ДНК-вакцинация индуцировала защитный иммунитет против инфекции SARS CoV-2 у хомяков

Рис. 2. Антительный ответ у мышей после иммунизации ДНК-вакцинами SARS-CoV и SARS-CoV-2 S.

(A) Мышей BALB/c (n=4 на группу) дважды внутримышечно иммунизировали с 3-недельным интервалом 100 мкг указанной плазмиды с последующей электропорацией. Образцы сыворотки собирали в указанные моменты времени после первой иммунизации. (BD, F, G) Антитела против полноразмерного шипового белка SARS-CoV-2, области S2 и RBD оценивали с помощью ELISA. (E, H) Вызванное вакциной нейтрализующее антитело против SARS-CoV-2 оценивали с помощью анализа нейтрализации. Титры антител представлены как среднее значение ± SEM, а титры нейтрализации выражаются как среднее геометрическое с 95% доверительным интервалом. *п<0.05 by the Mann-Whitney test.

Для дальнейшего изучения того, может ли замена лидерной последовательности увеличить секрецию белка, мы использовали лидерную последовательность тканевого активатора плазминогена для слияния различных вариантов S-белка SARS-CoV-2. Все варианты содержат область RBD белка S SARS-CoV-2. После иммунизации двумя дозами ДНК сыворотки, собранные на неделе 4 и неделе 6, анализировали на наличие антител IgG и титров нейтрализующих антител. Иммунизация ptSARS2-S вызывала более высокие титры антител против полноразмерного белка S на неделе 4, чем иммунизация ptRBD, ptRBDTM и ptSdTM (S1A Рис.). Титры антител против RBD при иммунизации ptRBD были выше, чем при иммунизации ptSARS2-S (1496,2 против 530,9, p= 0.057) на 4 неделе (S1B Рис.). Однако иммунизация ptRBD и ptSARS2-S вызывала сходные уровни нейтрализующих антител на 4-й неделе (S1C Рис.). Те же результаты наблюдались при анализе сыворотки на 6 неделе; Иммунизация ptRBD вызывала более высокие уровни антител против RBD по сравнению с иммунизацией ptSARS2-S (12589,3 против 1000,0, p=0.028), но те же уровни нейтрализующих антител (9,3 против 9,6 (log2)) (рис. 2F, 2G и 2H). Поскольку варианты, слитые с лидерной последовательностью tPA, не индуцировали более высокие титры нейтрализующих антител, чем иммунизация pSARS2-S, мы использовали pSARS2-S для дальнейшего исследования.

Конкурентное связывание сывороточных антител и ACE2 с SARS-CoV-2 RBD

Чтобы изучить способность сывороточных антител вмешиваться во взаимодействие ACE2-RBD, мы провели конкурентный серологический анализ SARS-CoV-2. В этом анализе сывороточные антитела добавляли в планшеты для ELISA, предварительно покрытые белком SARS-CoV-2 RBD, с последующим добавлением человеческого белка ACE2. В качестве эталона использовали специфическое нейтрализующее антитело против SARS-CoV-2 RBD. Как показано вРис. 3, сывороточные антитела мышей, иммунизированных pSARS2-S, связывались с RBD и блокировали связывание ACE2, что было эквивалентно приблизительно 353 мкг/мл эталонного антитела, тогда как сыворотка pSARS-S была эквивалентна 56 мкг/мл эталонного антитела. Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что иммунизация pSARS2-S может индуцировать конкурентные антитела, которые эффективно блокируют связывание RBD SARS-CoV-2 с рецептором ACE2. Этот результат соответствовал титру ИФА против SARS-CoV2 RBD (Рис. 2D), и подтверждается исследованием разницы последовательностей RBD между SARS-CoV и SARS-CoV-2 [24].

Рис. 3. Конкурентная активность сывороток иммунизированных мышей против взаимодействия RBD/ACE2.

