Разнообразные дрожжевые противовирусные системы предотвращают летальный патогенез, вызываемый миковирусом LA

Недавние исследования показывают, что противовирусные системы удивительно консервативны от бактерий до млекопитающих, демонстрируя, что уникальные сведения об этих системах можно получить, изучая микробные организмы. Однако, в отличие от бактерий, где фаговая инфекция может быть летальной, у почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae не известны цитотоксические вирусные последствия, даже несмотря на то, что они хронически инфицированы миковирусом с двухцепочечной РНК, называемым LA. Это остается таковым, несмотря на предыдущую идентификацию консервативных противовирусных систем, которые ограничивают репликацию LA. Здесь мы показываем, что эти системы сотрудничают, чтобы предотвратить безудержную репликацию LA, которая вызывает летальность клеток, выращенных при высоких температурах. Используя это открытие, мы используем скрининг сверхэкспрессии для выявления противовирусных функций дрожжевых гомологов полиА-связывающего белка (PABPC1) и белка Larp1, содержащего La-домен, которые оба участвуют в вирусном врожденном иммунитете у людей. Используя подход комплементарной потери функции, мы идентифицируем новые противовирусные функции для консервативных РНК-экзонуклеаз REX2 и MYG1; регуляторные комплексы хроматина SAGA и PAF1; и HSF1, главный регулятор транскрипции протеостатической реакции на стресс. Исследуя эти противовирусные системы, мы показываем, что патогенез ЛА связан с активированной протеостатической реакцией на стресс и накоплением агрегатов цитотоксических белков. Эти результаты идентифицируют протеотоксический стресс как основную причину патогенеза LA и способствуют дальнейшему развитию дрожжей как мощной модельной системы для открытия и характеристики консервативных антивирусных систем.

Все лабораторные штаммы и большинство изолятов почкующихся дрожжей S. cerevisiae из окружающей среды инфицированы вирусом с двухцепочечной РНК (дцРНК), называемым LA (1, 2). LA принадлежит к широко распространенному семейству эндогенных дцРНК-вирусов Totiviridae. Как и все вирусы этого семейства, геном LA-дсРНК упакован в вирион, который защищает его от пищеварения, опосредованного хозяином. Отверстия в вирионе позволяют вытеснять в цитозоль транскрипты РНК, кодирующие капсидный белок Gag, составляющий большую часть частицы. Транскрипт LA также кодирует слитый белок Gag-pol, продуцируемый на гораздо более низких уровнях, чем белок Gag, который обладает РНК-зависимой РНК-полимеразной активностью. Каждый вирион содержит белок Gag-pol, который отвечает за репликацию и транскрипцию LA внутри частицы. Инкапсидация вирусных транскриптов внутри возникающих частиц и синтез отрицательной цепи РНК с помощью Gag-pol с образованием генома дцРНК завершает цикл репликации LA (2). Для производства этих белков LA использует особенности, типичные для РНК-вирусов, обнаруженных у человека, включая механизм «захвата кэпа», который снабжает транскрипты LA 5'-метиловой кепкой, и механизм сдвига рамки рибосомы для производства Gag и слитых белков Gag-pol из один транскрипт (3, 4).

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Недавние исследования бактериальных противовирусных систем показали, что они обладают замечательной эволюционной консервативностью, что и люди, раскрывая потенциал микробных организмов для обеспечения нового понимания врожденного вирусного иммунитета (5–11). Действительно, ранние исследования с участием LA привели к открытию двух антивирусных систем, которые, как впоследствии было показано, способствуют врожденному иммунитету против различных РНК-вирусов у млекопитающих (12–17). Первая из этих противовирусных систем включает гены SKI2, 3 и 8, которые кодируют субъединицы консервативного рибосомно-ассоциированного комплекса, который противодействует трансляции транскриптов, в которых отсутствуют поли(А)-хвосты, подобные тем, которые кодируются LA (18–23). Отдельный путь ослабления LA происходит через Xrn1 (также известный как SKI1), 5'-3' экзорибонуклеаза, которая разрушает непокрытые мРНК (24–26).

Недавно мы обнаружили, что митохондриальная ДНК/РНК-эндонуклеаза Nuc1 подавляет накопление LA в спорулирующих клетках, представляя собой новый противовирусный путь дрожжей (27). Nuc1 является гомологом эндонуклеазы G (EndoG), обнаруженной у всех эукариот и многих прокариот, и наиболее известен своей ролью в стимулировании фрагментации генома во время программируемой гибели клеток млекопитающих, что является важным механизмом последней надежды вирусной защиты (28, 29). Интересно, что запрограммированная гибель клеток присуща споруляции дрожжей, и Nuc1 фрагментирует ДНК умирающих продуктов мейоза во время этого процесса в дополнение к своей роли в снижении уровней вируса LA, которые наследуются выжившими спорами (27, 30, 31).

Несмотря на повсеместное присутствие LA в лабораторных штаммах, это не связано с какими-либо последствиями для приспособленности, и поэтому LA в значительной степени рассматривается как безвредный комменсал. Здесь мы показываем, что LA-инфекция на самом деле смертельна для дрожжей и что ее необходимо активно ослаблять с помощью врожденного вирусного иммунитета, чтобы сохранить жизнеспособность. В частности, у штаммов, лишенных параллельно действующих противовирусных путей NUC1 и SKI, количество копий LA значительно увеличивается, что приводит к летальности при высоких температурах.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Мы пришли к выводу, что дальнейшая характеристика LA и факторов, поддерживающих его репликацию на низком уровне, может выявить новые противовирусные системы. Выявление условий, которые приводят к патогенезу ЛА, позволило нам использовать подходы биоинформационного и прямого генетического скрининга для обнаружения новых противовирусных генов. Используя скрининг сверхэкспрессированных генов, подавляющих условную летальность nuc1∆ski3∆, мы идентифицируем противовирусные функции дрожжевых гомологов поли(А)-связывающего белка (PABPC1) и белка, содержащего La-домен Larp1, которые оба участвуют в вирусной врожденной иммунитет у человека (32, 33). Более того, генетические исследования потери функции выявили двенадцать новых противовирусных генов. Среди них высококонсервативный транскрипционный коактиваторный комплекс SAGA и несколько РНК-экзонуклеаз, включая REX2 и MYG1, обе из которых имеют отдельные, но плохо охарактеризованные человеческие и бактериальные гомологи (34–37).

