CTLA-4 плюс FOXP3 плюс Treg-клетки и, следовательно, увеличивала опухолевой антиген-специфический CD8 плюс Т-клетки.

Важно отметить, что экспансия происходила только тогда, когда стимуляция антигеном была отложена на несколько дней после лечения антителами, чтобы уберечь CTLA-4 плюс активированные эффекторные CD8 плюс Т-клетки от опосредованного mAb уничтожения. Аналогичным образом, у мышей с опухолями лечение mAb с высоким уровнем ADCC/ADCP против CTLA-4 с отсроченной вакцинацией опухолевым антигеном значительно продлевало их выживаемость и заметно увеличивало продукцию цитокинов инфильтрирующими опухоль CD8 плюс Т-клетками, в то время как лечение антителами одновременно с вакцинацией не было. mAb против CTLA4, модифицированные так, чтобы они проявляли меньшую активность связывания Fc или не проявляли ее вообще, не проявляли такого зависящего от времени усиления иммунитета in vitro и in vivo. Таким образом, высокий уровень ADCC против CTLA-4 mAb может избирательно истощать эффекторные Treg-клетки и вызывать опухолевый иммунитет в зависимости от CTLA-4-экспрессирующих статус эффекторных CD8 плюс Т-клеток. Эти результаты играют важную роль в разработке иммунотерапии рака с помощью моноклональных антител, нацеленных на молекулы, обычно экспрессируемые клетками FOXP3 плюс Treg и опухоле-реактивными эффекторными Т-клетками.

Регуляторные Т-клетки|CTLA-4|FOXP3|иммунотерапия рака|антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность.

Встречающиеся в природе клетки CD25 плюс CD4 плюс Treg, которые экспрессируют транскрипционный фактор FOXP3, играют незаменимую роль в поддержании иммунологической самотолерантности и гомеостаза (1). Тем не менее, они также препятствуют эффективному иммунному ответу против опухолевых клеток, возникающих из самого себя, как показано в выводах о том, что опухоли у мышей могут быть уничтожены просто путем истощения клеток Treg (2–5).

У людей накапливаются доказательства обильной инфильтрации Treg-клеток в различные опухолевые ткани (6–8) и значительной корреляции между инфильтрацией Treg и плохим прогнозом при различных типах рака (9). Таким образом, контроль Treg-клеток в опухолевых тканях, вероятно, является одним из многообещающих способов вызвать эффективный противоопухолевой иммунитет у больных раком.

Что касается противоопухолевого действия, мы обнаружили, что Cistanche Deserticola оказывает очевидное противоопухолевое действие в исследованиях на крысах. 3 Полисахаридные компоненты цистанхе пустынной могут усиливать иммунную функцию организма, способствовать активации лейкоцитов, улучшать иммунный статус организма, а также могут непосредственно воздействовать на опухолевые клетки. Ингибируют пролиферацию, метастазирование и инвазию опухолевых клеток. Также ингибирует ангиогенез. Рост опухоли и метастазирование нуждаются в поддержке роста новых кровеносных сосудов, а полисахаридные компоненты Цистанхе могут ингибировать ангиогенез, тем самым уменьшая рост опухоли и метастазирование.

Нажмите здесь, чтобы купить цистанхе

Человеческие FOXP3-экспрессирующие CD4 плюс Т-клетки гетерогенны по функциям, включая Treg-клетки и несупрессивные обычные Т-клетки. Их можно разделить на три субпопуляции по разным уровням экспрессии FOXP3 и CD45RA (10) (рис. 1А): (i) CD45RA плюс FOXP3lo наивные/покоящиеся Treg-клетки [фракция (Fr). I]; (ii) CD45RA- FOXP3hi эффекторные клетки Treg (Treg) (Fr. II), которые терминально дифференцированы и обладают высокой супрессией; и (iii) CD45RA- FOXP3lo не-Treg клетки (Fr. III), которые лишены супрессорной активности и способны секретировать провоспалительные цитокины. При антигенной стимуляции Fr. I наивные клетки Treg дифференцируются в Fr. Клетки II Treg, которые высоко экспрессируют CTLA-4 (10).

Рис. 1. Преимущественная экспрессия CTLA-4 клетками FOXP3hi Treg в ткани меланомы. (A и B) Репрезентативные участки CD4 плюс окрашивание Т-клеток (A) и частоты каждой фракции (B). РВМС здоровых доноров (HD, n=5), а также РВМС и TIL больных меланомой (n=11 и 14 соответственно) подвергали прямому окрашиванию на CD4, CD45RA и FOXP3. (C и D) Репрезентативные графики экспрессии CCR7 и CD45RA CD8 плюс Т-клетки (C) и сводка каждой подгруппы CD8 плюс Т-клетки (D). (E) CTLA-4-экспрессирующие кластеры (пунктирная линия) в РВМС и TIL от пациентов с меланомой с помощью анализа CyTOF. Показаны графики viSNE CD4 плюс и CD8 плюс Т-клетки с тепловыми картами для указанных уровней экспрессии маркера (n=2). (F) Только поверхностное или поверхностное и внутриклеточное окрашивание CTLA-4 в HD PBMC. (G) Экспрессия поверхностных CTLA-4 каждой клеточной фракцией из TIL и PBMC пациентов с меланомой. Среднее значение ± стандартная ошибка среднего. *P Меньше или равно {{20}}.05, **P Меньше или равно 0.01, ***P Меньше или равно 0,001 и ****P Меньше или равно 0,0001 по однофакторному ANOVA с апостериорным критерием HSD Тьюки.

Хотя большинство келий во о. III не являются Treg-клетками и не дифференцируются в Fr. II клетки eTreg, циркулирующие субпопуляции Т-фолликулярных регуляторных клеток, которые представляют собой CXCR5 плюс CD45RA-, включены в состав Fr. III (11), что указывает на гетерогенность о. III население. Напротив, при наличии в крови этих трех популяций FOXP3 plus в большинстве опухолей наблюдается преобладающая инфильтрация клеток Treg, которые, по-видимому, подавляют эффективные противоопухолевые иммунные реакции у онкологических больных (12). Эти данные свидетельствуют о том, что истощение/уменьшение количества Treg-клеток в опухолях и регионарных лимфатических узлах способствует возникновению и усилению противоопухолевого иммунного ответа, как недавно было продемонстрировано с некоторыми моноклональными антителами (mAb), специфичными к молекулам, специфически экспрессируемым Treg-клетками (13).

CTLA-4 экспрессируется обычными Т-клетками при активации и конститутивно клетками FOXP3 плюс CD25 плюс CD4 плюс Treg. Он играет ключевую роль в Treg-опосредованной супрессии, по крайней мере частично, посредством контроля экспрессии CD80/CD86 антигенпрезентирующими клетками (APC) (14–16). Первоначально считалось, что mAb против CTLA-4 человека, которые клинически эффективны при лечении меланомы (17, 18), блокируют опосредованный CTLA-4 отрицательный сигнал в активированные эффекторные Т-клетки, поддерживая их активированное состояние в атакующие опухолевые клетки. Однако недавние доклинические исследования показали, что mAb против CTLA-4 могут истощать FOXP3 плюс Treg-клетки, особенно в опухолевых тканях, тем самым усиливая опухолевый иммунитет (19–21). У людей, однако, остается спорным вопрос о том, влияет ли CTLA-4 mAb на количество или функцию Treg-клеток или эффекторных Т-клеток, или на то и другое, при усилении противоопухолевого иммунного ответа в клинических условиях.

