Влияние экстрактов Cistanche Tubulosa на мужскую репродуктивную функцию у крыс с диабетом, индуцированным стрептозотоцином и никотинамидом-Ⅰ

1. Введение

Сахарный диабет (СД) – это состояние, при котором увеличиваетсяуровень глюкозыв крови из-за неэффективности поджелудочной железы по выработке достаточного количества инсулина или неспособности организма эффективно его использовать. По данным ВОЗ, число людей с диабетом выросло со 108 миллионов в 1980 году до 422 миллионов в 2014 году [1]. Существует четыре основные категории: предиабет (стадия перед диабетом), тип 1 (когда поджелудочная железа не вырабатывает инсулин), тип 2 (организм не может использовать инсулин) и гестационный диабет (возникает во время беременности). Окислительный стресс возникает из-за дисбаланса между выработкой активных форм кислорода (АФК) и антиоксидантов [2], что в конечном итоге приводит к диабетическому состоянию. Осложнения диабета включают отказ почек, повреждение нервов, слепоту, инсульт, сердечный приступ, гибель плода и бесплодие. [1]. Исследования показывают, что ядра сперматозоидов, дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и митохондрии были значительно повреждены у пациентов-мужчин с диабетом [3]. Окислительный стресс во время транспортировки спермы изменит процесс мужской репродуктивной системы [4,5].

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША TUBULOSA ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Процесс сперматогенеза контролируется осью гипоталамус-гипофиз-гонады (ГПГ). Гонадотропин-рилизинг-гормон (ГнРГ), вырабатываемый гипоталамусом, стимулирует выработку лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Клетки Лейдига располагаются рядом с семенными канальцами.производить тестостеронпод контролем ЛХ. ФСГ запускает выработку антигенсвязывающего белка (АВР), который помогает передавать мужской гормон. Таким образом, бесплодие и другие проблемы в основном возникают из-за нарушений, возникающих в оси HPG. Введение комбинации стрептозотоцина и никотинамида вызывает диабет у экспериментальных крыс. Стрептозотоцин — химическое соединение, токсичное для инсулин-продуцирующих клеток поджелудочной железы, а никотинамид — водорастворимый витамин, защищающий клетки от полного повреждения [6].

Цистанхе трубчатая – это вид пустынного растения, также известный как «Роу Конг-Ронг» [7]. Это нехлорофилловое паразитическое растение, которое растет в основном на корнях дерева Calotropis procera и широко распространено в засушливых землях Ганьсу, Цинхая, Синьцзяна, Монголии, Ирана и Индии. Распространенное название Цистанхе трубчатой ​​— «Пустынный гиацинт». Он широко принят в китайской традиционной медицине и получил название «Женьшень пустыни». Он широко используется в медицине для лечения болезненных белей, обильной метроррагии, хронических заболеваний почек, запоров, импотенции и бесплодия. Химические составляющиеЦистанхе трубчатая состоит из нелетучих фенилэтаноидных гликозидов.(ПГГ), иридоиды, лигнаны, летучие масла, альдиты, олигосахариды и полисахариды [8]. Исследования показывают, чтоэхинакозидиз этой травы защищает поврежденные фибробласты, регулируя уровень АФК [9]. Это соединение оказывает антиоксидантное, сосудорасширяющее и противовоспалительное действие вместе с нейропротекцией и профилактикой остеопороза [10,11].

Целью данного исследования было изучение влиянияЭкстракт цистанхе трубчатойсодержащих ЭХГ, на репродуктивную дисфункцию у крыс с диабетом, вызванным стрептозотоцином-никотинамидом.