Мышей BALB/c (n=4 на группу) дважды внутримышечно иммунизировали с интервалом 3-недель 100 мкг вектора pSARS-S или pSARS2-S с последующей электропорацией. Образцы сыворотки собирали на 8 неделе после первой иммунизации. Сывороточные антитела, которые конкурируют с ACE2 за связывание RBD, оценивали с помощью конкурентного серологического анализа SARS-CoV-2. Конкурентная активность мышиной сыворотки выражается как эквивалентный уровень антитела против RBD (спайковый белок SARS-CoV-2) (эталонное антитело). Титры антител представлены как среднее ± SEM. *п<0.05 by the Mann-Whitney test.

SARS-CoV-2 S ДНК-вакцина индуцирует долгосрочный гуморальный иммунитет и обеспечивает перекрестную защиту от SARS-CoV-2 с мутацией D614G

Примечательно, что долгосрочное поддержание титров антител IgG против полноразмерного S наблюдалось через 20 недель после первой иммунизации (Рис. 4А.). Среднегеометрические титры (log2) нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 достигли 10,8 на 8-й неделе после иммунизации pSARS2-S, слегка снизившись до 9,1 на 12-й неделе и до 8,8 на 20-й неделе (Рис. 4Б.). Эти результаты позволяют предположить, что иммунизация pSARS2-S обеспечивает длительный гуморальный ответ против SARS-CoV-2. Кроме того, ДНК-вакцина pSARS2-S с генотипом D614 индуцировала реакцию нейтрализующих антител против вируса, содержащего мутацию D614G (Рис. 4С), что аналогично титру нейтрализации генотипа D614. Таким образом, pSARS2-S способен обеспечивать перекрестную защиту от наиболее распространенного и доминирующего варианта D614G SARS-CoV-2.

Рис. 4. ДНК-вакцина SARS-CoV-2 S индуцировала долговременный гуморальный иммунитет и перекрестную защиту от SARS-CoV-2 с мутацией D614G.

Мышей BALB/c (n=4 на группу) трижды внутримышечно иммунизировали с 3-недельным интервалом 100 мкг вектора pSARS-S или pSARS2-S с последующей электропорацией. Образцы сыворотки собирали в указанные моменты времени после первой иммунизации. (A) Антитела против полноразмерного шиповидного белка SARS-CoV-2 оценивали с помощью ELISA. (B, C) Индуцированную вакциной нейтрализующую активность против SARS-CoV-2 с генотипами D614 или G614 оценивали с помощью анализа нейтрализации. Титры антител представлены как среднее значение ± SEM, а титры нейтрализации выражаются как среднее геометрическое с 95% доверительным интервалом. *п<0.05 by the Mann-Whitney test.

Индукция Th1- или Th2-предвзятых ответов

Эффекторные CD4+ Т-клетки можно разделить на две основные функциональные подгруппы, Th1 и Th2, в зависимости от секретируемых цитокинов при активации. Клетки Th1 продуцируют воспалительные цитокины (IFN-) и участвуют в клеточно-опосредованном иммунном ответе на внутриклеточные бактерии и вирусы, тогда как секретирование клеток Th2 в основном помогает B-клеткам вырабатывать антитела, но также способствует опосредованному эозинофилами иммунитету (IL-5 и IL{ {9}}), что приводит к гуморальным или аллергическим реакциям [25, 26]. Более того, механизмы, зависимые от клеток Th2, могут способствовать усилению респираторных заболеваний, связанных с вакцинацией (VAERD), как показали исследования кандидатов на вакцину против SARS-CoV.27, 28], которые подчеркивают, что сбалансированный ответ Т-клеток имеет решающее значение для разработки безопасной вакцины против COVID-19 [29]. Чтобы решить эту проблему, мышей BALB/c и C57BL/6 иммунизировали вектором pSARS-S и pSARS2-S дважды с интервалом в 3-недели. Мышей умерщвляли через 7 дней после второй иммунизации, а спленоциты стимулировали S-белком SARS-CoV-2 (5 мкг/мл) в течение 3 дней. У мышей BALB/c (Рис. 5A–5D), секреция цитокинов типа Th1 IFN- (19641,3 пг/мл ± 8823,5) и IL-2 (599,5 пг/мл ± 37,7) была высокой после стимуляции белком S в pSARS2-S В группе иммунизации были обнаружены очень низкие уровни цитокинов Th2-типа IL-5 (18,1 пг/мл ± 11,8) и IL-13 (567,2 пг/мл ± 166,2). Аналогичные результаты наблюдались у мышей C57BL/6, группа иммунизации pSARS2-S индуцировала большее количество IFN- (33918,8 пг/мл ± 11646,1) и IL-2 (800,3 пг/мл ± 109,5), чем эта группа. IL-5 (4,6 пг/мл ± 2,9) и IL-13 (545,7 пг/мл ± 117,4) (Рис. 5E–5H.). Эти данные позволили предположить, что pSARS2-S может вызывать Th1-предвзятые иммунные реакции.