Наконец, мы охарактеризовали патогенез ЛА с помощью клеточных биологических методов и обнаружили, что высокая вирусная нагрузка вызывает протеостатический стресс. Поскольку хорошо известно, что высокая температура усугубляет протеостатический стресс, эти наблюдения позволяют предположить, что катастрофический протеостатический стресс является причиной летальности, вызванной LA. В соответствии с этой гипотезой мы показываем, что мутанты nuc1∆ski3∆ проявляют LA-зависимую чувствительность к азетидин-2-карбоновой кислоте (AZC), аналогу пролина, который, как известно, вызывает ортостатический стресс (38). Кроме того, мы демонстрируем противовирусную функцию HSF1, консервативного фактора транскрипции, который ощущает и направляет реакцию на ортостатический стресс. Интересно, что человеческий Hsf1 также играет важную роль в репликации и/или патогенности различных вирусов, включая ВИЧ, SARS-Cov-2 и вирус денге, хотя механизмы неясны (39). Эти результаты предоставляют новые примеры сохранения врожденного иммунитета от микробов до человека, а также позволяют использовать легкие дрожжи в качестве мощной модельной системы для открытия новых противовирусных систем.

Полученные результаты

Дрожжевые противовирусные системы NUC1, SKI и XRN1 совместно предотвращают патогенез LA.

Наши предыдущие исследования NUC1 были сосредоточены на мейотических клетках (27). Чтобы исследовать противовирусную функцию NUC1 у вегетативно растущих дрожжей, мы исследовали количество копий LA в митотических гаплоидных клетках на фоне эталонного штамма BY4742. Мы наблюдали уровни LA dsRNA с помощью окрашивания бромистым этидием РНК, подвергшейся электрофорезу, и обнаружили, что двойной мутант nuc1∆ski3∆ показал значительное увеличение LA dsRNA (рис. 1A). Мы подтвердили эти результаты с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии с антителом дцРНК, используемым для обнаружения реплицирующихся РНК-вирусов (40, 41). Эти изображения показали, что дсРНК LA накапливается в очагах, напоминающих сайты «вирусной фабрики» репликации вируса, наблюдаемые в клетках человека (рис. 1B и Приложение SI, рис. S1) (42). В соответствии с предыдущими результатами для других штаммов (24, 27, 43), вестерн-блоттинг показал, что уровни белка Gag были повышены у мутантов nuc1∆ и Ski3∆ (рис. 1C). Кроме того, мы показали, что двойной мутант nuc1∆ski3∆ накапливает значительно повышенные уровни Gag (рис. 1C). Эти данные показывают, что NUC1 и SKI3 участвуют в отдельных противовирусных путях и что потеря обоих путей приводит к значительному увеличению вирусной нагрузки LA.

Чтобы определить, влияет ли высокая вирусная нагрузка LA на фитнес клеток, мы исследовали рост дрожжей с помощью точечных тестовых анализов роста. Незначительные дефекты роста одиночных мутантов nuc1∆ и Ski3∆ наблюдались при 37 градусах, когда клетки выращивались с глицерином, а не с глюкозой в качестве источника углерода, состояние, при котором дрожжи полагаются на митохондриальное дыхание (рис. 1D). Примечательно, что хотя двойные мутанты nuc1∆ski3∆ нормально росли при 30 степени, они демонстрировали условную летальность при 37 градусах независимо от источника углерода (рис. 1D). Как и ожидалось, жизнеспособность при высокой температуре была восстановлена ​​у двойного мутанта nuc1∆ski3∆ с помощью плазмиды, экспрессирующей NUC1-, что вызывало соответствующее снижение уровней Gag (рис. 1 C и D). Чтобы подтвердить, что дефект роста двойного мутанта nuc1∆ski3∆ был вызван LA, мы сконструировали изогенный штамм, излеченный от LA (LA0), и проанализировали его рост при высоких температурах. Мы обнаружили, что дефект роста был полностью устранен, подразумевая, что условная летальность была результатом неограниченной репликации LA (рис. 1D). Чтобы оценить влияние высокого количества копий LA на приспособленность клеток в оптимальных условиях роста, мы измерили скорость пролиферации в жидкой культуре. Эти исследования выявили сниженную скорость роста у двойных мутантов nuc1∆ski3∆ по сравнению с диким типом при 30 градусах, которая была обращена вспять у штаммов L-A0, демонстрируя, что высокая нагрузка LA вредна для приспособленности даже в нестрессовых клетках (Приложение SI, рис. С2).

растение цистанхе, повышающее иммунную систему

Нажмите здесь, чтобы просмотреть продукты Cistanche Enhance Immunity

【Запросить дополнительную информацию】 Электронная почта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Чтобы дополнительно охарактеризовать, как NUC1 взаимодействует с известными противовирусными путями, мы проверили его связь с XRN1. Мы обнаружили, что двойной мутант nuc1∆ xrn1∆ накапливает значительно повышенные уровни Gag по сравнению с любым одиночным мутантом и демонстрирует LA-зависимую условную летальность при высокой температуре (Приложение SI, рис. S3 A ​​и B), что позволяет предположить, что NUC1 и XRN1 действуют в параллельные пути ослабления LA. Отражая их ключевую неизбыточную роль в регуляции объема мРНК, двойной мутант xrn1∆ski3∆ нежизнеспособен даже у штаммов, лишенных LA (44). Чтобы определить, представляет ли XRN1 противовирусную систему, независимую как от NUC1, так и от SKI3, мы использовали высококопийную плазмиду для сверхэкспрессии XRN1 в двойном мутанте nuc1∆ski3∆. Действительно, мы наблюдали существенное снижение уровней Gag и подавление условной летальности nuc1∆ski3∆ с использованием управляемой плазмидой сверхэкспрессии XRN1 (рис. 1 C и D). Мы пришли к выводу, что Nuc1, Ski3 и Xrn1 конвергентно противостоят репликации LA и что массовое увеличение вирусной нагрузки LA у мутантов nuc1∆ski3∆ или nuc1∆xrn1∆ вызывает летальный патогенез при высоких температурах (рис. 1E).

Генетический скрининг на основе биоинформатики идентифицирует новые противовирусные факторы.