2. Материалы и методы

2.1. Материалы

ЭХГ и ХТЭ были приобретены у Sinphar Pharmaceutical Co., Ltd (Илань, Тайвань). Конечные продукты гликирования (AGE) были приобретены у Biovision (Сан-Франциско, Калифорния, США). Клеточные линии LC-540 и TM3 были приобретены в Институте исследований и разработок пищевой промышленности (Синьчжу, Тайвань). Пятинедельные крысы-самцы Sprague-Dawley (SD) были приобретены в Национальном центре лабораторных животных (Тайбэй, Тайвань). Feed Lab Diet® был приобретен у PMI Nutrition International, Inc. (Тайбэй, Тайвань). 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH) был получен от Sigma (Сент-Луис, Миссури, США). Метанол и 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES) также были приобретены у Sigma. Модифицированная среда Игла Дульбекко/F12 и трипсин-ЭДТА были получены от GIBCO (Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США). 3-(4, 5-диметилтиазол-2-ил)-2, 5-дифенилтетразолий бромид (МТТ), дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (DCFH-DA), диметилсульфоксид (ДМСО) и нитросиний тетразолий (NBT) были приобретены у Sigma. Наборы ферментов глюкозы были получены от Kyokutoseiyaku, Токио, Япония. Наборы для ELISA для инсулина были приобретены у Mercodia AB Inc., Sylveniusgatan 8A (Уппсала, Швеция). Реагент для экстракции тканевых белков T-PER был приобретен у Thermo Scientific (Чикаго, Иллинойс, США). Поликлональные антитела против ядерного фактора каппа B человека/мыши/крысы NF-κB были приобретены у компании Santa Cruz Biotechnology, Санта-Круз, Калифорния, США. Поликлональные антитела против рецептора мыши/крысы для конечных продуктов гликирования (RAGE), поликлональные антитела против StAR человека/мыши/крысы и моноклональные антитела против цитохрома P450 17A1 человека/мыши/крысы были приобретены у компании Gene. Текс (Ирвайн, Калифорния, США). Поликлональные антитела против CYP11A1 человека/мыши/крысы были получены от компании Cell Signaling Technology (Беверли, Пенсильвания, США). Реагент Easy-Blue был приобретен у Invitrogen, Thermo Fisher Scientific (Карлсбад, Калифорния, США). Агарозу и ДНК-маркер размером 100 п.о. получали от Promega, Corporation (Мэдисон, Висконсин, США). Мини-набор RNeasy Lipid Tissue Mini Kit был приобретен у QIAGEN, Хильден, Германия.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША TUBULOSA ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.2. Методы

2.2.1. Анализ in vitro

Культура клеток LC{{0}} и TM3: Клеточные линии LC-540 культивировали при 37 ◦C в среде сбалансированного солевого раствора Эрла (EBSS), дополненной бикарбонатом натрия (1,5 г/л), L-глутамин (2 мМ), заменимые аминокислоты (0,1 мМ), пируват натрия (1,0 мМ) и фетальная бычья сыворотка (FBS) (10%) в 5% CO2-инкубатор (CO2-инкубатор, Napco 5410, Тайвань). Линию клеток TM3 культивировали в модифицированной среде Игла Дульбекко (DMEM) с добавлением глюкозы (4,5 г/л), пирувата натрия (0,5 мМ), L-глутамина (2,5 мМ), бикарбоната натрия (1,2 г/л), {{ 28}}(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES, 15 мМ) и фетальная сыворотка теленка (FCS, 10%) или сыворотка лошади (5%) при 37 ◦C в 5% СО2-инкубатор.

Определение жизнеспособности клетокЭхинакозид (ECH): Реагент 3-(4, 5-диметилтиазол-2-ил)-2,5- дифенилтетразолий бромид (МТТ) использовали для анализа жизнеспособности клеток. Концентрацию клеток доводили до 2 × 105 клеток/мл в планшете с лунками 96-. Затем добавляли 20 мкл ЭХГ (разведенного в 2% среды) и инкубировали в течение 24 ч при 37 ◦C в инкубаторе с 5% CO2. Позже добавляли 100 мкл реагента МТТ и инкубировали в течение 4 часов при 37 ◦C в темных условиях. Поглощение измеряли при 570 нм (считыватель ELISA, Dynatech MR5000, Клотен, Швейцария).

Относительная жизнеспособность клеток (%)=[(Образец при 570 нм - пустой при 570 нм)]/[(Aконтроль при 570 - пустой при 570)] × 100.