В этом исследовании мы исследовали in vivo и in vitro, на людях и мышах, эффекты сконструированных Fc моноклональных антител против CTLA-4 на клетки FOXP3 плюс Treg и собственные/опухолевые антиген-специфические CD8 плюс Т-клетки. Мы показываем, что истощающие клетки mAb против CTLA-4 с высокой активностью антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) могут вызывать противоопухолевый иммунный ответ в зависимости от уровней и кинетики экспрессии CTLA-4 с помощью две популяции. Результаты могут быть распространены на истощающие клетки mAb, нацеленные на другие молекулы клеточной поверхности, которые как Treg, так и эффекторные T (Teff) клетки обычно экспрессируют на разных уровнях и с разной кинетикой.

Значение

Анти-CTLA-4 mAb может усиливать противоопухолевый иммунитет, несмотря на экспрессию CTLA-4, за счет функционально противоположных популяций Т-клеток: активированных эффекторных Т-клеток (Teff) и FOXP3 плюс CD4 плюс Treg-клеток. Здесь мы показываем, что mAb против CTLA-4, сконструированные таким образом, чтобы представлять собой истощенные по цитотоксичности клетки Treg, эффективно in vitro у людей и in vivo у мышей. Он размножал антиген-специфические клетки CD8 плюс Teff, когда стимуляция опухолевого антигена была отложена на несколько дней, чтобы защитить их от уничтожения mAb. mAb против CTLA-4, модифицированные для проявления меньшей активности по истощению клеток или ее отсутствия, не показали таких эффектов. Эта стратегия дифференцированного контроля клеток Treg и Teff с помощью цитотоксических mAb против CTLA-4 для создания эффективного противоопухолевого иммунитета поможет в разработке иммунотерапии рака, нацеленной на другие молекулы, обычно экспрессируемые клетками Treg и Teff.

Вклад авторов: DH, A. Tanaka, HN и SS разработали исследование; DH, A. Tanaka, TK, A. Tanemura, DS, JBW, ELL, KWWT, DA и IK провели исследование; А. Танемура предоставил новые реагенты/аналитические инструменты; DH, A. Tanaka, TK, DS, DA, EWN, IK, HN и SS проанализировали данные; и Д. Х., А. Танака и С. С. написали статью.

Рецензенты: Магистр медицины, Токийский медицинский и стоматологический университет; и SAQ, Университетский колледж Лондона.

Заявление о конфликте интересов: HN получила исследовательский грант от Bristol Myers Squibb. SS получил исследовательский грант от Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. TK работает в Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., которая предоставила некоторые антитела, использованные в этом исследовании.

Публикуется по лицензии PNAS.

1 Текущий адрес: Кафедра иммунологии, Высшая школа медицины, Нагойский университет, 466-8550 Нагоя, Япония.

2 Текущий адрес: Отделение иммунологии, Онкологический центр Моффита, Тампа, Флорида, 33612.

3 Текущий адрес: Отделение иммунологии рака, Исследовательский центр онкологических исследований и клинических испытаний, Национальный онкологический центр, 277-8577 Касива, Япония.

4 Кому следует адресовать корреспонденцию. Электронная почта: shimon@ifrec.osaka-u.ac.jp.

Опубликовано в сети 26 декабря 2018 г.

Полученные результаты

Накопление CTLA-4-экспрессирующих терминально дифференцированных клеток FOXP3hi Treg в тканях меланомы.

Сначала мы оценили частоту различных субпопуляций Т-клеток среди инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (ОИЛ) у пациентов с меланомой. Соотношение клеток CD45RA- FOXP3hi eTreg (Fr. II) было преимущественно (~{3}} кратно увеличено среди CD4 плюс TIL по сравнению с CD4 плюс Т-клетками периферической крови у здоровых доноров или пациентов с меланомой (рис. 1 A и B). ). Частота CD45RA- FOXP3lo Fr. III не-Treg-клетки также немного увеличились (~ в два раза) среди CD4 плюс TIL. Напротив, CD45RA плюс FOXP3lo наивные Treg-клетки (Fr. I) были значительно снижены в TIL, в среднем до четверти соответствующей фракции в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC).

Среди FOXP3- обычных CD4 плюс Т-клетки в TIL, CD45RA- FOXP3- эффектор / память CD4 плюс Т-клетки, которые могут быть дополнительно разделены на популяции CD25 плюс (Fr. IV) и CD25- (Fr. V) (10) , немного (примерно в 1,3- раз) увеличилось, в то время как CD45RA плюс FOXP3- наивные CD4 плюс Т-клетки (Fr. VI) значительно уменьшились до одной десятой от таковых в РВМС. Во фракции CD8 плюс Т-клетки TIL по сравнению с PBMC пациентов или здоровых доноров наблюдалось значительное увеличение (примерно в 1,{17}} раза) CD45RA-CCR7- эффекторных Т-клеток памяти (TEM), со значительным снижением количества клеток CD45RA плюс CCR7 плюс наивные и CD45RA плюс CCR7- терминально дифференцированные эффекторные клетки памяти (TEMRA) до половины и одной пятой, соответственно, по сравнению с PBMC, и без значительных изменений в CD45RA- CCR7 плюс T центральной памяти (TCM) клетки (рис. 1 C и D). У пациентов с меланомой также было отмечено, что наивные CD8 плюс Т-клетки в РВМС заметно (~{29}} раз) уменьшились по сравнению со здоровыми донорами.

Затем мы оценили, какая популяция Т-клеток экспрессировала CTLA-4 в TIL или PBMC пациентов с меланомой, с помощью цитометрии с помощью времяпролетного (CyTOF) масс-спектрометрического цитометра (рис. 1E и Приложение SI, рис. S1A). Кластер клеток CD4 плюс CD45RA- Foxp3hi, представляющий Fr. Клетки II eTreg преимущественно экспрессировали CTLA4 в PBMC и TIL, в то время как CD8 плюс Т-клетки почти не экспрессировали CTLA-4 как в PBMC, так и в TIL. У мышей преобладающая экспрессия CTLA4 клетками FOXP3 плюс Treg аналогичным образом наблюдалась в селезенке и опухолевой ткани CMS5a (приложение SI, рис. S1B). CTLA4 экспрессируется человеческим Fr. Клетки II Treg находились в основном во внутриклеточном компартменте, а CTLA-4 на клеточной поверхности был ограничен (рис. 1F). Тем не менее в TIL клетки Treg и, в меньшей степени, Fr. Было обнаружено, что клетки III, не относящиеся к Treg, экспрессируют поверхностный CTLA-4 на значительно высоких уровнях (рис. 1G и Приложение SI, рис. S2). TIL CD8 плюс клетки TCM и TEM также экспрессировали более высокий уровень поверхностного CTLA-4 по сравнению с любой из циркулирующих фракций Т-клеток, хотя Treg-клетки демонстрировали гораздо более высокую экспрессию у пациентов с меланомой (рис. 1G и приложение SI, рис. С2).

В совокупности основными особенностями тканей меланомы человека являются заметное увеличение и уменьшение Treg-клеток и наивных Treg-клеток соответственно, а также заметное увеличение эффекторных/памятных CD8 плюс Т-клеток с уменьшением наивных CD8 плюс Т-клеток. Эти Treg-клетки и CD8 плюс Т-клетки в TIL экспрессируют CTLA-4 на клеточной поверхности с более высокой экспрессией первых, чем последних. В отличие от клеток TIL eTreg, циркулирующие клетки eTreg у пациентов с меланомой имеют значительно более низкий уровень поверхностной экспрессии CTLA4, что позволяет предположить, что на них может меньше влиять лечение mAb против CTLA-4.

Снижение количества как Treg-клеток, так и антиген-специфических CD8 плюс Т-клеток путем обработки in vitro разрушающими клетки mAb против CTLA-4 и одновременной стимуляции антигеном.

