Влияние экстрактов Cistanche Tubulosa на мужскую репродуктивную функцию у крыс с диабетом, индуцированным стрептозотоцином и никотинамидом-Ⅱ

3.2. Анализ in vivo

3.2.1. Влияние CTE на массу тела и потребление калорий

После 6 недель экспериментов группа диабетиков (HFD-DM) показала более высокую массу тела, чем контрольная группа. Группа HFD-DME4 показала меньшую массу тела, чем группы HFD-DM и HFD-DMER (рис. 7a). Потребление калорий в контрольной группе было значительно ниже, чем в других группах. Не было существенной разницы между потреблением калорий в остальных пяти группах (рис. 7b).

3.2.2. Пероральный тест на толерантность к глюкозе (OGTT) для определения успешной индукции диабета

Пероральный глюкозотолерантный тест (ОГТТ) используется как многообещающий инструмент для выявления сахарного диабета. Повышенный уровень глюкозы в крови указывает на диабетическое состояние. Как показано на рисунке 8а, уровень глюкозы в плазме был ниже в группах CTE, чем в группе DM через 0, 30, 90 и 120 минут. Кроме того, площадь под кривой (AUC) концентрации глюкозы в плазме показала, что в группах CTE и RSG скорость поглощения глюкозы в крови была увеличена (рис. 8b).

3.2.3. Общее содержание глюкозы, холестерина и триглицеридов в плазме

Уровень глюкозы в плазме натощак был выше в группе СД и ниже в группе ДМЭ2 (кроме контроля), чем в остальных. Не было значительной разницы в общем холестерине между группами, за исключением группы DME4. В группе DME4 уровень холестерина был ниже, чем у остальных. Уровень триглицеридов был выше в группе СД и ниже в группе ДМЭ4, а содержание триглицеридов снижалось с увеличением концентрации ХТЭ (табл. 2). Результаты показывают, что уровень глюкозы, холестерина и триглицеридов в плазме был выше в группе СД и значительно снижался при лечении ХТЭ.

3.2.4. Уровни инсулина в плазме, уровень лептина в плазме и оценка модели гомеостаза – значения резистентности к инсулину (HOMA-IR)

Уровни инсулина в плазме, лептина и значения HOMA-IR показаны в Таблице 3. В группе СД наблюдались более высокие уровни инсулина в плазме и лептина в плазме, чем в контрольной группе. Индекс HOMA-IR также был достоверно выше в группе СД. Значения плазменного инсулина, лептина и HOMA-IR снижались с увеличением концентрации CTE. Уровень лептина в плазме был значительно снижен в группах с ХТЭ, но группа, принимавшая препарат RSG (DMR), не показала каких-либо существенных отличий от группы с СД.

3.2.5. Влияние CTE на уровень ЛГ и тестостерона в плазме у крыс с диабетом

Как показано в таблице 4, концентрации тестостерона у крыс с диабетом (СД) были значительно снижены, в то время какконцентрации тестостерона были значительно увеличеныпри различных дозах CTE. Далее результаты показали небольшое снижение уровня ЛГ в группе СД по сравнению с ДМР, ДМЭ1, ДМЭ2 и ДМЭ4. Производство ЛГ было выше в группе DME4.

3.2.6. Влияние ХТЭ на параметры спермы диабетических крыс

Результаты эксперимента показали, что в группе СД наблюдалось значительное снижение количества и подвижности сперматозоидов, чем в контрольной группе, тогда как уровень аномалий спермы был значительно увеличен в группе СД. Интересно, что количество сперматозоидов, подвижность сперматозоидов и уровень аномалий сперматозоидов в группе DMR улучшились, но подвижность сперматозоидов не достигла значительного уровня по сравнению с DME4. DME2 показал лучшее количество сперматозоидов, чем все они, а уровень подвижности был значительно увеличен в группе DME4. Не было значительной разницы между количеством аномальных сперматозоидов между группами, получавшими RSG и CTE (таблица 5).