Рис. 5. Т-клеточный ответ у мышей после иммунизации ДНК-вакцинами pSARS-S и SARS2-S.

Мышей BALB/c (AD) и C57BL/6 (EH) (n=4 на группу) дважды внутримышечно иммунизировали с 3-недельным интервалом 100 мкг вектора, pSARS-S или pSARS{{ 8}}S с последующей электропорацией. Спленоциты собирали на 4-й неделе после первой иммунизации и определяли уровни секретируемых IFN- (A, E), IL-2 (B, F), IL-5 (C, G) и IL. -13 (D, H) оценивали после рестимуляции рекомбинантным S-белком SARS-CoV-2. Титры антител представлены как среднее ± SEM. *п<0.05 by the Mann-Whitney test.

Профилактическая эффективность ДНК-вакцин против SARS-CoV-2 Challenge

Чтобы изучить защитную эффективность вакцинации против SARS2-S, сирийских хомяков дважды иммунизировали 100 мкг ДНК с 3-недельным интервалом, а на 7-й неделе интраназально вводили вирус SARS-CoV-2. (Рис. 6А). После иммунизации на 4-й и 6-й неделе собирали сыворотку для анализа титра антиспайковых антител (IgG) и титра нейтрализующих антител. Иммунизация pSARS2-S вызывала более высокие уровни титров антител против Spike, чем иммунизация ptRBD на 4-й неделе (1584,9 против 50,1) и 6 неделе (1995,3 против 63,1) у хомяков (Рис. 6Б.). В соответствии с титром антител против Спайка сыворотка хомяков, иммунизированных pSARS2-S, имела очень высокие титры нейтрализующих антител (6,5 на 4-й неделе и 6,4 на 6-й неделе (log2)), но сыворотки вектор- или хомяки, иммунизированные ptRBD, этого не сделали (Рис. 6С). После заражения SARS-CoV-2 массу тела хомяка контролировали каждый день. Предыдущие исследования показали, что титр вируса в легких хомяков достигал высокого уровня через 3 дня после заражения.30]. Поэтому половину хомяков из каждой группы умерщвляли на 3-й день и анализировали вирусную нагрузку в легких. Масса тела хомяков, вакцинированных вектором, постепенно уменьшалась, и процент потери массы тела составил 11,1% через 6 дней после заражения. Напротив, иммунизация pSARS2-S защищала хомяков от потери массы тела (Рис. 6D). Кроме того, титры инфекционного вируса и количество копий вирусной РНК в группе pSARS2-S показали снижение на 2,29 и 1,37 log10 по сравнению с контрольной группой вектора (Рис. 6E и 6F.). Эти результаты позволяют предположить, что иммунизация pSARS2-S обеспечивает защиту от инфекции SARS-CoV-2 у сирийских хомяков.

Рис. 6. Профилактическая эффективность ДНК-вакцины SARS-CoV-2 S у хомячков, инфицированных SARS-CoV-2-.

(A) Временной ход ДНК-вакцинации и заражения SARS-CoV-2. Сирийских хомяков дважды внутримышечно иммунизировали с 3-недельным интервалом 100 мкг контрольного препарата pSARS-S или pSARS2-S с последующей электропорацией. Образцы сыворотки собирали ретроорбитально, через 4 и 6 недель после первой иммунизации. Через 4 недели после второй иммунизации сирийским хомякам интраназально вводили 105 TCID50 SARS-CoV-2. (B) Антитела против полноразмерного шиповидного белка SARS-CoV-2 оценивали с помощью ELISA. (C) Индуцированную вакциной нейтрализующую активность против SARS-CoV-2 оценивали с помощью анализа нейтрализации. (D) Изменение массы тела (%) хомяков регистрировали каждый день после заражения SARS-CoV-2. Титры вируса (E) и копии вирусной РНК (F) в легких хомячков, инфицированных SARS-CoV-2-, через 3 дня после заражения определяли с помощью анализа TCID50 и qRT-PCR соответственно. Титры антител представлены как среднее значение ± SEM, а титры нейтрализации выражаются как среднее геометрическое с 95% доверительным интервалом. *п<0.05, ***p<0.001 by the Mann-Whitney test.