Чтобы выяснить, будут ли противоопухолевые эффекты mAb против CTLA-4 зависеть от его способности истощать клетки Treg посредством ADCC, мы модифицировали Fc-часть mAb против CTLA-4 IgG1 (клон MDX{{3 }}, ипилимумаб), который обладал умеренной ADCC-активностью, на изменение его аффинности к Fc RIIIa (CD16a), активирующему Fc R, экспрессируемому NK-клетками, моноцитами/макрофагами и другими клетками (22) (рис. 2А). Полученное таким образом mAb против CTLA-4 с высокой ADCC-активностью, которое мы назвали Fc-доменом технологии асимметричной реинжиниринга (ART-Fc), обладало различной аминокислотной заменой в каждой тяжелой цепи (23); то есть замены L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A в одной области Fc тяжелой цепи и замены D270E/K326D/A330M/K334E в другой. Реконструированное mAb показало в 1,{24}}раз более высокую аффинность связывания с человеческим Fc RIIIa, чем немодифицированное mAb, без повышения аффинности к ингибиторному Fc RIIb. Мы также создали mAb против CTLA-4, едва связывающиеся с Fc R, которые мы назвали молчащими Fc анти-CTLA-4, путем аминокислотных замен; то есть L235R, G236R и S239K в область Fc обеих тяжелых цепей. По сравнению с немодифицированным или «молчащим» Fc mAb против CTLA-4, ART-Fc продемонстрировал гораздо более высокую цитотоксичность in vitro по отношению к клеткам яичника китайского хомячка (CHO), экспрессирующим CTLA-4, в присутствии РВМС от здоровых доноров. , с повышенной цитотоксичностью при более длительной инкубации (рис. 2В). Точно так же mAb ART-Fc против CTLA-4 эффективно убивают свежеприготовленные Fr. II Treg и, в меньшей степени, Fr. III не-Treg или Fr. I наивные клетки Treg, в то время как IgG1 (ипилимумаб) или mAb молчащего Fc почти не проявляли убивающей активности (фиг. 2C).

Затем мы оценили влияние этих сконструированных Fc моноклональных антител на антиген-специфическую экспансию in vitro CD8 плюс Т-клеток путем стимуляции РВМС здоровых доноров или пациентов с меланомой, экспрессирующих HLA-A*0201, в течение 9 дней с помощью различных пептидов, например: полученный из Melan-A/MART-1, собственного/опухолевого антигена, экспрессируемого нормальными меланоцитами и некоторыми клетками меланомы (24); и NY-ESO-1, антиген рака/яичка, экспрессируемый различными типами раковых клеток и клетками зародышевой линии человека (25), цитомегаловирусом (CMV) или вирусом гриппа (Flu). Такая стимуляция пептидом in vitro, например, пептидом Melan-A, поддерживала высокую экспрессию CTLA4 клетками Treg (рис. 2D и Приложение SI, рис. S3). Одна только стимуляция пептидом также увеличивала количество пептид-специфического тетрамера (Tet) плюс CD8 плюс Т-клетки, которые экспрессировали более высокие уровни CTLA-4, особенно на клеточной поверхности, по сравнению с клетками Tet- (рис. 2 E, F, и я). Когда ART-Fc анти-CTLA-4 mAb присутствовали с начала пептидной стимуляции РВМС от здоровых доноров или пациентов с меланомой, соотношение CTLA-4-экспрессирующих Treg-клеток среди CD4 плюс Т-клеток было значительно снижается дозозависимым образом, в то время как mAb молчащего Fc не проявляет такого эффекта (рис. 2 D и G и Приложение SI, рис. S4 и S5).

Однако уменьшение Treg-клеток не сопровождалось увеличением количества антиген-специфических CD8 плюс Т-клеток; скорее, лечение вызвало глубокое снижение соотношения Tet плюс CD8 плюс Т-клетки среди CD8 плюс Т-клетки (фиг. 2H). В этих стимуляциях in vitro немодифицированные IgG1 или молчащие Fc анти-CTLA-4 mAb не проявляли значительной активности по истощению eTreg (рис. 2I). Степень снижения количества клеток eTreg под действием этих mAb действительно коррелировала со снижением количества антиген-специфических CD8 плюс Т-клеток, независимо от стимулирующего антигена, например, мелан-А или пептида ЦМВ (фиг. 2I).

Таким образом, в то время как клетки Treg конститутивно экспрессируют CTLA-4, особенно внутриклеточный CTLA-4, стимуляция антигеном увеличивает количество CD8 плюс Т-клетки, которые экспрессируют высокие уровни CTLA-4, особенно на клеточной поверхности. Таким образом, mAb ART-Fc против CTLA-4 с высокой ADCC-активностью способны истощать не только CTLA-4 плюс Treg-клетки, но также антиген-активированные CTLA-4 плюс CD8 плюс Т-клетки. . Этот эффекторный CD8 плюс истощение Т-клеток может компенсировать иммуностимулирующий эффект истощения клеток eTreg в иммунных ответах in vitro.

Рис. 2. Одновременная пептидная стимуляция in vitro с помощью mAb ART-Fc против CTLA-4 ограничивает антиген-специфические ответы CD8 плюс Т-клетки. (A) Резюме аминокислотных замен, сделанных в Fc-фрагменте mAb против CTLA-4 IgG1 человека (клон MDX-010, ипилимумаб) для создания mAb ART-Fc или молчащего Fc, и их аффинности к ингибиторному Fc RIIb или активирующему Fc RIIIa. Аффинность mAb Silent-Fc была ниже предела обнаружения анализа BIACORE. (B) ADCC-активность различных mAb против CTLA4 против клеток CHO, экспрессирующих CTLA-4 человека. Анти-CTLA-4 mAb (ART, усиленные ADCC анти-CTLA-4 ART-Fc; IgG1, обычные немодифицированные анти-CTLA-4 IgG1; бесшумные, Fc-инактивированные анти- CTLA-4 молчащий-Fc) инкубировали с клетками CHO и РВМС HD (n=3) при соотношении E/T 50:1. Среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Звездочки указывают на значительные различия между каждым антителом и молчащим Fc в соответствующих концентрациях для культур {{30}}h (черный) или 24-h (красный). (C) ADCC-активность каждой клеточной фракции CD4 плюс и CD8 плюс Т-клетки из РВМС с помощью ART-Fc, IgG1 или молчащего Fc анти-CTLA-4 mAb (n=4 или 5). Указана частота мертвых клеток среди предварительно меченых клеток CTV после культивирования через {{40}} ч. (D) Выражение CTLA-4 Fr. II Клетки Treg после 9 дней стимуляции пептидом Melan-A и обработки 1 мкг/мл ART-Fc, молчаливого Fc или IgG1 анти-CTLA-4 mAb на целые РВМС (n {{50 }}). (E и F) Экспрессия поверхностных CTLA-4 Tet plus и Tet- CD8 plus T-клетками после указанной пептидной стимуляции. Репрезентативные гистограммы (E) и сводка средней интенсивности флуоресценции (MFI) (F) (Melan-A, n=9; CMV, n=9; Flu, n=3; ESO{{ 57}}, п=4). (G и H) Репрезентативные графики и частоты Fr. Клетки II eTreg (G) и антиген-специфические CD8 плюс Т-клетки (H) от БХ (n=6) или пациентов с меланомой (n=5) после культивирования с указанным пептидом и 1 мкг/мл АРТ -Fc анти–CTLA-4 mAb, как на D. (I) Количественная оценка частоты Treg-клеток (верхний) и Tet плюс CD8 плюс Т-клетки (нижний) после 9 дней стимуляции антигеном Melan-A или CMV до HD РВМС с указанными mAb против CTLA-4 в G и H. Средние значения ± стандартная ошибка среднего. Изображенная значимость между двумя группами была рассчитана с использованием парного t-критерия, однофакторного дисперсионного анализа или двустороннего дисперсионного анализа с апостериорным критерием HSD Тьюки. *P Меньше или равно 0,05, **P Меньше или равно 0,01, ***P Меньше или равно 0,001 и ****P Меньше или равно 0,0001.