3.2.7. Влияние ХТЭ на морфологию семенных канальцев у крыс с диабетом

На рисунке 9 показано окрашивание H&E среза яичка. Черная стрелка обозначает ячейку Лейдига, а белая стрелка — ячейку Сертоли. Как клетки Лейдига, так и клетки Сертоли в группе СД показали значительную атрофию, и в просвете была видна полость. Структура клеток Лейдига и Сертоли восстанавливалась в группах, получавших ХТЭ и РСГ. Толщина семенных канальцев была выше в группах ХТЭ и РСГ, чем в группе СД.

3.2.8. Влияние CTE на мРНК KiSS1, GPR54, SOCS-3 и SIRT1 в гипоталамусе крыс с диабетом

Экспрессия KiSS1 (рис. 10a), GPR54 (рис. 10b), SOCS-3 (рис. 10d) и SIRT1 (рис. 10c) показана на рис. 10. Экспрессия мРНК KiSS1 и рецептора GPR54 у диабетических крыс была значительно ниже, чем в контрольной группе. Уровни экспрессии мРНК KiSS1 и GPR 54 в DMR, DME1, DME2 и DME4 были значительно повышены. В частности, экспрессия мРНК GPR54 была значительно увеличена у DME4 и была почти такой же, как в контрольной группе.

НАТУРАЛЬНЫЙ ЦИСТАНХ ТУБУЛОЗНЫЙ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ПРОИЗВОДСТВА ТЕСТОСТЕРОНА PHGS75% ECH 30% ACT 12%

В этом эксперименте дополнительно изучалось количество мРНК SOCS-3 и SIRT1 в гипоталамусе крыс. Экспрессия мРНК SOCS-3 у крыс с диабетом была значительно увеличена, что указывает на более серьезный импеданс лептина. Группы DMR, DME1, DME2 и DME4 показали значительные улучшения по сравнению с группой диабетиков. Экспрессия мРНК SIRT1 в группе СД была значительно снижена и значительно увеличена в группах ДМЭ1 и ДМЭ4.

3.2.9. Влияние CTE на антиоксидантные ферменты в плазме и семенниках крыс с диабетом

В таблице 6 показано, что активность СОД в плазме, активность GPx и активность каталазы у диабетических крыс значительно снижались, а активность повышалась в группах, получавших CTE и RSG. В дополнение к этому, DME4 показал значительные улучшения активности GPx, чем другие. Результаты показали, что активность СОД и каталазы у крыс с диабетом значительно снизилась через шесть недель. Активность СОД и каталазы группы ДМР не достигает значительного уровня. В группах, получавших ХТЭ, наблюдались значительные улучшения активности СОД и каталазы. Повышенная активность каталазы и СОД в группах ХТЭ наблюдалась также в семенниках (табл. 7). Самая высокая активность СОД и каталазы наблюдалась в группе ДМЭ1 и ДМЭ2 соответственно.

3.2.10. Влияние ХТЭ на окислительный стресс и воспаление в плазме и семенниках крыс с диабетом

Производство оксида азота (NO) в плазме (рис. 11а) и семенниках (рис. 11b) показано на рисунке 11. Производство NO в группе с СД было значительно увеличено как в семенниках, так и в плазме по сравнению с контрольной группой. Постепенное снижение продукции NO наблюдалось в группах ДМЭ1, ДМЭ2 и ДМЭ4 (в плазме). Группа DMR также продемонстрировала значительное снижение производства NO. В случае семенников в группах CTE наблюдалось небольшое снижение продукции NO, тогда как в группе DMR не наблюдалось значительного снижения продукции NO.

Как показано на Фигурах 12 и 13, уровни TNF- и IL-6 были значительно повышены у крыс с диабетом (как в плазме, так и в семенниках), что указывает на более серьезное воспаление. В плазме уровень TNF- одинаков в группах, получавших CTE и RSG (рис. 12a). Группы CTE (особенно DME2) значительно снизили уровень TNF- в семенниках (рис. 12b). Уровень IL-6 был значительно снижен в плазме групп CTE и RSG (Фигура 13a). В семенниках наблюдалась тенденция к снижению уровня ИЛ-6, но она не достигала значимого уровня (рис. 13б).