Обсуждение

Было начато более 80 клинических испытаний вакцины против COVID-19, а исследования иммуногенности и заражения вирусом на животных являются важнейшими этапами в процессе разработки вакцины. ДНК-вакцины против инфекции SARS-CoV-2 интенсивно разрабатываются для различных способов доставки. Электропорация — многообещающий подход, который может улучшить доставку ДНК и антигенность иммуногенов in vivo. Сообщалось о двух исследованиях ДНК-вакцин, проведенных Yu et al. [13] и Смит и др. [12]. Yu et al. found that rhesus macaques immunized with naked DNA encoding full-length S protein (without electroporation) exhibited >Снижение вирусной нагрузки в бронхоальвеолярном лаваже на 3,1 log10 после заражения по сравнению с контролем. Смит и др. обнаружили, что иммунизация мышей и морских свинок INO-4800 (кодирующим полноразмерный белок S) с помощью электропорации может вызывать нейтрализующие антитела против инфекции SARS-CoV-2 и блокировать связывание белка S с рецептором ACE2, но не не предоставлять данные о заболевании животных. В этом отчете мы оценили различные варианты кандидатов на ДНК-вакцины и обнаружили, что полноразмерный белок S (pSARS2-S) является наиболее подходящим для дальнейшего иммунологического исследования. Хотя SARS-CoV и SARS-CoV-2 имеют 76% гомологии в своих S-белках [31, 32], иммунизация pSARS-S не может индуцировать антитела против RBD белка S SARS-CoV-2 или титры нейтрализующих антител против инфекции SARS-CoV-2 (Рис 2). Действительно, антитела против RBD играют важную роль в блокировании вирусной инфекции. Однако иммунизация только RBD (ptRBD) вызывала высокие титры нейтрализующих антител у мышей, но не у хомяков (рис.2Hи6C). Мы предположили, что этот результат может быть обусловлен тем, что сигнальный пептид (активатор тканевого плазминогена) не способствует секреции белка RBD у хомяков. Детальный механизм требует дальнейшего изучения в будущем. Мы также отметили, что иммунизация ptRBDTM (кодирующая фрагмент от RBD до трансмембранного домена S) индуцировала более низкие титры нейтрализующих антител, чем иммунизация ptRBD (рис.2HиS1C). Результаты могут отражать нестабильную структуру белка RBD-TM. Для дальнейшего изучения иммунных ответов Th1/Th2 спленоциты иммунизированных мышей стимулировали S-белком SARS-CoV-2. Мы обнаружили, что иммунизация pSARS2-S вызывала сильные Th1-смещенные иммунные реакции с более высокими уровнями секреции IFN- - после стимуляции (Рис 5), но иммунизация pSARS-S вызывала лишь низкие уровни секреции IFN- -. Эти данные показали, что перекрестная реактивность Т-клеточных ответов между белком-шипом SARS-CoV и SARS-CoV-2 не высока (Рис 5). Кроме того, анализ IFN-ELISPOT показал, что меньше Т-клеточных ответов было обнаружено против области S1 у мышей C57BL/6 и BALB/c, иммунизированных pSARS-S (S2 Рис.), что также подтверждается исследованием Смита [12]. Эти данные показали, что вакцина против атипичной пневмонии может не обеспечить полного защитного эффекта от инфекции SARS-CoV-2. Разработка ДНК-вакцин важна для быстрого реагирования на пандемию коронавирусной инфекции. Следовательно, успех ДНК-вакцины против SARS-CoV-2 можно применить и к другим возникающим инфекционным заболеваниям.