Надежное размножение антиген-специфических CD8 плюс Т-клеток путем истощения клеток eTreg перед стимуляцией антигеном.

. Затем мы попытались истощить клетки CTLA-4 плюс Treg перед стимуляцией антигеном, чтобы уберечь активированные антигеном CTLA-4-экспрессирующие CD8 плюс Т-клетки от уничтожения моноклональными антителами против CTLA-4. Мы культивировали целые РВМС от здоровых доноров или пациентов с меланомой в присутствии ART-Fc анти-CTLA-4 mAb в течение 5 дней без стимуляции антигеном, удаляли mAb, затем стимулировали клетки различными пептидами в течение 8 дней и анализировали их на соотношение клеток Treg и Tet плюс CD8 плюс Т-клетки среди CD4 плюс Т-клетки или CD8 плюс Т-клетки, соответственно (фиг. 3А). Соотношение клеток FOXP3hi Treg было значительно снижено в течение 5 дней при предварительной обработке ART-Fc (рис. 3A и Приложение SI, рис. S6) и сохранялось на низком уровне во время последующей пептидной стимуляции (рис. 3B), что указывает на то, что Treg клетки не полностью восстановились в течение периода стимуляции антигеном. Эта предварительная обработка ART-Fc в сочетании со стимуляцией антигеном индуцировала устойчивую экспансию Melan-A-специфических CD8 плюс Т-клеток из РВМС здоровых доноров и NY-ESO-1-специфических CD8 плюс Т-клеток из РВМС пациентов, ткани меланомы которых экспрессировали NY-ESO-1 (рис. 3C). Опосредованное ART-Fc истощение Treg не сильно влияло на ЦМВ-специфические CD8 плюс Т-клетки. В отличие от ART-Fc, молчащие-Fc анти-CTLA-4 mAb не изменяли частоту Treg-клеток и не увеличивали Tet плюс CD8 плюс Т-клетки независимо от вида антигена (рис. 3D).

Одним из различных механизмов супрессии, используемых Treg-клетками, является CTLA-4-зависимое подавление экспрессии CD80 и CD86 дендритными клетками (DC) (14, 15). Чтобы исследовать возможный вклад этого механизма в размножение собственных/опухолевых антиген-специфических CD8 плюс Т-клеток после обработки mAb ART-Fc против CTLA-4 in vitro, мы оценили экспрессию CD80 и CD86 с помощью ДК, которые были фенотипически определены как Lin-1- CD11c плюс HLA-DR плюс, в РВМС здоровых доноров. Экспрессия как CD80, так и CD86 продемонстрировала явную повышенную регуляцию в группе, предварительно обработанной ART-Fc, в отличие от неизмененной экспрессии CD80/CD86 в группе немодифицированного IgG1-, предварительно обработанного молчащим Fc. – предварительно обработанная или необработанная группа (рис. 3Е). Кроме того, степень сродства mAb к Fc R-связыванию хорошо коррелировала с их активностью по истощению Treg, а также с активностью, индуцирующей Tet плюс CD8 плюс Т-клетки (фиг. 3F). Поскольку простая блокада CTLA-4 молчащим-Fc не активировала CD80/86, результаты показали, что истощение Treg ART-Fc активировало DC, хотя существует вероятность того, что сам ART-Fc может дополнительно способствуют активации DC посредством высокоаффинного связывания с их активирующими Fc-рецепторами.

Взятые вместе, эти результаты показывают, что истощение Treg с помощью ART-Fc анти-CTLA-4 mAb за несколько дней до воздействия антигена может избежать уничтожения CTLA-4 плюс активированных антигеном CD8 плюс Т-клеток антителом, расширяя их, по крайней мере частично, за счет усиления экспрессии CD80/CD86 с помощью APC.

Рис. 3. Предварительное истощение Treg-клеток с использованием mAb ART-Fc против CTLA-4 усиливает собственные/опухолевые антиген-специфические ответы CD8 плюс Т-клетки. (A–D) Антиген-специфические CD8 плюс Т-клетки были индуцированы из цельных РВМС HD (n=7) или пациентов (n=5) ​​после 5 дней предварительной обработки ART-Fc anti-CTLA{ {11}} мАт. (A) Схема эксперимента и репрезентативное окрашивание FOXP3 и CD45RA CD4 плюс Т-клетки в день -5 и день 0 эксперимента. Краткое содержание о. Частоты II eTreg в день 0 (внизу). (B и C) Репрезентативное окрашивание FOXP3 CD4+T-клеток (B) и антиген-специфических CD8+T-клеток (C) с предварительной обработкой ART-Fc или без нее для каждого пептида после культивирования. Сводка частот Treg и антиген-специфических CD8 плюс Т-клеток после культивирования (внизу). (D) Резюме о. II eTreg и Tet плюс CD8 плюс частоты T-клеток с предварительной обработкой mAb молчащего Fc против CTLA-4 вместо ART-Fc, как в A–C. (E) Уровни экспрессии CD80 и CD86 Lin-1-CD11c плюс HLA-DR плюс DC после 5 дней стимуляции меланом-A с предварительной обработкой указанными антителами против CTLA. -4 mAbs (n=6). Цифры на гистограммах показывают MFI. (F) Резюме частот Treg и Tet плюс CD8 плюс T-клеток после предварительной обработки указанными mAb против CTLA-4 с последующей стимуляцией Melan-A26–35, как в A–C. Среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Изображенная значимость между двумя группами была рассчитана с использованием парного t-критерия. *P Меньше или равно 0,05.

CTLA-4-опосредованное истощение Treg перед вакцинацией против опухолевого антигена усиливает противоопухолевый ответ у мышей.

Для проверки на мышах результатов, полученных in vitro с РВМС человека и mAb против CTLA-4 человека, мы создали mAb с высокой или низкой активностью ADCC и антителозависимого клеточного фагоцитоза (ADCP) из антител против CTLA{{4} мыши. }} mAb (клон UC10) изотипа IgG2a (далее mIgG2a) путем аминокислотной замены в Fc-домене (фиг. 4A). Мутация S239D в обеих тяжелых цепях повышает аффинность к Fc RIV мыши примерно в семь раз (вариант mFa55 mIgG2a), в то время как мутации L235R, G236R и S239K в обеих тяжелых цепях делают их не связывающимися с Fc R мыши (вариант mFa31 mIgG2a); первое было названо мышиным ADCC/ADCP-enhanced-Fc (усиленным), второе mAb мышиного молчащего Fc (mSilent). Чтобы сравнить противоопухолевую активность этих Fc-модифицированных моноклональных антител против CTLA-4 мыши в сочетании с вакцинацией опухолевым антигеном, мы подкожно инокулировали мышам BALB/c клетки фибросаркомы CMS5a, экспрессирующие антиген NY-ESO-1 человека, и на 9-й день, когда опухоль сформировалась, обрабатывали мышей 100 мкг каждого mAb и вакцинировали пептидом NY-ESO-1 в тот же день (9-й день; далее мы называем протокол «одновременное лечение») или через 3 дня (день 12; далее «предварительное лечение антителами») (рис. 4В). Предварительная обработка антител mEnhanced mAb была более эффективной, чем одновременное лечение или предварительная обработка либо mIgG2a, либо mSilent mAb в отношении замедления роста опухоли; эффекты последних двух mAb на рост опухоли были низкими и существенно не отличались между предварительным лечением Ab и одновременным лечением (фиг. 4C). Выживаемость была значительно выше у мышей, предварительно обработанных mEnhanced mAb, а также у мышей, получавших одновременное лечение или предварительное лечение mIgG2a, хотя ни один из способов лечения mIgG2a не вызывал регрессии опухоли у большинства мышей (фиг. 4 C и D).