Анализ восстановления нитросинего тетразолия (NBT) и анализ 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (DPPH): количество клеток доводили до 1×1{{10}}6 клеток/ мл. Затем добавляли 50 мг/мл ЭХГ, ресвератрол (RES) и конечные продукты гликирования (AGE) (контроль) и совместно культивировали в течение 18 часов при 37 ◦C. Затем добавляли 0,3 мл раствора NBT (0,1 мг/мл NBT, 5% FBS и 3% диметилсульфоксида (ДМСО), растворенного в 10 мл DMEM) и инкубировали при 37 ◦C в 5% CO2 в течение 1 часа. После центрифугирования (при 800×g в течение 3 минут) надосадочную жидкость удаляли, добавляли 200 мкл ДМСО и встряхивали в течение 5 минут в ультразвуковом генераторе (Delta Ultrasonic Cleaner D 200, Keelung, Тайвань). Поглощение измеряли при 630 нм. Для радикального анализа ДФПГ в качестве стандарта использовали Тролокс (в 95% спирте). Затем 75 мкл 0,5 мМ раствора ДФПГ смешивали с 25 мкл образцов и оставляли на реакцию при комнатной температуре в темном месте в течение 30 мин. Смесь встряхивали и измеряли поглощение при 517 нм.

Анализ содержания активных форм кислорода (АФК): Число клеток доводили до 2 × 105 клеток/мл в планшете с лунками 12-, содержащим 2% FBS. Затем в планшет добавляли 50 мкл/мл ECH, RES и AGE и инкубировали при 37 ◦C в течение 24 часов. Через 24 часа добавляли 20,70 -дихлорфлуоресцеин-диацетат (DCFH-DA) и инкубировали при 37 ◦C в течение 30 минут. После центрифугирования (400×g, 5 мин) супернатант удаляли и клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS). После этого клетки суспендировали в 1 мл PBS и определяли уровни АФК с помощью проточного цитометра (проточный цитометр, Becton Dickinson, Калифорния, США).

Идентификация и количественный анализ белка: Белки экстрагировали с использованием реагента для экстракции белка (T-PER). Плотность клеток доводили до 2 × 105 клеток/мл в 12-луночном планшете и добавляли 50 мкл/мл ECH, RES и рецептора антагониста конечного продукта гликирования (RAGE), а также AGE и инкубировали. при 37 ◦C в инкубаторе с 5% CO2 в течение 24 часов. После этого добавляли 400 мкл T-PER, соскабливали клетки и центрифугировали при 125,000x g в течение 20 мин (4 ◦C). Супернатант собирали и хранили при -80 ◦C (морозильная камера при -80 ◦C, Нуайре, Плимут, Миннесота, США) для дальнейшего анализа. Для количественного определения белка использовали набор бицинхониновой кислоты (BCA). Затем 10 мкл раствора стандартных клеток и 200 мкл реагента BCA добавляли в планшеты с лунками 8- и инкубировали при 37 ◦C в инкубаторе с 5% CO2 в течение 30 минут. Поглощение измеряли при 562 нм. Анализ идентификации белка проводили электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН) (ДСН-ПААГ). Образцы готовили путем добавления белкового лизата к буферу для загрузки белка и проводили вестерн-блот-анализ для обнаружения специфических белков.