Различные конструкции, используемые в ДНК-вакцинах SARS-SoV-2, индуцировали разные уровни титров нейтрализующих антител. Лидерная последовательность tPA использовалась для увеличения экспрессии и секреции антигена в ДНК-вакцинах.21, 33–35]. Однако в этом отчете лидерная последовательность tPA не приводила к значительному увеличению титров антител. Для дальнейшего повышения эффективности вакцины можно использовать различные лидерные последовательности для замены нативной лидерной последовательности белка-шипа. Лидерная последовательность IgE использовалась в ДНК-вакцине INO-4800 и вакцине MERS-CoV [5, 12]. Кроме того, модифицированная последовательность белка-шипа также может повысить иммуногенность вакцины. Стабилизированный белок-шип был разработан путем мутации сайта фурина и других областей для создания префузионной структуры (S-2P), которая может увеличить экспрессию белка-шипа примерно в 10- раз [36]. Идеальная ДНК-вакцина должна оптимизировать конструкцию плазмидной ДНК и систему доставки для повышения уровня экспрессии белка.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Модели животных имеют решающее значение для разработки вакцины против COVID-19. Для оценки эффективности вакцин против COVID-19 использовалось несколько животных моделей, включая приматов [13, 37], трансгенные мыши ACE2 человека [38] и сирийские хомяки [39]. ACE2 сирийского хомячка имеет большое сходство с ACE2 человека, и его аффинность связывания с белком S SARS-CoV-2 была предсказана выше, чем у мышиного ACE2.40]. Именно по этой причине в качестве моделей заражения SARS-CoV-2 использовались трансгенные мыши ACE2 человека, а не мыши дикого типа. Исследования передачи SARS-CoV-2 показали, что вирус может эффективно заражать неопытных хомяков при прямом контакте или через аэрозоли.41]. Интраназальное заражение SARS-CoV-2 может реплицироваться и индуцировать патогенез в легких сирийских хомяков [30]. This study and previous reports also showed that SARS-CoV-2 infection caused approximately a 10% reduction in the initial body weight of hamsters. Clinical manifestations of patients with COVID-19, including changes in smell and taste, and severe respiratory distress, might be accompanied by weight loss (>снижение на 5% по сравнению с исходным уровнем), что было связано с большей продолжительностью заболевания [42]. Эти результаты показывают, что сирийский хомяк также является подходящей животной моделью для оценки вакцин против COVID-19. Учитывая наличие животных моделей, мы выбрали хомяков в качестве модели заражения SARS-CoV-2 для оценки эффективности вакцины. Наши данные показали, что иммунизация pSARS2-S, но не ptRBD, может индуцировать высокие титры антител против Spike IgG и титры нейтрализующих антител (Рис. 6Б и 6С.). Соответственно, хомяки, иммунизированные pSARS2-S, но не хомяки, иммунизированные ptRBD, вызывали иммунные ответы против заражения SARS-CoV-2. Мы отметили, что иммунизация ptRBD может вызывать высокие уровни титров нейтрализующих антител у мышей, но не у хомяков. Противоречивые результаты могут быть связаны с тем, что RBD сам по себе не экспрессируется стабильно у хомяков. Модель хомяка также использовалась для оценки векторной вакцины против COVID-19 на основе аденовируса серотипа 26 (Ad26). Однократная иммунизация векторной вакциной Ad26, экспрессирующей стабилизированный шиповый белок SARS-CoV-2, вызывающий реакцию нейтрализующих антител и защищающий от инфекции SARS-CoV-2, вызывала потерю веса, частичную смертность и репликацию вируса. в легких [39]. Эти результаты показали, что модель хомяка подходит для оценки эффективности вакцин против COVID-19.

Многие усилия по разработке вакцин против SARS-CoV-2 основаны на опыте исследований MERS-CoV и SARS-CoV. В декабре 2020 года во всем мире было одобрено несколько вакцин против COVID-19, в том числе вакцины против COVID-19 на основе векторов РНК и аденовирусов. Обсуждались преимущества и недостатки различных платформ вакцин [43]. Аденовирусные векторные вакцины могут вызывать более сильные иммунные реакции, чем ДНК- и мРНК-вакцины, но эффективность их вакцин может быть снижена из-за уже существующего иммунитета против Ad-векторов.44]. По сравнению с ДНК-вакциной, мРНК-вакцина требует сверхнизкой температуры для хранения и транспортировки.45]. Следовательно, ДНК-вакцина может стать потенциальной платформой для вакцин, особенно во время экстренного использования.