Рис. 4. Предварительная обработка ADCC/ADCP-усиленным mAb против CTLA-4 вызывает сильный противоопухолевый эффект у мышей. (A) Сводка аминокислотных замен, сделанных в Fc-фрагменте mAb против мышиного CTLA-4 IgG2a (клон UC10; mIgG2a) для создания ADCC/ADCP-усиленного антимышиного CTLA{{ Показаны mAb 10}} (улучшенные) или молчащие Fc против мышиных CTLA-4 (mSilent) и их аффинности к мышиному Fc RIV. Аффинность mSilent mAb была ниже предела обнаружения анализа BIACORE. (Б–Г) Схема эксперимента (Б). Мышей заражали фибросаркомой 2 × 106 CMS5a, экспрессирующей человеческий NY-ESO-1, в день {{40}}, и оставляли без лечения или лечили mEnhanced, mIgG2a или молчащим mAb против мыши-CTLA-4 на 9-й день. Вакцинацию пептидами NY-ESO-181-88, смешанными с CFA, проводили в тот же день (9-й день, одновременная обработка) или через 3 дня (день 12, предварительная обработка Ab). Рост опухоли у каждой мыши с жирной линией, указывающей среднее значение для каждой группы лечения (C) (n=8–13 на группу). Сводка среднего роста опухоли в каждой группе лечения (D, слева). Звездочками отмечены значения P между группой, получавшей предварительное лечение mEnhanced mAb, с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с тестом множественных сравнений Тьюки. Сводная информация о выживаемости (D, справа) в каждой группе лечения. Значения P между выживаемостью каждой группы и выживаемостью контрольной группы, получавшей только вакцину, рассчитывали с помощью логарифмического рангового критерия. Событие смерти соответствует длине опухоли более или равной 200 мм или смерти мыши. *P Меньше или равно 0,05, **P Меньше или равно 0,01, ***P Меньше или равно 0,001 и ****P Меньше или равно 0,0001.

Усиленная предварительная обработка mAb также привела к значительному увеличению числа инфильтрирующих опухоль CD8 плюс T-клеток и отношения CD8/Treg в TIL, хотя процент клеток FOXP3 plus среди CD4 плюс T-клеток немного увеличился (рис. 5 A– С). Кроме того, в то время как частота NY-ESO-1 пептид-специфических CD8 плюс TIL статистически не отличалась среди мышей, получавших каждое mAb, или между предварительным лечением и одновременным лечением, антиген-специфические CD8 плюс TIL от усиленного mAb, предварительно обработанного мыши по сравнению с другими группами показали значительно более активную продукцию IL-2 и IFN- при повторной стимуляции in vitro пептидом NY-ESO-1 (рис. 5 D и E). Более того, эффекторная память CD8 плюс Т-клетки, определяемая как популяция CD44highCD62Llow, значительно увеличилась среди NY-ESO-1-специфических CD8 плюс TIL у мышей, предварительно обработанных усиленными mAb (рис. 5 F и G).

В совокупности предварительная обработка mEnhanced mAb была наиболее эффективной в отношении индукции противоопухолевого иммунитета, за которой следовала предварительная обработка mIgG2a, обладавшим некоторой ADCC-активностью, в то время как mSilent mAb было гораздо менее эффективным. Результаты показывают, что предварительная обработка мышей с опухолями ADCC/ADCP-усиленными mAb против CTLA-4 с последующей вакцинацией опухолевым антигеном может эффективно вызывать противоопухолевый иммунный ответ in vivo.

Обсуждение

Основными выводами в этом отчете являются: (i) терминально дифференцированные клетки eTreg с высокой степенью супрессии многочисленны в опухолевых тканях и экспрессируют поверхностные CTLA-4 на более высоких уровнях, чем инфильтрирующие опухоль CD8 плюс Т-клетки; (ii) mAb против CTLA-4 с высокой активностью ADCC способно истощать/сокращать клетки CTLA-4high eTreg и CTLA-4 плюс эффекторные CD8 плюс Т-клетки; и (iii) истощающие клетки mAb против CTLA-4 могут вызывать и усиливать эффективный опухолевый иммунитет, когда схема лечения антителами разработана таким образом, чтобы не воздействовать на CTLA-4 плюс эффекторные CD8 плюс Т-клетки, например, путем изменение времени истощения клеток Treg и вакцинации против ракового антигена.

ADCC-активность mAb против CTLA-4 является ключевым фактором, определяющим эффективность снижения eTreg и, как следствие, увеличения опухоле-реактивных CD8 плюс Т-клеток. Поддерживая эту точку зрения, мы продемонстрировали, что mAb против CTLA-4 (ART-Fc) с повышенной активностью ADCC (и/или активностью ADCP у мышей) способно усиливать противоопухолевый иммунный ответ in vitro у людей и in vivo у мышей путем истощения CTLA-4-экспрессирующих клеток Treg. mAb против CTLA4 (silent-Fc), модифицированные так, чтобы они проявляли гораздо меньшую активность ADCC или не проявляли ее совсем, не проявляли такой противоопухолевой активности, даже если они обладали такой же специфичностью в отношении эпитопа молекулы CTLA-4. У людей остается неясным, связано ли противоопухолевое действие ипилимумаба с Fc-фрагментом IgG1 с блокадой молекулы CTLA4 или истощением клеток, экспрессирующих CTLA-4, посредством ADCC. На мышах было показано, что усиление противоопухолевого иммунитета с помощью mAb против CTLA-4 требует истощения инфильтрирующих опухоль клеток Treg с помощью ADCC, опосредованной Fc R (19–21, 26, 27). Точно так же было показано, что антитела против молекул GITR, OX40 и CD25, в которых опухоль-инфильтрирующие Treg-клетки экспрессируют наибольшее количество, зависят от ADCC-опосредованного истощения Treg-клеток при отторжении опухоли (19, 26, 28). Также сообщалось, что лечение ипилимумабом у пациентов с меланомой значительно снижало количество FOXP3 плюс Treg-клеток в опухолевых тканях, особенно у пациентов с клиническим ответом (29).

Кроме того, недавний отчет показал, что среди пациентов с меланомой с высоким бременем опухолевых мутаций пациенты, генетически имеющие высокоаффинный вариант Fc RIIIa с усиленной ADCC (вариант V158, в отличие от низкоаффинного варианта F158), показали значительно лучшие результаты. клинического ответа на лечение ипилимумабом и лучшей общей выживаемости (27). Это открытие подтверждает идею о том, что mAb против CTLA-4 с лучшей активностью по истощению Treg могут быть более эффективными, чем ипилимумаб, в иммунотерапии рака. Таким образом, вполне вероятно, что mAb ART-Fc против CTLA4, обладающее высокой аффинностью к варианту V158 (KD=3,7 × 10–10 М, по сравнению с 3,1 × 10–6 М для ипилимумаба или IgG1) , может иметь лучшую клиническую эффективность в иммунотерапии рака за счет истощения клеток Treg. В совокупности эти данные, полученные на людях и мышах, указывают на то, что mAb против CTLA-4 с высоким уровнем ADCC/ADCP могут быть эффективными в отношении индукции и усиления противоопухолевого иммунитета за счет истощения клеток Treg.