LA-зависимая условная летальность двойных мутантов nuc1∆ski3∆ повысила вероятность того, что другие противовирусные факторы могут быть идентифицированы посредством комбинаторных исследований мутантов. Чтобы идентифицировать новые кандидатные противовирусные факторы, мы провели поиск в тщательно подобранной базе данных генетических взаимодействий делеций генов, которые вызывали синтетический дефект роста в сочетании с nuc1∆, по крайней мере, в двух высокопроизводительных скрининговых исследованиях (45). Помимо ожидаемого присутствия делеций XRN1 и SKI в этом наборе данных мы обнаружили шестнадцать дополнительных генов. Мы использовали генетическое скрещивание, чтобы получить тройные мутанты, сочетающие делеции каждого из этих шестнадцати генов с nuc1∆ski3∆, и подтвердили шесть, которые вызвали серьезные дефекты роста (таблица 1). Мы определили, что синтетические фенотипы роста, вызванные каждым из этих генов, были обратными у штаммов LA0, что позволяет предположить, что они кодируют антивирусные белки (таблица 1). Ниже мы описываем подтверждение некоторых из этих экранных результатов как новых противовирусных факторов.

Один ген, выявленный в ходе нашего скрининга, REX2, кодирует 3'-5'-экзонуклеазу РНК, консервативную от бактерий до человека (35). И Rex2, и его человеческий гомолог REXO2 локализуются в митохондриях и содержат домен EXOIII, широко встречающийся в прокариотических и эукариотических белках, включая стимулируемый интерфероном противовирусный белок ISG20 (36, 37, 46–48). Мы обнаружили, что штамм с двойным мутантом rex2∆ nuc1∆ накапливает значительно повышенные уровни Gag по сравнению с любым одиночным мутантом и демонстрирует LA-зависимые дефекты роста, включая летальность при высокой температуре (рис. 2 A и B и Приложение SI, рис. С2). Штамм с одним мутантом rex2∆ продемонстрировал небольшое увеличение уровней Gag, хотя этот эффект был незначительным (рис. 2B). Чтобы тщательно изучить последствия rex2∆ для количества копий LA, мы количественно оценили РНК LA с помощью RT-qPCR. Эти измерения подтвердили, что штаммы rex2∆ nuc1∆ накапливают значительно повышенные уровни LA, хотя они также показали, что одиночный мутант rex2∆ не накапливает повышенное количество LA РНК (рис. 2C). Эти данные позволяют предположить, что противовирусная роль Rex2 очевидна только при отсутствии функции NUC1. Примечательно, что тройные мутанты nuc1∆ski3∆rex2∆ и nuc1∆xrn1∆rex2∆ оказались нежизнеспособными при всех условиях роста, и эти дефекты были устранены у штаммов L-A0 (рис. 2D). Эти данные демонстрируют серьезный патогенный потенциал миковируса LA и определяют новую противовирусную роль высококонсервативной митохондриально локализованной РНК-экзонуклеазы.

Рис. 1. Аттенуация LA защищает дрожжи от летального патогенеза. (A) Показан окрашенный бромидом этидия гель тотальной РНК, полученный из указанных штаммов, с полосой дцРНК LA размером 4,6 т.п.н., указанной стрелкой. (B) Иммунофлуоресценцию использовали для визуализации дсРНК LA (оранжевый) в клетках указанных генотипов. Эти штаммы были обработаны от слабо распространенного вируса дцРНК L-BC для устранения фонового окрашивания (подробности метода). Окрашивание ДНК DAPI показано синим цветом. (Масштабная полоса, 1 мкм.) (C) Показан вестерн-блоттинг уровней белка LA Gag и 3-фосфоглицераткиназы (Pgk1) в указанных штаммах. Маркеры молекулярной массы указаны справа. (D) Показаны точечные тестовые анализы роста штаммов 1C. Штаммы высевали на среду -Leu, содержащую либо глюкозу, либо глицерин, и выращивали при указанных температурах. (E) Митохондриальный белок Nuc1 взаимодействует с цитозольными белками Xrn1 и SkiC, регулируя уровень белка LA и обеспечивая приспособленность клеток.

Еще одним геном, идентифицированным в ходе нашего скрининга, был MYG1, дрожжевой гомолог гена 1 пролиферации меланоцитов человека, 3'-5'-экзонуклеазы РНК, которая имеет гомологи во всех таксонах (34). Мутантные штаммы, сочетающие myg1∆ и nuc1∆, демонстрировали значительное увеличение белка Gag и LA РНК по сравнению с одиночными мутантами и демонстрировали серьезные LA-зависимые дефекты роста при высокой температуре и в жидкой культуре (рис. 2C и Приложение SI, рис. S2, S4). А и С). Как и в случае с rex2∆, одиночный мутантный штамм myg1∆ показал незначительное увеличение уровня Gag и отсутствие изменений в LA-РНК (рис. 2C и Приложение SI, рис. S4C). Нам удалось восстановить тройные мутанты nuc1∆ski3∆myg1∆, хотя они чрезвычайно медленно росли при степени 30 и накапливали еще более высокие уровни Gag (Приложение SI, рис. S4 A и C). Эти дефекты роста также были устранены у штаммов L-A0 (Приложение SI, рис. S4A). Таким образом, MYG1 представляет собой новый противовирусный фактор, действующий параллельно как с NUC1, так и с комплексом SKI.

Таблица 1. Идентификация новых кандидатов в противовирусные факторы с использованием биоинформационного подхода

Мутации, приводящие к сверхэкспрессии человеческого MYG1, связаны с аутоиммунным заболеванием витилиго, что позволяет предположить, что MYG1 может играть определенную роль во врожденном иммунитете человека (49, 50). Мы исследовали эту возможность, используя плазмиду, экспрессирующую человеческий MYG1 под контролем конститутивного дрожжевого промотора (34), и обнаружили, что человеческий MYG1 устраняет условный дефект роста мутанта nuc1∆myg1∆ (Приложение SI, рис. S4D). Эти результаты показывают, что противовирусная функция дрожжевого MYG1 может выполняться человеческим MYG1, что указывает на потенциальную противовирусную функцию MYG1 у людей.

Рис. 2. Новые противовирусные факторы идентифицируются с использованием патогенеза LA. (A) Показан точечный анализ штаммов с дефектами NUC1 и REX2. Штаммы высевали на среду SC, содержащую глюкозу или глицерин, и выращивали при указанной температуре. (B) Вестерн-блоттинг уровней белков LA Gag и Pgk1 в штаммах на рис. 2А. Маркеры молекулярной массы указаны справа. (C) LA-РНК определяли количественно с помощью кПЦР и нормализовали до эндогенной РНК ACT1. Показаны средний уровень РНК и стандартное отклонение. н=5. *P < {{10}}.05, **P < 0.01, ***P < 0,001 (непарный t-критерий Стьюдента). (D) Показан точечный анализ штаммов, дефектных по трем параллельным противовирусным путям, содержащих плазмиду, экспрессирующую NUC1. Штаммы выявляют на среде -URA или синтетической полной (SC) среде с добавлением 0,1% 5-фтороротовой кислоты (5-FOA).