3.2.1.1. Влияние ХТЭ на окислительный стресс и воспаление сперматозоидов крыс с диабетом, вызванное диетой с высоким содержанием жиров

На рисунке 14 показано содержание супероксид-аниона в сперме крыс. Результаты показали, что выработка супероксид-анионов в сперме крыс с диабетом значительно увеличилась, а в группе DMR не наблюдалось значительного улучшения. Группы DME1 и DME4 показали значительное снижение производства супероксид-аниона.

3.2.12. Влияние ХТЭ на перекисное окисление липидов в сперматозоидах крыс с диабетом, вызванное диетой с высоким содержанием жиров

Исследования показали, что перекисное окисление липидов увеличивается у пациентов с диабетом как 1-го, так и 2-го типа [19]. Уровень малонового диальдегида (МДА) в плазме, сперме и семенниках показан в Таблице 8. Уровень МДА в плазме, семенниках и сперме группы СД был значительно выше, а лечение ХТЭ и РСГ снижало выработку МДА. Значительное снижение наблюдалось в группах DME4 и DMEI в плазме. Это исследование показало, что у крыс с диабетом не только увеличивается степень перекисного окисления липидов в плазме, но также увеличивается количество яичек и сперматозоидов. Значительное улучшение наблюдалось при различных дозах CTE.

4. Обсуждение

Диабет – хроническое заболевание, связанное с высоким уровнем сахара в крови. Дисбаланс между уровнями антиоксидантов и АФК приведет к состоянию, называемому окислительным стрессом. Супероксид, гидроксильный радикал, перекись водорода, оксид азота и синглетный кислород являются примерами АФК, которые способствуют развитию диабета посредством окислительного стресса [20].Цистанхе трубчатаяэто пустынное растение, содержащее активные компоненты, такие какполисахариды, олигосахариды, фенилэтаноидные гликозиды (эхинакозид, вербаскозид), пальмитиновая кислота, линолевая кислота, иридоиды, альдиты и лигнаны. Это растение способно оказывать противовоспалительное, нейропротекторное, антибактериальное, противовирусное, антиоксидантное, противоопухолевое и иммуномодулирующее действие [21]. Литературные исследования показывают, что фенилэтаноидные гликозиды Cistanche Tubeulosa являются основной причиной антиоксидантной активности [22]. Ресвератрол (RES) и росиглитазон (RSG) использовались в качестве положительного контроля в исследованиях in vitro и in vivo соответственно. RSG является мощным сенсибилизатором инсулина и имеет сродство к изоформе рецептора, активирующего пролифератор пероксисом (PPARc). Он контролирует гипергликемию у пациентов с диабетом [23]. RES обладает естественной антиоксидантной активностью и действует как сосудорасширяющее средство, регулируя метаболизм липопротеинов, ингибируя агрегацию тромбоцитов и предотвращая рак [24,25]. Наше исследование показало, что ECH демонстрирует лучшую активность по удалению радикалов, чем CTE и RES (рис. 1). Также понятно, что ECH не вызывает значительной токсичности для клеток Лейдига LC-540 и TM3 (рис. 2).

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША TUBULOSA ДЛЯ МУЖСКОЙ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

КПГ использовали для индукции стрессовых состояний в клетках Лейдига. Производство КПГ, воспаление, окислительный стресс и диабет взаимосвязаны. Гипергликемическое состояние при диабете способствует повреждению клеток за счет выработки КПГ и окислительного стресса. КПГ вызывают клеточную токсичность, что дополнительно способствует рекрутированию иммунных клеток и их гибели. Повышенный уровень AGE способствует экспрессии двух типов рецепторов, называемых RAGE и AGER1 [26]. Капание и последующий перенос электрона из дыхательной цепи митохондрий к молекулярному кислороду во время окислительного стресса приводит к образованию супероксид-аниона. Наши результаты показывают, что выработка супероксид-аниона, индуцированная AGE, была увеличена в контрольной группе, и дальнейшее улучшение наблюдалось при лечении как ECH, так и RES. Согласно нашему исследованию, выяснилось, что производство супероксида (рис. 3) и H2O2 (рис. 4), индуцированное AGE, снижается в присутствии ECH и RES.