Рис. 5. Ag-специфические ответы CD8 плюс Т-клетки, индуцированные у мышей с опухолями путем предварительной обработки ADCC/ADCP-усиленными mAb против CTLA-4. (A–G) TIL с рис. 4 анализировали через 19 дней после имплантации опухоли (n=4–6 на группу). Количество инфильтрированных Т-клеток на грамм опухоли (А). Соотношение клеток CD8/Treg (B). Частота клеток Foxp3 плюс Treg среди CD4 плюс Т-клетки (C). Репрезентативные графики IL-2 плюс IFN- плюс CD8 плюс Т-клетки (D). Продукцию цитокинов измеряли путем повторной стимуляции TIL пептидами ESO-181-88 in vitro в течение 5 часов. Резюме Tet плюс CD8 плюс Т-клетки в опухоли и IL{{2{0}} плюс IFN- плюс CD8 плюс Т-клетки в D после повторной стимуляции (E). Репрезентативные графики (F) и сводка (G) экспрессии CD44 и CD62L с помощью NY-ESO-1-Tet плюс CD8 плюс Т-клетки в опухоли каждой группы лечения. Данные были получены из трех независимых экспериментов. Значения P между наивными или EM CD8 плюс подмножества Т-клеток для каждого состояния. Среднее значение ± стандартная ошибка среднего. *P Меньше или равно 0.05, † P Меньше или равно 0.05, **P Меньше или равно 0,01, ††P Меньше или равно 0,01 и ***P Меньше или равно 0,001 по данным двухфакторного ANOVA с тестом множественных сравнений Тьюки.

Материалы и методы

Образцы доноров.

Образцы периферической крови были получены от здоровых лиц или пациентов с меланомой III–IV стадии. PBMC выделяли градиентом плотности с Ficoll-Paque (GE Healthcare). TIL были получены из резецированных тканей меланомы. Опухоль измельчали, и суспензии одиночных клеток, полученные после мягкой диссоциации MACS (Miltenyi), готовили путем фильтрации через сито для клеток 40- мкм. Все доноры предоставили письменное информированное согласие перед взятием проб в соответствии с Хельсинкской декларацией. Настоящее исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом Университета Осаки.

CyTOF-анализ.

TIL и спленоциты мышей с опухолями обогащали клетками CD3+ и окрашивали 198-цисплатином для распознавания мертвых клеток и панелью антител, включающей следующие металлоконъюгированные антитела: 172Yb-CD4 (RM4-5 ), 168Er-CD8 (53-6.7), 164Dy-CTLA-4 (UC-10), 158GdFOXP3 (FJK-16s). Для PBMC и TIL человека клеточные суспензии были штрих-кодированы анти-CD45-антителами с различными конъюгатами металлов, как описано ранее (35), перед окрашиванием 198-цисплатином для распознавания мертвых клеток, а затем окрашиванием антителами с помощью следующей панели. Антитела, конъюгированные с металлом, были получены от Fluidigm или набора Maxpar Antibody Labeling Kit (Fluidigm), который использовали в соответствии с инструкциями производителя для конъюгации очищенных антител: 89Y-CD45 (клон: HI30; Fluidigm), 115In-CD45 (HI30; Biolegend), 175Yb- Антитела CD45 (HI30; Biolegend) использовали для штрих-кодирования различных образцов; CLA-FITC (HECA-452; BD), CCR8-PE (L263G8; Biolegend), CXCR5-биотин (RF8B2; BD), eVolve 605 (114 Cd)-CD8a (RPA -T8; eBioscience), 139La-CD123 (6H6; Biolegend), 141Pr-CCR6 (11A9; Fluidigm), 142Nd-CD14 (M5E2; Biolegend), 144Nd-FITC (CLA) (FIT22; Fluidigm), 145NdCD4 (RPA-T4 ; Fluidigm), 148Sm-CD20 (2H7; Biolegend), 149Sm-CCR4 (205410; Fluidigm), 150Nd-SAV (CXCR5) (1D4-C5; Fluidigm), 151Eu-ICOS (C398.4A; Fluidigm) , 152Sm-CD69 (FN50; Biolegend), 153Eu-CD45RA (HI100; Fluidigm), 154Sm-CD3 (UCHT1; Fluidigm), 155Gd-CD197 (CCR7) (150503; R&D Systems), 156Gd-анти-PE (CCR8) ( PE001; Fluidigm), 158Gd-CD27 (L128; Fluidigm), 159TbCD19 (HIB19; Biolegend), 160Gd-CD39 (A1; Fluidigm), 163Dy-CXCR3 (G025H7; Fluidigm), 164Dy-CD95 (DX2; Fluidigm), 165Ho- CD45RO (UCHL1; Fluidigm), 166Er-CD279 (PD-1) (EH12.2H7; Biolegend), 167Er-PDL1 (29E.2A3; Biolegend), 169Tm-CD25 (IL-2R) ( 2A3; Fluidigm), 171Yb-CD11c (3,9; Biolegend), 172YbCD38 (HIT2; Fluidigm), 173Yb-TIGIT (MBSA43; eBioscience), 174Yb-HLA-DR (L243; Fluidigm), 176Yb-CD127 (IL-7R) (A019D5; Fluidigm), 209Bi-CD11b (ICRF44; Fluidigm), 146Nd-Helios (22F6; Biolegend), 161Dy-CTLA-4 (14D3; Fluidigm), 162Dy-FOXP3 (236A/E7; eBioscience) и 168Er-Ki-67 (Ki-67; Fluidigm).

Клетки человека и мыши фиксировали с помощью буферов для окрашивания eBioscience Foxp3/фактора транскрипции (ThermoFisher) перед внутриклеточным окрашиванием. Окрашенные клетки затем ресуспендировали в 2% PFA с интеркалятором ДНК 191/193-iridium (Fluidigm) в течение ночи, затем промывали и ресуспендировали в воде Maxpar (Fluidigm) и четырехэлементных шариках EQ (Fluidigm) непосредственно перед анализом с помощью Helios CyTOF. система (флюидигм). Нормализованные данные анализировали с помощью Cytobank Premium.

Стимуляция антиген-специфических CD8 плюс Т-клеток.

Цельные РВМС здоровых людей и больных меланомой стимулировали 10 мкМ коротких пептидов, специфичных для HLA-A*0201 (Operon Biotechnology) в течение 8–9 дней: Melan-A26–35 (EAAGIGILTV), CMV495–503 (NLVPMVATV), Flu58. –66 (GILGFVFTL) или NY-ESO1157–165 (SLLMWITQC) (12, 22). Чтобы определить эффект mAb против CTLA-4 при различных ADCC, одно из следующих mAb добавляли к культуре в концентрации 1 мкг/мл (если не указано иное) в тот же день или за 5 дней до антигенной стимуляции: ADCC усиленный анти-CTLA-4 IgG1 (MDX-010-ART-Fc), обычный немодифицированный анти-CTLA-4 IgG1 (MDX-010-IgG1) или молчащий-Fc Антитела к CTLA-4 IgG1 (MDX-010-silent-Fc): все mAb были любезно предоставлены Chugai Pharmaceutical. Половину среды заменяли свежей средой, содержащей 10 ед/мл IL-2 и 40 нг/мл IL-7 каждые 3 дня.

Анализ высвобождения лактатдегидрогеназы с помощью клеток CHO, экспрессирующих CTLA-4 человека.

Анализ высвобождения лактатдегидрогеназы (ЛДГ) проводили для определения активности ADCC в РВМС. Клетки CHO DG44-hCTLA4 (от Chugai Pharmaceutical) высевали на круглодонные планшеты с 96-лунками (1 × 104 клеток на лунку) и инкубировали с различными концентрациями mAb в течение 15 мин. Затем к культуре добавляли РВМС, полученные от здоровых доноров, при соотношении эффектор-мишень (Э/Т) 50:1. Клетки инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 6 или 24 ч, собирали 100 мкл супернатанта из каждой лунки и измеряли оптическую плотность при 492 нм и 630 нм с помощью мультимодального считывателя Cytation 5 Cell Imaging (BioTek Instruments). Высвобождение ЛДГ считали максимальным после инкубации клеток в 1-процентном растворе Nonidet P-40. Цитотоксичность (в процентах) определяли по формуле; (AC)/(BC) × 100, где A, B и C представляют выброс ЛДГ в каждом эксперименте, максимальный выброс ЛДГ и фоновый выброс ЛДГ соответственно. Все эксперименты проводились в двух повторностях.