Другой категорией генов, идентифицированной с помощью нашего биоинформационного скрининга, была экспрессия генов. CDC73 и SPT3 кодируют субъединицы консервативных хроматин-ассоциированных комплексов PAF1 и SAGA соответственно. И cdc73∆, и spt3∆ вызывали LA-зависимую летальность в сочетании с nuc1∆ski3∆ (таблица 1). Поскольку было показано, что SAGA (SptAda-Gcn5-ацетилтрансфераза) усиливает экспрессию антивирусных генов у гриба Cryphonectria parasitica, мы исследовали этот комплекс (51). Штамм spt3∆ nuc1∆ с двойным мутантом накапливал повышенные уровни Gag и демонстрировал LA-зависимую летальность при высоких температурах (Приложение SI, рис. S4 B и C). SAGA представляет собой большой белковый комплекс, и мы подтвердили, что делеции в нескольких других генах, кодирующих субъединицы SAGA, имели те же фенотипические последствия, что и spt3∆ (Приложение SI, таблица S1 и S4C). Вместе с данными, полученными от C. parasitica, эти результаты позволяют предположить, что комплекс SAGA контролирует экспрессию противовирусных генов у различных видов грибов.

Скрининг с высоким уровнем подавления копий идентифицирует дрожжевые противовирусные факторы, которые также оказывают противовирусное действие на человека.

Поскольку сверхэкспрессия XRN1 подавляла дефекты роста штамма nuc1∆ski3∆, мы предположили, что сверхэкспрессия других противовирусных факторов будет производить аналогичный эффект, который можно будет использовать в качестве скрининга для идентификации новых противовирусных систем. Мы использовали скрининг супрессии высококопийных плазмид для обнаружения генов, сверхэкспрессия которых снижала условную летальность штамма nuc1Δski3Δ (подробности метода). Используя этот скрининг, мы идентифицировали SRO9, SLF1 и PAB1 как высококопийные супрессоры nuc1∆ski3∆, все из которых кодируют ассоциированные с рибосомами РНК-связывающие белки (Рис. 3A) (52, 53). Sro9 и Slf1 представляют собой паралогичные белки, содержащие домен волчаночного аутоантигена (La), широко встречающиеся у эукариот. Примечательно, что их человеческий гомолог, Larp1, недавно был идентифицирован при скрининге белков, связанных с SARS-Cov-2 плюс цепь оцРНК или нуклеокапсида (32, 54). Larp1 был в центре внимания одного из этих исследований, и было показано, что он ослабляет репликацию SARS-Cov-2 в клетках человека, хотя его механизм неизвестен (32). PAB1 кодирует высококонсервативный полиА-связывающий белок, который является общей мишенью вирусного ингибирования у людей посредством различных механизмов (33). Мы обнаружили, что сверхэкспрессия PAB1 или SRO9 заметно снижает уровни Gag у мутанта nuc1∆ski3∆, что объясняет их спасательные фенотипы (рис. 3B). Любопытно, что даже несмотря на то, что избыточная экспрессия SLF1 спасала дефект роста nuc1∆ski3∆ так же, как и SRO9, это не приводило к какому-либо снижению уровней Gag (Рис. 3 A и B). Эти данные свидетельствуют о том, что PAB1 и SRO9 спасают клетки, подавляя репликацию LA, и что SLF1 защищает клетки от патогенных последствий повышенной репликации вируса.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Высокое число копий LA приводит к цитотоксическому протеостатическому стрессу.

Чтобы получить представление о различных механизмах противовирусной активности Sro9 и Slf1, мы рассмотрели, какими могут быть физиологические последствия патогенеза LA и как SRO9/SLF1 могут по-разному влиять на них. Мы отметили предыдущее исследование, в котором делеции генов NUC1 или SKI-комплекса приводили к слабой индукции репортерного гена GFP, контролируемого Hsf1 (55), консервативного транскрипционного фактора, который воспринимает протеостатический стресс и активирует реакцию экспрессии генов (56–58 ). Используя проточную цитометрию с этим репортером (HSE-GFP), мы подтвердили эти результаты и определили, что двойной мутант nuc1∆ski3∆ вызывает синергетическую и LA-зависимую активацию HSE-GFP (рис. 3C и Приложение SI, рис. S5). Мы предположили, что массовое производство Gag, наблюдаемое у мутантов nuc1∆ski3∆, объясняет эту протеостатическую реакцию на стресс. Подтверждая это, активация HSE-GFP двойного мутанта nuc1∆ski3∆ была обращена вспять за счет сверхэкспрессии PAB1 или SRO9, что отражает последствия этих генов для накопления Gag (Рис. 3 B и C). Примечательно, что сверхэкспрессия паралога SRO9 SLF1 не предотвращает активацию HSE-GFP. Таким образом, эволюционное расхождение паралогичных генов SRO9 и SLF1 привело к различным противовирусным механизмам: SRO9 подавляет накопление вирусного белка и связанный с ним протеостатический стресс, а SLF1, по-видимому, защищает клетки от токсических последствий протеостатического стресса, вызванного вирусом.

Рис. 3. Сверхэкспрессия факторов контроля трансляции облегчает патогенез ЛА. (A) Показаны точечные тестовые анализы роста супрессоров с высоким содержанием копий SRO9, SLF1 и PAB1. Штаммы высевали на среду –LEU, содержащую глюкозу или глицерин, и выращивали при указанных температурах. (B) Вестерн-блоттинг уровней белков LA Gag, Pgk1, Sro9 и Slf1 в штаммах из 3A. Маркеры молекулярной массы указаны справа. (C) Проточную цитометрию использовали для измерения экспрессии HSE GFP в указанных штаммах (n {{10}}). Первый и третий квартили отмечены серыми прямоугольниками. Медианная интенсивность GFP отмечена черными полосами внутри. *P < 0.05, **P < 0,01, ***P < 0,001 (непарный t-критерий Стьюдента). (D) Флуоресцентная микроскопия Hsp104-GFP в указанных штаммах. Клетки окрашивали DAPI для визуализации ядер. (Масштабная полоса, 1 мкм.) Справа показан процент клеток с очагами 3+ GFP. н=3. В каждой повторности подсчитывали от 75 до 140 клеток.