2.2.2. Анализ in vivo

Дизайн модели животного: Шестьдесят {{0}}самцов крыс Sprague-Dawley (SD) недельного возраста были приобретены в Национальном центре лабораторных животных (Тайбэй, Тайвань). Каждую крысу содержали индивидуально в дезинфицирующих клетках из нержавеющей стали при контролируемой температуре (23 ± 1 ◦C) и влажности (40–60%) с 12-часовым световым/12-часовым циклом темноты. Еда и вода предоставлялись вволю. Каждую крысу одомашнили в первую неделю и ей давали рацион лабораторных грызунов 5001 в качестве основного рациона. Все процедуры соответствовали стандарту Институционального комитета по уходу и использованию животных (утверждение IACUC № 101026) Национального Тайваньского университета океана, Тайвань. После приручения крыс разделили на две группы: контрольную группу (Con), которую кормили лабораторной диетой 5001, и группу диабетиков, которую кормили диетой с высоким содержанием жиров (HFD, 40%) на протяжении всего эксперимента. После кормления HFD в течение 4 недель крысам диабетической группы вводили стрептозотоцин (65 мг/кг) (СТЗ) для индукции сахарного диабета (СД). В течение 15 минут после инъекции СТЗ вводили никотинамид (230 мг/кг массы тела). Через неделю после инъекции был проведен пероральный тест толерантности к глюкозе (ОГТТ) для определения успешной индукции сахарного диабета (СД). После этого животных разделили на шесть групп: контрольную (с лабораторным рационом 5001); группа СД (СД + 45% HFD); Группа DMR (DM + росиглитазон: 0,571 мг/кг массы тела) + 45% HFD; Группа DME1 (DM + CTE: 80 мг/кг массы тела) + 45% HFD; Группа DME2 (DM + CTE: 160 мг/кг массы тела) + 45% HFD; и группа DME4 (DM + CTE: 320 мг/кг массы тела) + 45% HFD. В качестве положительного контроля использовали росиглитазон (РСГ). Три дозы CTE (80, 160 и 320 мг/кг) использовались в соответствии с рекомендациями Тайваньского управления по контролю за продуктами и лекарствами (TFDA) по функциональной оценке здорового питания. Лечение проводилось до конца эксперимента. Всех экспериментальных крыс забивали через 6 недель. Кровь, собранную у крыс, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин при 4 ◦С. Супернатант исследовали для следующего анализа:

Определение общей глюкозы, триглицеридов и холестерина. Определение глюкозы проводили с помощью наборов для ферментов глюкозы. Затем к реагентам добавляли по 20 мкл образцов плазмы крови и выдерживали при температуре 37 ◦С в течение 5 мин. Концентрацию общих триглицеридов и общего холестерина определяли с использованием ферментных наборов для триглицеридов и холестерина. Затем к реагентам добавляли по 10 мкл плазмы крови и проводили эксперимент согласно инструкции производителя. Поглощение измеряли при 510 нм.

Общий уровень глюкозы/триглицеридов/холестерина в плазме (мг/дл)=(Asample – ABlank)/(Astandard – ABlank) × 200.

Asample: поглощение образцов крови, ABlank: значение поглощения наборов без образца, Astandard: значение поглощения стандартного реагента, 200: стандартные реагенты в концентрации 200 мг/дл.

Оценка инсулина, лептина и гомеостатической модели – определение резистентности к инсулину (HOMA-IR):Уровень инсулина определяли с помощью наборов ИФА для инсулина. Здесь, 25µл плазмы крови добавляли креагенты, и оптическую плотность измеряли при 450 нм. Общее содержание лептина определяли с помощьюнабор для иммуноферментного анализа лептина.Тогда 100µL плазмы анализировали, и оптическая плотностьизмеряли при 450 нм с использованием ELISA-ридера. Весь эксперимент проводился согласноинструкции производителя. Значение HOMA-IR определялось на основе модели гомеостаза.уравнение оценки=Концентрация инсулина в плазме натощак (мг/мл)× глюкоза плазмы натощакконцентрации (ммоль/л)/22,5.

Перекисное окисление липидов плазмы: здесь {{0}},5 мл плазмы крови смешивали с 1 мл реагента (15%, по весу/объему трихлоруксусной кислоты в 0,25 N соляной кислоте (HCl) ) и 0,375%, мас./об. тиобарбитуровой кислоты в 0,25 н. HCl) и помещали на водяную баню (Water Bath, BUCHI 461, Цюрих, Швейцария) при 100 ◦C на 15 мин. После охлаждения добавляли 1 мл н-бутанола, энергично встряхивали и центрифугировали при 1500×g в течение 10 мин. Супернатант собирали и измеряли поглощение при 532 нм [12].