Анализ ADCC со свежевыделенными МКПК человека.

РВМС от здоровых доноров подвергали FACS-сортировке для каждой фракции Т- и Treg-клеток, предварительно метили CellTrace Violet (CTV; ThermoFisher) и культивировали с не-Т-клетками в качестве эффекторных клеток при соотношении мишень-эффектор 1:50. Затем 1 мкг/мл указанного mAb против CTLA-4 добавляли к 10-процентной сыворотке человека AB, содержащей среду RPMI1640 с 5 МЕ/мл IL-2. Через 24- ч культивирования при 37°С с помощью FACS оценивали частоту мертвых клеток, определяемую с помощью фиксируемого окрашивания LIVE/DEAD (ThermoFisher), среди клеток CTV plus.

Эксперименты с мышиными опухолями.

Мыши BALB/c в возрасте от шести до 7- недель были приобретены у CLEA Japan и содержались в специальных условиях, свободных от патогенов. Мышам подкожно вводили 2 × 106 CMS5a-NY-ESO-1. Через девять дней после имплантации опухоли мышам внутривенно вводили 100 мкг mAb против мышиного CTLA4 (клон UC-10; mIgG2a, mEnhanced или mSilent от Chugai Pharmaceutical). Вариант mEnhanced (вариант mFa55 mIgG2a) был получен путем мутации S239D в домене CH2 и демонстрирует улучшенную аффинность связывания с мышиным Fc RIV примерно в семь раз по сравнению с mIgG2a дикого типа. Мышей вакцинировали 100 мкг пептидов ESO-181–88 (Operon Biotechnology), смешанного с 200 мкл CFA/PBS (соотношение 1:1), либо в тот же день (день 9, одновременная обработка), либо через 3 дня. d позже (12-й день, предварительная обработка Ab) подкожно. Размер опухоли измеряли каждые 3–4 дня. Эксперименты были одобрены Институциональным наблюдательным советом и проводились в соответствии с правилами Университета Осаки.

Проточной цитометрии.

Как описано ранее (12, 23), созданные in vitro антиген-специфические CD8 плюс Т-клетки окрашивали PE-меченым тетрамером Melan-A, CMV или Flu (TC Matrix) или PE-меченым NY-ESO-1. тетрамера (MBL) в течение 10 мин при 37°С, а затем окрашивали различными поверхностными mAb. Для окрашивания поверхностных CTLA-4 в этом исследовании использовали биотинилированные антитела против человеческого CD152 (клон BNI3; BD Biosciences) при 4 степени в течение 15 минут с другими антителами против поверхностных молекул. После промывки мы добавили APC-стрептавидин (Biolegend) также при 4 градусах в течение 15 минут, чтобы избежать окрашивания молекул CTLA-4, экстернализированных на поверхность после длительного окрашивания при 37 градусах. Эти процедуры окрашивания проводились до фиксации и пермеабилизации, как описано в нашем предыдущем исследовании (24).

Внутриклеточное окрашивание FOXP3 проводили с использованием набора буферов для окрашивания фактора транскрипции FOXP3 (eBioscience). Для окрашивания клеток человека использовали следующие антитела с указанными флуоресцентными метками: PerCP/Cy5.5-CCR7 (150503; BD Biosciences), FITC-CD45RA (HI100; BD Biosciences), биотин-CTLA-4 (BNI3 ; BD Biosciences), APC-стрептавидин (BioLegend), V500-CD8 (RPA-T8; BD Biosciences), BrilliantViolet711-CD3 (OKT3; Biolegned), AlexaFluor700-CD4 (RPA -T4; eBioscience), смесь FITC-Lineage (BD Biosciences), PerCP/Cy5.5-CD11c (3.9; BioLegend), APC-HLA-DR (LN3; eBioscience), PE-CD86 (IT2.2; eBioscience), AlexaFluor700-CD80 (L307.4; BD Biosciences), PE-FOXP3 (236A/E7; eBioscience) и фиксируемый краситель для определения жизнеспособности eFluor780 (eBioscience). Для окрашивания клеток мыши использовали следующие антитела: V500-CD8 (53-6.7; BD Biosciences), PE-Cy7-CD3e (145-2C11; eBioscience), eFluor. 450-CD4 (RM4-5; eBioscience), APC-CD25 (PC61.5; eBioscience), PE-FOXP3 (FJK-16s; eBioscience), FITC-IFN- (XMG1. 2; BD Biosciences), AlexaFluor647-IL-2 (JES6-5H4; eBiosciences) и краситель для фиксации жизнеспособности eFluor780 (eBioscience). Антиген-специфические TIL CD8 плюс Т-клетки мышей окрашивали PE-мечеными, H-2Dd-рестриктированными тетрамерами ESO-181-88 (матрица TC), как описано выше. Для измерения продукции цитокинов CD8 плюс Т-клетки мышиные TIL повторно стимулировали в течение 5 часов при 37 градусах в присутствии 10 мкМ тех же пептидов ESO-181-88, которые использовались для вакцинации GolgiPlug (BD Bioscience). Фиксацию и пермеабилизацию выполняли с помощью набора буферов Cytofix/Cytoperm (BD Bioscience). Клетки получали с помощью LSR Fortessa (BD Bioscience) и анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo v9.9.5.

Статистический анализ

Двусторонний парный t-критерий использовали для оценки значимости между двумя группами. Для сравнения нескольких групп использовали однофакторный или двусторонний ANOVA с апостериорным тестом честной значимой разницы Тьюки (HSD). Все статистические анализы проводились с использованием программного обеспечения Prism v6 (GraphPad). Значения P <0.05 считались значимыми.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Мы благодарим сотрудников кафедры дерматологии Высшей школы медицины Университета Осаки за сбор образцов пациентов; и К. Тешима, Т. Симидзу и Н. Мидзогути за техническую помощь. Fc-инженерные антитела против CTLA-4 человека и мыши были получены и предоставлены компанией Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Это исследование было поддержано грантом в поддержку специально продвигаемых исследований 16H06295 (для SS), грантом в помощь для научных исследований (A) 26253030 (для SS) и (B) 26290054 (для HN), Grantin-Aid для сложных поисковых исследований 26670581 (для HN) и Grantin-inAid для молодых ученых (B) 26860331 и 17K15723 (для А. Танака) от Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии; и Core Research for Evolutional Science and Technology от Японского агентства по науке и технологиям (SS). Это исследование было частично выполнено в рамках исследовательской программы Проекта развития инновационных исследований в области терапии рака (P-DIRECT) и Практического исследования инновационной борьбы с раком, а также Проекта исследований рака и развития терапии (P-CREATE) Японией. Агентство медицинских исследований и разработок.

1. Sakaguchi S (2004) Естественно возникающие CD4 плюс регуляторные Т-клетки для иммунологической самопереносимости и негативного контроля иммунных реакций. Annu Rev Immunol 22: 531–562.

2. Zou W (2006) Регуляторные Т-клетки, опухолевый иммунитет и иммунотерапия. Nat Rev Immunol 6: 295–307.

3. Танака А., Сакагучи С. (2017)Регуляторные Т-клетки в иммунотерапии рака. Сотовое разрешение 27: 109–118.

4. Quezada SA, Peggs KS, Curran MA, Allison JP (2006) Блокада CTLA4 и комбинированная иммунотерапия GM-CSF изменяют внутриопухолевый баланс эффекторных и регуляторных Т-клеток. Дж. Клин Инвест 116: 1935–1945.

5. Shimizu J, Yamazaki S, Sakaguchi S (1999) Индукция противоопухолевого иммунитета путем удаления CD25 плюс CD4 плюс Т-клетки: общая основа между опухолевым иммунитетом и аутоиммунитетом. Дж. Иммунол 163:5211–5218.