Протеостатический стресс часто связан с накоплением агрегатов цитотоксических белков, которые можно визуализировать с помощью GFP, слитого с белковой дезагрегазой Hsp104, прямой мишенью активации транскрипции Hsf1, которая, как известно, локализуется совместно с белковыми агрегатами (59, 60). Для дальнейшего изучения протеостатических дефектов, связанных с патогенезом LA, мы использовали флуоресцентную микроскопию для визуализации фокусов Hsp104-GFP в различных штаммах. Как и ожидалось, клетки дикого типа, выращенные при 30 градусах, редко накапливали заметные фокусы Hsp104-GFP. В то время как одиночные мутанты nuc1∆ иski3∆ напоминали дикий тип, поразительно, но двойной мутант nuc1∆ski3∆ имел более 25% клеток с тремя или более фокусами Hsp104-GFP (рис. 3D). Как и во всех других фенотипах, которые мы наблюдали для nuc1∆ski3∆, накопление фокусов Hsp104-GFP зависело от присутствия LA (рис. 3D). Эти результаты показывают, что высокая вирусная нагрузка, вызванная делецией NUC1 и SKI3, приводит к накоплению очагов Hsp104-GFP, что указывает на агрегацию цитотоксических белков.

Поскольку патогенез ЛА коррелировал с протеостатическими дефектами, мы предположили, что Hsf1 будет функционировать как противовирусный фактор. Делеция HSF1 летальна, поэтому мы использовали термочувствительную аллель hsf1-848, полученную из ранее опубликованной коллекции штаммов (61). Аллель hsf1-848 демонстрировал отсутствие роста при 39 градусах, промежуточный фенотип роста при 37 градусах и отсутствие явного дефекта роста при 35 градусах (рис. 4А). Выборочные тестовые анализы показали, что фенотипы роста hsf1-848 при 35 и 37 градусах значительно усиливались при сочетании с nuc1∆ или Ski3∆ и что эти дефекты роста были обращены вспять в штаммах, лишенных вируса LA (рис. 4A). . Как и ожидалось, нежизнеспособность всех мутантных штаммов hsf1-848 сохранялась в клетках, выращенных при 39 градусах, независимо от присутствия LA. Более того, используя тетрадные диссекции, мы показали, что тройные мутанты hsf1-848 nuc1∆ski3∆ были нежизнеспособны при пермиссивной температуре, если они были инфицированы LA, но здоровы, если они были получены из штамма LA0 (SI Приложение, рис. С6). С помощью вестерн-блоттинга мы обнаружили, что hsf1-848 nuc1∆ и hsf1-848ski3∆ накапливают повышенное количество LA Gag по сравнению с одиночными мутантами (рис. 4B). Вместе с нашими клеточными биологическими исследованиями эти результаты позволяют предположить, что Hsf1-регулируемая протеостатическая реакция на стресс функционирует как противовирусная система у дрожжей, противодействуя патогенным последствиям безудержной репликации LA.

Поскольку известно, что протеостатические дефекты усугубляются и приводят к цитотоксичности при высоких температурах (59), простая модель объясняет летальные последствия патогенеза LA при высоких температурах катастрофическим протеостатическим стрессом. Для дальнейшей проверки этой модели мы обработали штаммы азетидин-2-карбоновой кислотой (AZC), аналогом пролина, который включается в белки, что приводит к ортостатическому стрессу (38). Эти эксперименты показали, что nuc1∆ski3∆ проявляет сильную чувствительность к AZC в зависимости от вируса LA (рис. 4C и Приложение SI, рис. S6). Кроме того, мы обнаружили, что nuc1∆ski3∆ проявляет чувствительность к 5% этанолу, состоянию, которое также вызывает протеостатические дефекты, но не к 0,5 М NaCl, который вызывает осмотический стресс (Приложение SI, рис. S6). Эти данные позволяют предположить, что летальные последствия патогенеза ЛА обусловлены, в частности, подавляющим протеостатическим стрессом.

Рис. 4. Реакция на тепловой шок подавляет патогенез ЛА. (A) Показан точечный анализ штаммов с дефектами HSF1, NUC1 и SKI3 с LA или без него. Штаммы высеивали на СК-среды, содержащие глюкозу, и выращивали при указанной температуре. (B) Вестерн-блоттинг уровней белков LA Gag и Pgk1 указанных штаммов. Маркеры молекулярной массы указаны справа. (C) Показан точечный анализ штаммов, обработанных протеотоксичным аналогом пролина, азетидин-2-карбоновой кислотой (AZC). Штаммы высеивали на среде SC, содержащей глюкозу с добавлением или без добавления 0,1 мг/мл AZC, и выращивали при 30 градусах.

Обсуждение

Несмотря на повсеместное присутствие вируса LA dsRNA в лабораторных штаммах, исследования вируса LA dsRNA были ограничены из-за его явно доброкачественной природы. Здесь мы показываем, что LA имеет серьезные последствия для дрожжей, когда ее репликация не контролируется, и что различные системы врожденного иммунитета поддерживают репликацию LA на приемлемом уровне. В частности, мы показываем, что в штаммах, лишенных параллельно действующих противовирусных генов NUC1 и SKI3, репликация LA значительно активируется, что приводит к ортостатическому стрессу и условной летальности при высоких температурах. Используя это новое открытие, мы использовали биоинформационный и прямой генетический скрининг для выявления новых генов дрожжей, которые ограничивают репликацию LA или защищают клетки от патогенных последствий неограниченной репликации LA. Поскольку эти скрининги не были насыщенными, геном дрожжей, вероятно, кодирует множество других противовирусных факторов. Многие глубокие исследования были проведены на дрожжах по изучению репликации экзогенно введенных вирусных РНК из других организмов, и будет интересно определить, действуют ли противовирусные факторы LA аналогичным образом на эти вирусные РНК (62, 63).

Учитывая явный риск заражения ЛА, остается загадкой, как он, тем не менее, сохраняется в условиях постоянной противовирусной активности. Объяснением этого парадокса может быть то, что Лос-Анджелес обеспечивает уравновешивающую выгоду. Одним из возможных преимуществ LA является то, что он позволяет некоторым штаммам поддерживать сателлитные вирусы, которые кодируют секретируемые токсины, убивающие соседние неинфицированные клетки. Однако LA присутствует во многих штаммах, у которых отсутствуют спутники-«киллеры», поэтому этого объяснения недостаточно для объяснения устойчивости LA-инфекции. Таким образом, мы полагаем, что Лос-Анджелес может иметь некую загадочную выгоду, которая уравновешивает его пагубный потенциал.