Концентрация малонового диальдегида (МДА) (нМ/мл)=[(Образец при 532 нм - пустой при 532 нм)/ (стандарт при 532 нм - пустой при 532 нм)] × 5.

стандарт при 532 нм - пустой при 532 нм)] × 5. Определение уровней тестостерона и лютеинизирующего гормона (ЛГ) в плазме. Для измерения уровня тестостерона в плазме крови использовали набор ELISA для тестостерона. Для определения концентрации ЛГ использовали набор РИА. Затем добавляли 50 мкл плазмы и расчеты основывались на концентрации гормона LH-RP-3 (стандарт). Дальнейшие действия проводились согласно инструкции производителя.

Определение фактора некроза опухоли (TNF) и интерлейкина-6 (IL-6). Концентрация: Захваченное антитело разводили в 250 раз в покрывающем буфере и добавляли к 96-. луночный планшет (100 мкл/лунку) и хранили при температуре 4 ◦C в течение ночи. Супернатант отсасывали и пять раз промывали промывочным буфером (1 раз PBS, 0,05% Tween 20). После инкубации (1 час) с 200 мкг аналитического разбавителя клетки 5 раз промывали промывочным буфером и в каждую лунку добавляли по 100 мкл стандартного раствора TNF или тестируемых образцов и инкубировали в течение 2 часов. После промывки добавляли 100 мкл антител, обнаруживающих IL-6-, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Супернатант отсасывали и промывали 5 раз. Затем добавляли 480 мкл фермента авидин-пероксидазы хрена (HRP) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Супернатант отсасывали и пять раз промывали промывочным буфером. Затем добавляли 100 мкл раствора субстрата и инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Позже в каждую лунку добавляли по 50 мкл стоп-раствора (1 М фосфорной кислоты) и измеряли поглощение при 450 нм.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Анализ параметров спермы и яичек

Сбор образцов спермы: Сбор образцов спермы проводился в соответствии с методом, ранее описанным в [13]. Сперматозоиды собирали из супернатанта и использовали для дальнейшего анализа.

Количество сперматозоидов, подвижность сперматозоидов и аномальные сперматозоиды. Количество сперматозоидов рассчитывали с использованием гемоцитометра и раствора трипанового синего. Затем 100 мкл сперматозоида смешивали с раствором трипанового синего и подсчитывали количество сперматозоидов, подвижность и аномальные сперматозоиды с помощью гемоцитометра и микроскопа [14].

Нитросиний тетразолий. Восстановление NBT и перекисное окисление липидов в сперме и яичках. Перекисное окисление липидов и восстановление NBT анализировали в соответствии с той же процедурой анализа плазмы.

Определение активности супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы. Активность супероксиддисмутазы (СОД) анализировали с использованием набора RANSEL. Здесь {{0}}.05 мл тестикулярных гомогенатов добавляли к 1,7 мл реакционного раствора (0,05 мМ ксантин, 0,025 мМ 2-({ {9}}йодфенил)- 3-(4-нитрофенол)-5-фенилтетразолий хлорид (INT)). После смешивания добавляли 0,25 мл ксантиноксидазы (80 ед/л) и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 30 с. Поглощение измеряли при 505 нм. Концентрацию белка в гомогенате яичек определяли с помощью набора для анализа белков Bio-Rad DC и рассчитывали его удельную активность (Ед/мг белка). Активность каталазы (КАТ) определяли согласно ранее опубликованному методу [15].

Окрашивание H&E (гематоксилином и эозином)

Семенник замачивали в 10% формалине в течение 24 ч и хранили при температуре 4 ◦С. Ткани были микроразмера и прикреплены к предметному стеклу. После фиксации (95 % метанол + 5 % уксусная кислота) предметные стекла погружали в гематоксилин на 3 мин, промывали проточной водой в течение 5 мин, а затем замачивали 50 %, 70 % и 90 % спиртом на одна минута. После этого предметные стекла окрашивали эозином в течение 10 с и замачивали в 100% спирте на одну минуту до его обесцвечивания. Наконец, предметное стекло пропитывали ксилолом на одну минуту. Позже предметное стекло высушивали на воздухе и запечатывали. Окрашенную трубку помещали в инвертированный фазово-контрастный микроскоп (инвертированный фазово-разностный микроскоп, Olympus CK-2, Токио, Япония) для наблюдения за морфологией.