6. Вольф А.М. и др. (2003) Увеличение регуляторных Т-клеток в периферической крови больных раком. Clin Cancer Res 9: 606–612.

7. Куриел Т.Дж. и соавт. (2004)Специфическое рекрутирование регуляторных Т-клеток при карциноме яичников способствует иммунной привилегии и предсказывает снижение выживаемости. Nat Med 10: 942–949.

8. Петерсен Р.П. и соавт. (2006) Инфильтрирующие опухоль Foxp3 плюс регуляторные Т-клетки связаны с рецидивами у пациентов с патологической стадией I НМРЛ. Рак 107: 2866–2872.

9. Shang B, Liu Y, Jiang SJ, Liu Y (2015)Прогностическое значение инфильтрирующих опухоль FoxP3 плюс регуляторные Т-клетки при раке: систематический обзор и метаанализ. Научный отчет 5:15179.

10. Мияра М. и соавт. (2009)Функциональное определение и динамика дифференцировки CD4 плюс Т-клеток человека, экспрессирующих фактор транскрипции FoxP3. Иммунитет 30:899–911.

11. Крыло Дж.Б. и др. (2017) Отдельная субпопуляция CD25-Т-фолликулярных регуляторных клеток локализуется в зародышевых центрах. Proc Natl Acad Sci USA 114: E6400–E6409.

12. Сайто Т. и др. (2016) Две субпопуляции FOXP3(плюс)CD4(плюс) Т-клеток отчетливо контролируют прогноз колоректального рака. Nat Med 22: 679–684.

13. Сугияма Д. и соавт. (2013) mAb против CCR4 избирательно истощают FoxP3 эффекторного типа плюс CD4 плюс регуляторные Т-клетки, вызывая противоопухолевый иммунный ответ у людей. Proc Natl Acad Sci USA 110:17945–17950.

14. Шевач Е.М. (2009) Механизмы регуляторной клеточной супрессии foxp3 плюс Т. Иммунитет 30: 636–645.

15. Крыло К. и др. (2008) CTLA-4 контролирует Foxp3 плюс регуляторную функцию Т-клеток. Наука 322: 271–275.

16. Куреши О.С. и соавт. (2011) Трансэндоцитоз CD80 и CD86: молекулярная основа внеклеточной функции CTLA-4. Наука 332: 600–603.

17. Ходи Ф.С. и соавт. (2010)Улучшение выживаемости при применении ипилимумаба у пациентов с метастатической меланомой. N Engl J Med 363: 711–723.

18. Роберт С. и др. (2011)Ипилимумаб плюс дакарбазин для ранее нелеченой метастатической меланомы. N Engl J Med 364: 2517–2526.

19. Буллиард Ю. и др. (2013) Активация рецепторов Fc способствует противоопухолевой активности антител, нацеленных на иммунорегуляторные рецепторы. J Exp Med 210: 1685–1693.

20. Симпсон Т.Р. и соавт. (2013) Fc-зависимое истощение инфильтрирующих опухоль регуляторных Т-клеток совместно определяет эффективность анти-CTLA-4 терапии против меланомы. J Exp Med 210: 1695–1710.

21. Селби М.Дж. и соавт. (2013) Антитела к CTLA-4 изотипа IgG2a усиливают противоопухолевую активность за счет снижения внутриопухолевых регуляторных Т-клеток. Рак Иммунол Рез. 1: 32–42.

22. Nimmerjahn F, Ravetch JV (2008) Fcγ-рецепторы как регуляторы иммунных реакций. Nat Rev Immunol 8: 34–47.

23. Мимото Ф. и соавт. (2013) Новый асимметрично сконструированный вариант Fc антитела с более высокой аффинностью и специфичностью связывания Fc R по сравнению с фукозилированным вариантом Fc. MAbs 5: 229–236.

24. Маэда Ю. и др. (2014) Обнаружение самореактивных CD8 плюс Т-клеток с анергическим фенотипом у здоровых людей. Наука 346: 1536–1540.

25. Гнятич С. и соавт. (2006) NY-ESO-1: Обзор иммуногенного опухолевого антигена. Adv Cancer Res 95: 1–30.

26. Арсе Варгас Ф. и др.; Меланома Консорциум TRACERx; Почечный консорциум TRACERx; Lung TRACERx Consortium (2017) Fc-оптимизированный анти-CD25 истощает инфильтрирующие опухоль регуляторные Т-клетки и синергизирует с блокадой PD-1 для уничтожения прижившихся опухолей. Иммунитет 46: 577–586.

27. Арсе Варгас Ф. и др.; меланома TRACERx; TRACERx Ренал; TRACERx Lung consortia (2018) Эффекторная функция Fc способствует активности антител человека против CTLA-4. Раковая клетка 33: 649–663.e4.

28. Буллиард Ю. и др. (2014) Участие OX40 истощает внутриопухолевые Treg посредством активации Fc R, что приводит к противоопухолевой эффективности. Immunol Cell Biol 92: 475–480.

29. Романо Э. и др. (2015)Ипилимумаб-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность регуляторных Т-клеток ex vivo неклассическими моноцитами у пациентов с меланомой. Proc Natl Acad Sci USA 112:6140–6145.

30. Walker LSK, Sansom DM (2011)Возникающая роль CTLA4 как внешнего клеточного регулятора ответов Т-клеток. Nat Rev Immunol 11: 852–863.

31. Линсли П.С. и соавт. (1996) Внутриклеточный трафик CTLA-4 и очаговая локализация в местах вовлечения TCR. Иммунитет 4: 535–543.

32. Egen JG, Allison JP (2002). Накопление цитотоксического Т-лимфоцитарного антигена -4 в иммунологическом синапсе регулируется силой сигнала TCR. Иммунитет 16: 23–35.

33. Ко К. и др. (2005) Лечение запущенных опухолей агонистическими mAb против GITR и их влияние на проникающие в опухоль Foxp3 плюс CD25 плюс CD4 плюс регуляторные Т-клетки. J Exp Med 202: 885–891.

34. Прието П.А. и соавт. (2012) Блокада CTLA-4 ипилимумабом: долгосрочное наблюдение за 177 пациентами с метастатической меланомой. Clin Cancer Res 18: 2039–2047.

35. Mei HE, Leipold MD, Schulz AR, Chester C, Maecker HT (2015)Штрихкодирование живых мононуклеарных клеток периферической крови человека для мультиплексной масс-цитометрии. Дж Иммунол 194: 2022–2031.

Данби Хаа, б, Ацуши Танакаа, Тацуя Кибаяшиа, с, Ацуши Танемурад, Дайсуке Сугиямаа, 1, Джеймс Бэджер Винга, И Лин Лима, Карен Вей Венг Тенге, Деннис Адегбеа, 2, Эван В. Ньюэлл, Ичиро Катаямад, Хироёси Нисикава, 1,3, и Шимон Сакагутиа,b,4.

экспериментальная иммунология, Передовой исследовательский центр иммунологии, Осакский университет, 565-0871 Осака, Япония; b Лаборатория экспериментальной иммунологии, Отдел науки и техники регенерации, Институт пограничных наук о жизни и медицинских наук, Киотский университет, 606-8507 Киото, Япония; c Отдел исследований, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., 247-8530 Канагава, Япония; d Кафедра дерматологии Высшей школы медицины Осакского университета, 565-0871 Осака, Япония; и Агентство по науке, технологиям и исследованиям, Сингапурская сеть иммунологии, 138632 Сингапур.

Предоставлено Шимоном Сакагути, 23 ноября 2018 г. (отправлено на рассмотрение 19 июля 2018 г.; проверено Миюки Адзума и Серджио А. Кесада).

For more information:1950477648nn@gmail.com