Наше открытие Rex2 как фактора ослабления вируса расширяет арсенал известных митохондриальных противовирусных факторов за пределами Nuc1 и предполагает, что митохондрии являются ключевым антивирусным узлом у дрожжей. Действительно, митохондрии играют центральную роль в вирусной защите в качестве регулятора запрограммированной гибели клеток и платформы для передачи противовирусных сигналов у людей. Как митохондриальные нуклеазы ослабляют вирус, находящийся в цитозоле дрожжей? Одна из возможностей заключается в том, что эти ферменты, хотя и нацелены на митохондрии, тем не менее могут накапливаться до низких, но достаточных уровней в цитозоле, чтобы напрямую осуществлять аттенуацию LA. В соответствии с этой гипотезой ранее мы показали, что Nuc1 накапливается в цитозоле мейотических клеток, хотя наши методы не смогли обнаружить его в цитозоле митотических клеток (27). Другая гипотеза состоит в том, что некоторые аспекты цикла репликации LA происходят в тесной связи с митохондриями. Например, транскрипты LA могут ассоциироваться с митохондриями и, возможно, пересекать их, подвергая их воздействию Nuc1 и/или Rex2. Наши результаты подчеркивают потенциальную общую важность митохондрий для вирусного врожденного иммунитета у эукариот и позиционируют систему дрожжи-LA как мощную модель для дальнейших исследований этой темы.

Противовирусный комплекс SKI, связанный с трансляцией рибосом, и наша идентификация Pab1, Sro9 и Slf1 как высококопийных супрессоров патогенеза LA дополнительно показывают, что транслирующая рибосома является ключевым центром противовирусной активности дрожжей. Обнаружение того, что PAB1 (polyA-связывающий белок) репрессирует LA, является неожиданным, учитывая отсутствие полиА-хвостов в транскриптах LA, что позволяет предположить, что Pab1 не действует на LA напрямую. Предыдущие результаты показали, что транскрипты LA конкурируют с мРНК полиА+ дрожжей за захват 60S рибосомальных субъединиц с образованием транслирующих 80S комплексов (64). Одна из моделей, объясняющих наши результаты, заключается в том, что Pab1 усиливает трансляцию мРНК, содержащих хвост полиА, что затем истощает доступность субъединиц 60S для транскриптов LA для трансляции. Роли Sro9 и Slf1 в трансляции менее понятны, но их функции могут аналогичным образом быть связаны с конкуренцией транскриптов LA за субъединицы 60S. Важно отметить, что гомологи Pab1 и Sro9/Slf1 участвуют в вирусной защите человека, и дальнейшие исследования этих генов у дрожжей прольют свет на противовирусные механизмы, консервативные от дрожжей к человеку.

растение цистанхе, повышающее иммунную систему

Мы определили противовирусную роль консервативного фактора транскрипции HSF1 наряду с LA-индуцированной протеостатической реакцией на стресс, включающей накопление фокусов Hsp104-GFP, HSF1-активируемого маркера агрегатов цитотоксических белков. Эти результаты подтверждают модель, согласно которой патогенез ЛА обусловлен протеотоксическим стрессом. Мы также обнаружили противовирусную функцию комплекса SAGA, который, как было показано, действует как коактиватор индукции гена-мишени Hsf1 после теплового шока (65, 66). Эти наблюдения позволяют предположить, что высокие уровни LA приводят к SAGA-зависимой активации генов-мишеней Hsf1, которые затем выполняют противовирусную функцию, проливая свет на потенциальную программу экспрессии противовирусных генов у почкующихся дрожжей. Эта модель делает множество проверяемых предсказаний, которые могут иметь отношение к вирусному патогенезу у других организмов. Действительно, человеческий HSF1 также контролирует экспрессию протеолитических регуляторных факторов. Хотя противовирусные функции HSF1 человека описаны, неясно, какую роль в этом играет ортостатическая стрессовая реакция (39). Наши результаты проливают свет на мощную систему, позволяющую распознать противовирусную функцию Hsf1 в отношении его роли в активации протеостатической реакции на стресс.

Рекомендации

1. Накаяшики Т., Курцман К.П., Эдскес Х.К., Викнер Р.Б. Дрожжевые прионы [URE3] и [PSI+] являются болезнями. Учеб. Натл. акад. наук. США 102, 10575–10580 (2005).

2. Р.Б. Викнер, Т. Фуджимура, Р. Эстебан, Вирусы и прионы Saccharomyces cerevisiae. Адв. Вирус Рез. 86, 1–36 (2013).

3. Т. Фуджимура, Р. Эстебан, Механизм захвата кэпа у дрожжевого вируса с двухцепочечной РНК LA. Учеб. Натл. акад. наук. США 108, 17667–17671 (2011).

4. Дж. Д. Динман, Т. Ичо, Р.Б. Викнер, Сдвиг рибосомы -1 в двухцепочечном РНК-вирусе дрожжей образует слитый белок gag-pol. Учеб. Натл. акад. наук. США 88, 174–178 (1991).

5. Бернхайм А. и др. Прокариотические гадюки продуцируют разнообразные противовирусные молекулы. Природа 589, 120–124 (2021).

6. Бернхайм А., Сорек Р. Паниммунная система бактерий: Противовирусная защита как ресурс сообщества. Нат. Преподобный Микробиол. 18, 113–119 (2020).

7. А.Г. Джонсон и др., «Бактериальные вдохновители» раскрывают древний механизм гибели клеток. Наука 375, 221–225 (2022).

8. Б. Р. Морхаус и др., Чувствительность циклических динуклеотидов STING возникла у бактерий. Природа 586, 429–433 (2020).

9. Офир Г. и др. Противовирусная активность бактериальных TIR-доменов через иммунные сигнальные молекулы. Природа 600, 116–120 (2021).

10. К.М. Славик и др., cGAS-подобные рецепторы воспринимают РНК и контролируют передачу сигналов 3'2'-cGAMP у дрозофилы. Природа 597, 109–113 (2021).

11. А. Т. Уайтли и др.. Бактериальные cGAS-подобные ферменты синтезируют разнообразные нуклеотидные сигналы. Природа 567, 194–199 (2019).

12. Х. М. Берджесс, И. Мор, Клеточная 5'-3' экзонуклеаза мРНК Xrn1 контролирует накопление двухцепочечной РНК и противовирусные реакции. Микроб-хозяин клетки. 17, 332–344 (2015).

13. SC Eckard et al., Экзосома РНК SKIV2L ограничивает активацию RIG-I-подобных рецепторов. Нат. Иммунол. 15, 839–845 (2014).