Анализ гипоталамуса

Мышиные последовательности генов KISS1, G-белково-связанного рецептора (GPR) 54, супрессора передачи сигналов цитокинов 3 (SOCS-3) и сиртуина 1 (SIRT1) были идентифицированы из базы данных генов NCBI (Национальный центр биотехнологической информации). и специальный праймер был разработан с использованием Primer 5. 0 PREMIER Biosoft, Пало-Альто, Калифорния, США.). Праймеры, использованные в эксперименте, перечислены в таблице 1.

Экстракция рибонуклеиновой кислоты (РНК) из гипоталамуса. Экстракцию РНК из гипоталамуса головного мозга проводили с помощью набора RNeasy Lipid Tissue Mini Kit. Полученные мРНК количественно измеряли методами обратной транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР). Комплементарную ДНК, полученную в результате RT-анализа, хранили при -20 ◦C для последующего использования. Экстрагированную ДНК подвергали анализу полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием Taq-полимеразы. Затем отбирали 5–10 мкл продукта ПЦР и анализировали электрофорезом на 1,5%-м агар-коллоиде. Изображение было получено с помощью системы визуализации UVP BioDoc-It. Брали обратно-транскрибированную комплементарную дезоксирибонуклеиновую кислоту (кДНК) и проводили ПЦР с использованием набора IQ SYBR Green Supermix Kit. Позже он был проанализирован с помощью программного обеспечения оптической системы iQTM 5. Белки экстрагировали с использованием реагента для экстракции белков (T-PER). Затем 20 мг гомогената тестикул добавляли к 400 мкл T-PER и центрифугировали (Высокоскоростная центрифуга, Hettich CR-12, Туттлинген, Германия) при 4 ◦C (125,000× g ) в течение 20 мин. Следующий метод был аналогичен «идентификации и количественному анализу белка» при анализе in vitro.

2.3. Статистический анализ

Результаты эксперимента выражали как среднее ± стандартное отклонение (Mean ± SD), и данные анализировали с использованием программного обеспечения Statistical Product & Service Solutions (SPSS) 11.0, IBM, Армонк, Нью-Йорк, Нью-Йорк, США. Различия между группами анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Множественные сравнения разных групп анализировали с помощью критерия Дункана при значении p < 0,05 как значимом уровне.

3. Результаты

3.1. Анализ in vitro

3.1.1. Сравнение антиоксидантной активности ECH, CTE и RES

Долгосрочный чВысокий окислительный стресс и хроническое воспаление являются основными причинами диабета.осложнения [16]. CTE содержат различныефенилэтаноидные гликозиды, такие как эхинакозид(ECH) и актеозид, с потенциалом антиоксидантной активности [17]. Удаление радикалов DPPHБыл проведен анализ для оценки антиоксидантной активности ECH. Тролокс и ресвератрол(3,5,4'-тригидроксистильбен, RES) принимали в качестве стандарта и положительного контроля соответственно. Как показанона рисунке1, ECH показал лучшую активность по удалению радикалов, и активность была значительно вышечем у положительного контроля (RES).

3.1.2. Жизнеспособность клеток ECH на клетках Лейдига LC-540 и TM3

МТТ-анализ проводили для оценки жизнеспособности клеток при различных концентрациях ЭХГ. Клетки Лейдига LC-540 и клетки Лейдига TM3 показали более 80% жизнеспособности после обработки ECH (рис. 2). По сравнению с другими концентрациями, концентрация ECH 100- мкМ (разведения 100 мкМ в 2% FBS) показала лучшую жизнеспособность клеток в клетках Лейдига TM3. Результат показал, что повышенная концентрация ЭХГ не оказывает существенного токсичного воздействия на клетки.