Наше исследование предполагает возможность создания ДНК-вакцины для использования человеком. Дальнейшие исследования могли бы изучить эффективность этой ДНК-вакцины, доставляемой с помощью внутрикожной (внутрикожной) инъекции, что более удобно для клинического применения, поскольку игла для внутримышечной инъекции у людей имеет глубину примерно 18 мм и поражает больше тканей, чем внутрикожная инъекция с помощью EP. Более того, эффективность вакцины следует тестировать на старых мышах в качестве модели для пожилых людей, поскольку эта популяция особенно сильно страдает при заражении SARS-CoV-2. Предыдущие исследования показали, что ответ клеток Th2 был связан с усилением респираторных заболеваний (VAERD) после вакцинации инактивированными вирусными вакцинами против RSV.46], вирус кори [47] и SARS-CoV [27, 48]. Напротив, сообщается о менее тяжелых случаях SARS-CoV, возникающих в результате индукции ответа клеток Th1.49]. Таким образом, сильные Th1-иммунные реакции, вызванные ДНК-вакциной, позволяют предположить, что побочные эффекты вряд ли будут серьезной проблемой.50]. Кроме того, обеспокоенность по поводу вакцин на основе белка возникла из-за использования солей алюминия или адъювантов типа эмульсии масло-в-воде, которые приводят к Th2-предвзятому иммунному ответу и усиливают потенциальные побочные эффекты.51, 52]. Таким образом, ДНК-вакцина COVID-19 может сыграть важную роль в борьбе с пандемией COVID-19 в ближайшем будущем.