14. М. Мияшита, Х. Осиуми, М. Мацумото, Т. Сейя, DDX60, бокс-геликаза DEXD/H, представляет собой новый противовирусный фактор, способствующий передаче сигналов, опосредованной RIG-I-подобным рецептором. Мол. Клеточная Биол. 31, 3802–3819 (2011).

15. CS Ng, DM Kasumba, T. Fujita, H. Luo, Пространственно-временная характеристика противовирусной активности агрегации XRN1-DCP1/2 против цитоплазматических РНК-вирусов для предотвращения гибели клеток. Cell Death Differ 27, 2363–2382 (2020).

16. Р.Э. Ригби, Дж. Ревинкель, Деградация РНК при противовирусном иммунитете и аутоиммунитете. Тенденции Иммунол. 36, 179–188 (2015).

17. Ф. Широмото и др., IL-1beta/ATF3-опосредованная индукция экспрессии Ski2 усиливает деградацию мРНК вируса гепатита B. Биохим. Биофиз. Рез. Коммун. 503, 1854–1860 (2018).

18. Дж.Т. Браун, X. Бай, А.В. Джонсон. Дрожжевые противовирусные белки Ski2p, Ski3p и Ski8p существуют в виде комплекса in vivo. РНК 6, 449–457 (2000).

19. Д.С. Мэйсон и др., Обман системы деградации кэп-мРНК с помощью вируса с двухцепочечной РНК и наблюдение за поли(А)-мРНК с помощью дрожжевой противовирусной системы. Мол. Клеточная Биол. 15, 2763–2771 (1995).

20. К. Шмидт и др., Крио-ЭМ структура комплекса рибосома-Ski2-Ski3-Ski8. Наука 354, 1431–1433 (2016).

21. А.М. Сирфосс, Р.Б. Викнер, 3'-поли(А) не требуется для трансляции. Учеб. Натл. акад. наук. США 97, 9133–9137 (2000).

22. Е.А. Тох, П. Герри, Р.Б. Викнер, Хромосомные суперкиллерные мутанты Saccharomyces cerevisiae. Дж. Бактериол. 136, 1002–1007 (1978).

23. Зиновьев А., Аюпов Р.К., Абаева И.С., К.Ю.Т. Хеллен, Т.В. Пестова, Экстракция мРНК из остановленных рибосом комплексом Лыжный. Мол. Ячейка 77, 1340–1349 e1346 (2020).

24. С.Г. Болл, К. Тиртьо, Р.Б. Викнер, Генетический контроль числа копий La и L-(Bc) Dsrna в киллерных системах SACCHAROMYCES CEREVISIAE. Генетика 107, 199–217 (1984).

25. Р. Эстебан, Л. Вега, Т. Фуджимура, Нарнавирус с 20S РНК превосходит противовирусную активность SKI1/XRN1 в Saccharomyces cerevisiae. Ж. Биол. хим. 283, 25812–25820 (2008).

26. П.А. Роули, Б. Хо, С. Бушонг, А. Джонсон, С.Л. Сойер. XRN1 является видоспецифичным фактором рестрикции вирусов у дрожжей. PLoS Патог. 12, е1005890 (2016).

27. Дж. Гао и др., Мейотическое ослабление вируса посредством наследственного апоптотического пути. Учеб. Натл. акад. наук. США 116, 16454–16462 (2019).

28. LY Li, X. Luo, X. Wang, Эндонуклеаза G представляет собой апоптотическую ДНКазу при высвобождении из митохондрий. Природа 412, 95–99 (2001).

29. Томсон Б. Дж. Вирусы и апоптоз. Межд. Дж. Эксп. Патол. 82, 65–76 (2001).

30. М. Д. Иствуд, С. В. Чунг, К. К. Ли, Дж. Моффат, М. Д. Менегини, Запрограммированное на этапе развития разрушение ядра во время гаметогенеза дрожжей. Дев. Ячейка 23, 35–44 (2012 г.).

31. М.Д. Иствуд, М.Д. Менегини, Координация развития дифференцировки гамет с запрограммированной гибелью клеток в спорулирующих дрожжах. Эукариотная клетка 14, 858–867 (2015).

32. Н. Шмидт и др., Интерактом РНК-белок SARS-CoV-2 в инфицированных клетках человека. Нат. Микробиол. 6, 339–353 (2021).

33. Р.В. Смит, Н.К. Грей, Поли(А)-связывающий белок (PABP): обычная вирусная мишень. Биохим. Дж. 426, 1–12 (2010).

34. Р. Гровер и др., Экзонуклеаза Myg1 соединяет ядерные и митохондриальные программы трансляции посредством процессинга РНК. Нуклеиновые кислоты Рез. 47, 5852–5866 (2019).

35. Кунин Е.В. Консервативный древний домен присоединяется к растущему суперсемейству 3'-5' экзонуклеаз. Курс. Биол. 7, Р604–606 (1997).

36. М. Шевчик и др., Человек REXO2 контролирует короткие митохондриальные РНК, генерируемые механизмом процессинга и распада мтРНК, чтобы предотвратить накопление двухцепочечной РНК. Нуклеиновые кислоты Рез. 48, 5572–5590 (2020).

37. Ю. Цзо, М. П. Дойчер, Суперсемейства экзорибонуклеаз: структурный анализ и филогенетическое распределение. Нуклеиновые кислоты Рез. 29, 1017–1026 (2001).

38. Е.В. Троттер, Л. Беренфельд, С.А. Краузе, Г.А. Пецко, Дж.В. Грей, Неправильное сворачивание белка и повышение температуры вызывают остановку G1 посредством общего механизма, зависящего от фактора теплового шока у Saccharomyces cerevisiae. Учеб. Натл. акад. наук. США 98, 7313–7318 (2001).

39. А. Рейес, А. Дж. Наварро, Б. Дитхельм-Варела, А. М. Калергис, П. А. Гонсалес. Есть ли роль HSF1 в вирусных инфекциях? FEBS Open Bio 12, 1112–1124 (2022).

40. Ф. Вебер, В. Вагнер, С.Б. Расмуссен, Р. Хартманн, С.Р. Палудан, Двухцепочечная РНК продуцируется РНК-вирусами с положительной цепью и ДНК-вирусами, но не в обнаружимых количествах РНК-вирусами с отрицательной цепью. Дж. Вирол. 80, 5059–5064 (2006).

41. С. Уэлш и др., Состав и трехмерная архитектура мест репликации и сборки вируса денге. Микроб-хозяин клетки. 5, 365–375 (2009).