3.1.3. Влияние ЭХГ на AGE-индуцированную продукцию супероксида с помощью анализа NBT в клетках Лейдига LC-540 и TM3

КПГ вызывают окислительное повреждение в организме из-за окисления глюкозы и образования свободных радикалов, таких как O2-, гидроксильные радикалы и карбонильные группы [18]. После стимуляции 50 мкг/мл AGE клетки LC-540 (рис. 3a) и TM3 (рис. 3b) обрабатывали ECH и RES (5 мкМ и 10 мкМ каждый). Результаты показали, что производство супероксид-аниона было увеличено в контрольной группе (стимулированные AGE), но производство супероксид-аниона снизилось после контрольной группы (стимулированные AGE), но производство супероксид-аниона снизилось после производства супероксида и защитило. клетки от окислительного повреждения. В случае клеток LC-540 10 мкМ ЭХГ проявляли почти такую ​​же активность, что и нормальная группа. Продукция супероксида в обеих клетках снижалась с увеличением концентрации как ЭХГ, так и РЭС.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША TUBULOSA ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.1.4. Влияние ЭХГ на продукцию H2O2 в AGE-стимулированных клетках Лейдига LC-540

Анализ DCFH-DA был выполнен для обнаружения присутствия окислительных частиц. После попадания в клетки флуоресцентный краситель DCFH-DA окисляется внутриклеточной H2O2 и образует дихлорфлуоресцеин (DCF). Как показано на рисунке 4, наблюдалось значительное увеличение внутриклеточного производства H2O2 в группе, стимулированной AGE (контроль), тогда как добавление 10 мкМ ECH и RES значительно снижало производство H2O2 в клетках. Введение 10 мкМ ЭХГ привело к образованию только около 47,1% H2O2, что значительно ниже, чем в контрольной группе.

3.1.5. Влияние ECH на уровни экспрессии белков RAGE и NF-κB в AGE-стимулированных LC-540 клетках Лейдига

Вестерн-блот-анализ проводили для подтверждения присутствия RAGE в клетках Лейдига LC-540. Влияние ECH на уровни экспрессии белков RAGE (рис. 5a) и NF-κB (рис. 5b) в клетках Лейдига, стимулированных AGE, показано на рисунке 5. Результаты показали, что концентрация AGE 50 мкг/мл индуцирует более высокие уровни RAGE и NF-. Экспрессия κB в клетках Лейдига LC-540 и концентрация ECH и RES в концентрации 10 мкМ значительно снижали экспрессию RAGE и NF-κB. Экспрессия NF-κB была значительно ниже у RES и ECH, чем у антагонистов RAGE. Итак, результаты подтвердили, что ECH снижает уровень воспаления за счет снижения уровня RAGE и NF-κB.

3.1.6. Влияние ЭХГ на путь синтеза тестостерона в AGE-стимулированных клетках Лейдига LC-540.

Процесс сперматогенеза и мужское бесплодие зависят от присутствия тестостерона. Как показано на рисунке 6, экспрессия белков StAR (рис. 6a), CYP11A1 (рис. 6b), CYP17A1 (рис. 6c) и HSD17 3 (рис. 6d) была значительно снижена в AGE-стимулированных LC{{11 }} Клетки Лейдига (контрольная группа). Экспрессия белков StAR, CYP11A1, CYP17A1 и HSD17 3 значительно повышалась при добавлении антагониста RAGE, RES и ECH. Повышенная экспрессия белков StAR и CYP11A1 наблюдалась как в группах, получавших ECH, так и в группах RES. Уровень экспрессии CYP17A1 был практически одинаковым в группах RES и ECH. Экспрессия белка HSD17 3 в клетках Лейдига, обработанных ECH, была намного выше, чем в клетках, обработанных антагонистами RES и RAGE. Повышенная экспрессия белков StAR, CYP11A1, CYP17A1 и HSD17 3 указывала на нормальную выработку тестостерона.