Рекомендации

1. Пак А., Адегбой О.А., Адекунле А.И., Рахман К.М., Макбрайд Э.С., Эйзен Д.П. Экономические последствия вспышки COVID-19: необходимость готовности к эпидемии. Фронт общественного здравоохранения. 2020;8:241. пмид:325743072. Центр системных наук и инженерии (CSSE) [Интернет]. Панель мониторинга COVID-19. Университет Джонса Хопкинса. [цитировано по 11 февраля 2021 г.]. Доступна с:
2. 3. Бухгольц У.Дж., Букреев А., Ян Л., Ламиранде Э.В., Мерфи Б.Р., Суббарао К. и др. Вклад структурных белков коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома в защитный иммунитет. Proc Natl Acad Sci US A. 2004;101(26):9804–9. пмид: 15210961
3. 4. Ян З.Ю., Конг В.П., Хуан Ю., Робертс А., Мерфи Б.Р., Суббарао К. и др. ДНК-вакцина индуцирует нейтрализацию коронавируса SARS и защитный иммунитет у мышей. Природа. 2004;428(6982):561–4. пмид: 15024391
4. 5. Мутумани К., Фальзарано Д., Ройшел Э.Л., Тинги С., Флингай С., Вильярреал Д.О. и др. Синтетическая консенсусная антиспайковая ДНК-вакцина с белком индуцирует защитный иммунитет против коронавируса ближневосточного респираторного синдрома у приматов. Научный перевод Мед. 2015;7(301):301ра132. пмид: 26290414
5. 6. Краммер Ф. Вакцины против SARS-CoV-2 в разработке. Природа. 2020;586(7830):516–27. пмид:32967006
6. 7. Халадж-Хедаяти А. Защитный иммунитет против субъединичных вакцин-кандидатов против атипичной пневмонии на основе шипового белка: уроки для разработки вакцины против коронавируса. J Иммунол Рез. 2020;2020:7201752. пмид:32695833
7. 8.Лу Б, Тао Л, Ван Т, Чжэн Цз, Ли Б, Чэнь Цз и др. Гуморальные и клеточные иммунные ответы, индуцированные ДНК-вакцинами 3а против тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС) или SARS-подобного коронавируса у мышей. Клин Вакцина Иммунол. 2009;16(1):73–7. пмид: 18987164
8. 9. Бауэр Дж. Ф., Ян Х, Содроски Дж., Росс Т.М. Выявление нейтрализующих антител с помощью ДНК-вакцин, экспрессирующих растворимые стабилизированные тримеры гликопротеина оболочки вируса иммунодефицита человека типа 1, конъюгированные с C3d. Дж Вирол. 2004;78(9):4710–9. пмид: 15078953
9. 10. Захарчук А.Н., Вишванатан С., Мошинский И., Петрич М., Бабюк Л.А. Оптимизация ДНК-вакцины против атипичной пневмонии. ДНК Клеточная Биол. 2007;26(10):721–6. пмид: 17665998
10. 11.Гэри Э.Н., Вайнер Д.Б. ДНК-вакцины: лучшее время сейчас. Курр Опин Иммунол. 2020;65:21–7. пмид:32259744
11. 12. Смит Т.Р.Ф., Патель А., Рамос С., Элвуд Д., Чжу Х., Ян Дж. и др. Иммуногенность ДНК-кандидатной вакцины против COVID-19. Нац Коммун. 2020;11(1):2601. пмид: 32433465
12. 13.Ю Дж, Тостаноски Л.Х., Питер Л., Меркадо Н.Б., МакМахан К., Махрохян Ш.Х. и др. Защита ДНК-вакцины от SARS-CoV-2 у макак-резус. Наука. 2020;369(6505):806–11. пмид:32434945
13. 14.Йорритсма ШТ, Гованс Э.Дж., Грубор-Баук Б., Видесундара Д.К. Методы доставки для увеличения клеточного поглощения и иммуногенности ДНК-вакцин. Вакцина. 2016;34(46):5488–94. пмид: 27742218
14. 15. Кудчодкар С.Б., Чхве Х., Ройшел Э.Л., Эскивель Р., Джин-А Квон Дж., Чжон М. и др. Быстрое реагирование на возникающее инфекционное заболевание. Уроки, извлеченные из разработки синтетической ДНК-вакцины, нацеленной на вирус Зика. Микробы заражают. 2018;20(11–12):676–84. пмид: 2955534516. Адам Л., Чичек Н., Тодорова Б., Розенбаум П., Жоли С., Пу С. и др. Врожденная молекулярная и клеточная подпись в коже, предшествующая длительным ответам Т-клеток после электропорации ДНК-вакцинации. Дж Иммунол. 2020;204(12):3375–88. пмид:32385135
15. 17. Лин Ф., Шен Х., Маккой Дж.Р., Мендоса Дж.М., Ян Дж., Кеммеррер С.В. и др. Новый прототип устройства для доставки ДНК-вакцины, усиленной электропорацией, одновременно и в кожу, и в мышцы. Вакцина. 2011;29(39):6771–80. пмид: 21199706
16. 18. Уильямс М., Юинг Д., Блевинс М., Сан П., Сундарам А.К., Равипракаш К.С. и др. Повышенная иммуногенность и защитная эффективность четырехвалентной ДНК-вакцины против денге с использованием электропорации и внутрикожной доставки. Вакцина. 2019;37(32):4444–53. пмид:31279565
17. 19. Рамакришнан М.А. Определение 50% конечного титра по простой формуле. Мир Джей Вирол. 2016;5(2):85–6. пмид: 27175354
18. 20. Корман В.М., Ландт О., Кайзер М., Моленкамп Р., Мейер А., Чу Д.К. и др. Обнаружение нового коронавируса 2019 года (2019-nCoV) с помощью RT-PCR в реальном времени. Евронаблюдение. 2020. пмид:31992387
19. 21. Коу Ю, Сюй Ю, Чжао З, Лю Дж, Ву Ю, Ю К и др. Сигнальная последовательность тканевого активатора плазминогена (tPA) повышает иммуногенность вакцины против туберкулеза на основе MVA. Иммунол Летт. 2017;190:51–7. пмид: 28728855
20. 22. Ся С, Чжу Ю, Лю М, Лан Ц, Сюй В, Ву Ю и др. Механизм слияния 2019-nCoV и ингибиторов слияния, нацеленных на домен HR1 в белке-шипе. Клетка Мол Иммунол. 2020;17(7):765–7. пмид:32047258