42. Фернандес И. де Кастро, Р. Тенорио, К. Риско, Фабрики сборки вирусов в липидном мире. Курс. Мнение. Вирол. 18, 20–26 (2016).

43. YX Лю, CL Дикманн, Перепроизводство дрожжевых вирусоподобных частиц штаммами с дефицитом митохондриальной нуклеазы. Мол. Клеточная Биол. 9, 3323–3331 (1989).

44. А.В. Джонсон, Р.Д. Колоднер. Синтетическая летальность мутантов sep1 (xrn1)ski2 и sep1 (xrn1)ski3 Saccharomyces cerevisiae не зависит от вируса-киллера и предполагает общую роль этих генов в контроле трансляции. Мол. Клеточная Биол. 15, 2719–2727 (1995).

45. К. Старк и др., BioGRID: общий репозиторий наборов данных взаимодействия. Нуклеиновые кислоты Рез. 34, Д535–539 (2006).

46. ​​Л. Эсперт и др., ISG20, новая интерферон-индуцированная РНКаза, специфичная для одноцепочечной РНК, определяет альтернативный противовирусный путь против РНК-геномных вирусов. Ж. Биол. хим. 278, 16151–16158 (2003).

47. Т. Ханекамп, П.Е. Торснесс, YNT20, обходной супрессор yme1 yme2, кодирует предполагаемую 3'-5' экзонуклеазу, локализованную в митохондриях Saccharomyces cerevisiae. Курс. Жене 34, 438–448 (1999).

48. А. ван Хуф, П. Леннерц, Р. Паркер, Три консервативных члена семейства РНКазы D обладают уникальными и перекрывающимися функциями при процессинге РНК 5S, 5.8S, U4, U5, РНКазы MRP и РНКазы P в дрожжах. . ЭМБО Дж. 19, 1357–1365 (2000).

49. М. Двиведи, Н. К. Ладда, Р. Бегум, Корреляция повышенной экспрессии MYG1 и полиморфизма его промотора с прогрессированием заболевания и более высокой восприимчивостью у пациентов с витилиго. Дж. Дерматол. наук. 71, 195–202 (2013).

50. К. Кинго и др., MYG1, новый ген, связанный с меланоцитами, имеет повышенную экспрессию при витилиго. Дж. Дерматол. наук. 44, 119–122 (2006).

51. И.Б. Андика, А. Джамал, Х. Кондо, Н. Сузуки, Комплекс SAGA опосредует активацию транскрипции и подавление антивирусной РНК. Учеб. Натл. акад. наук. США 114, E3499–E3506 (2017).

52. С.Г. Собель, С.Л. Волин, Два дрожжевых белка, содержащих мотив La, представляют собой РНК-связывающие белки, которые связываются с полирибосомами. Мол. Биол. Ячейка 10, 3849–3862 (1999).

53. А. Проуллер, Дж. С. Батлер, Рибосомальная ассоциация поли(А)-связывающего белка у поли(А)-дефицитных Saccharomyces cerevisiae. Ж. Биол. хим. 271, 10859–10865 (1996).

54. Д. Е. Гордон и др., Карта взаимодействия белков SARS-CoV-2 выявляет цели для повторного использования лекарств. Природа 583, 459–468 (2020).

55. О. Брандман и др., Комплекс контроля качества, связанный с рибосомами, запускает деградацию возникающих пептидов и сигнализирует о стрессе трансляции. Ячейка 151, 1042–1054 (2012 г.).

56. Дж. Анкар, Л. Систонен, Регуляция функции HSF1 в ответ на тепловой стресс: влияние на старение и болезни. Анну. Преподобный Биохим. 80, 1089–1115 (2011).

57. Дж. Ли, Дж. Лаббадиа, Р. И. Моримото, Переосмысление HSF1 при стрессе, развитии и здоровье организма. Тенденции клеточной биологии. 27, 895–905 (2017).

58. П. К. Зоргер, Х. Р. Пелхэм, Очистка и характеристика белка, связывающего элемент теплового шока, из дрожжей. ЭМБО Дж. 6, 3035–3041 (1987).

59. EJ Solis et al., Определение основной функции дрожжей Hsf1 выявляет компактную транскрипционную программу для поддержания эукариотического протеостаза. Мол. Ячейка 63, 60–71 (2016 г.).

60. Дж. Р. Гловер, С. Линдквист, Hsp104, Hsp70 и Hsp40: новая система шаперонов, которая спасает ранее агрегированные белки. Ячейка 94, 73–82 (1998).

61. З. Ли и др., Систематическое исследование основных функций генов дрожжей с помощью термочувствительных мутантов. Нат. Биотехнология. 29, 361–367 (2011).

62. Р.Ю. Чжао, Дрожжи для исследования вирусов. Микроб. Ячейка 4, 311–330 (2017).

63. Т. Панавас, Э. Сервиен, Дж. Брашер, П.Д. Надь, Полногеномный скрининг дрожжей выявляет разные наборы генов хозяина, влияющие на репликацию РНК-вирусов. Учеб. Натл. акад. наук. США 102, 7326–7331 (2005).

64. Ю. Отаке, Р.Б. Викнер. Распространение дрожжевого вируса критически зависит от концентрации свободных 60S рибосомальных субъединиц. Мол. Клеточная Биол. 15, 2772–2781 (1995).

65. С.Б. Кремер, Д.С. Гросс, комплексы модификации хроматина SAGA и Rpd3 динамически регулируют структуру и экспрессию генов теплового шока. Ж. Биол. хим. 284, 32914–32931 (2009).

66. MD Leach et al., Hsf1 и Hsp90 управляют температурозависимым глобальным ремоделированием транскрипции и архитектурой хроматина у Candida albicans. Нат. Коммун. 7, 11704 (2016).

67. CS Sitron, JH Park, JM Giafaglione, O. Brandman, Агрегация хвостов CAT блокирует их деградацию и вызывает протеотоксичность у S. cerevisiae. PLoS One 15, e0227841 (2020).

68. Л. Магтанонг и др., Сети генетических взаимодействий подавления дозировки улучшают функциональные схемы связи клетки. Нат. Биотехнология. 29, 505–511 (2011).

69. В. Биланчоне и др., Ретротранспозон Ty3 захватывает спаривающиеся дрожжевые тела, обрабатывающие РНК, для инфицирования новых геномов. ПЛОС Генет. 11, е1005528 (2015).

70. Л. Руан и др. Цитозольный протеостаз за счет импорта неправильно свернутых белков в митохондрии. Природа 543, 443–446 (2017).