NF-κB известен как важный медиатор воспаления, связанного с диабетом [27]. Экспрессия NF-κB приводит к клеточной дисфункции и гибели клеток. Активация NF-κB под действием окислительного стресса стимулирует провоспалительную реакцию, активацию эндотелина и апоптоз [28]. Экспрессия RAGE и NF-κB повышалась в группах, стимулированных AGE, и последующее снижение наблюдалось в клетках, обработанных ECH и RES (рис. 5).

Тестостеронявляется анаболическим стероидом и основныммужской половой гормонсинтезируется из холестерина. Процесс начинается с окислительного расщепления боковой цепи холестерина геном расщепления боковой цепи холестерина (CYP11A). Этот ген локализован в мембране митохондрий и превращает холестерин в прегненолон. Затем ген CYP17A1 из эндоплазматической сети удаляет два дополнительных атома углерода и производит несколько стероидов C19. В дополнение к этому прегненолон окисляется с образованием андростендиона/прогестерона под действием гидроксистероиддегидрогеназы (3- -HSD). Наконец, тестостерон вырабатывается путем восстановления кетогруппы в 17-м положении углерода андростендиона с помощью 17-бета-гидроксистероиддегидрогеназы (17- -HSD). Клетки Лейдига участвуют в производстве основного тестостерона. Перенос холестерина во внутреннюю мембрану митохондрий требует действия стероидогенного острого регуляторного белка (StAR). Настоящие исследования показывают, что экспрессия StAR, CYP11A1, CYP17A1 и HSD17 3 снижалась в клетках, обработанных AGE (контроль), и наблюдалось огромное увеличение в клетках, обработанных ECH и RES (рис. 6). . Таким образом, результаты показывают, что производствоТестостерон был повышен в группах, получавших ECH и RES. 

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША ТУБУЛОЗНАЯ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ СЕКСУАЛЬНОЙ СИЛЫ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

При диабете транспорт глюкозы к органам ограничен, в результате чего уровень глюкозы повышается [29]. Следовательно, гипергликемическое состояние является одним из важных маркеров для выявления диабета. Наши исследования показывают, что уровень глюкозы в плазме был повышен в группах диабетиков, а AUC в группе СД была значительно выше, чем в других группах (рис. 8). Наряду с глюкозой в плазме в группе СД достоверно повышалось содержание общего холестерина и триглицеридов (табл. 2). Атеросклерозу способствует повышенный уровень холестерина и триглицеридов [30]. Однако уровень холестерина и триглицеридов был снижен в группах, получавших ХТЭ и РСГ. Содержание триглицеридов в группе DME4 достигло практически аналогичных значений с контрольной группой.

Инсулин — это гормон, вырабатываемый клетками поджелудочной железы и призванный контролировать уровень сахара в крови в организме, тогда как лептин — это гормон, вырабатываемый адипоцитами, которые способны регулировать потребление пищи и использование энергии. Исследования показали, что лептин участвует в патофизиологии ожирения и существует положительное взаимодействие между лептином и инсулином [31]. Наши исследования показывают, что уровень инулина и лептина плазмы был выше в группе СД, а уровень инсулина снижался с увеличением концентрации ХТЕ. Группа РСГ не показывает существенных отличий от группы СД. Инсулинорезистентность и функцию клеток оценивали методом HOMA-IR. Значение HOMA-IR увеличилось в группе СД и достоверно отличалось от других групп (табл. 3).

СД влияет на репродуктивную функцию через гормональные изменения в оси HPG, и исследования показали, что диабет также влияет на экспрессию инсулина в яичках. Он характеризуется вакуолизацией клеток Сертоли, повышенной фрагментацией ДНК, нарушением сперматогенеза и повышенным истощением зародышевых клеток. Окислительный стресс также способствует нарушениям репродуктивной функции [32]. Процесс образования сперматозоидов в мужском репродуктивном органе (семенниках) называется сперматогенезом. Яичко состоит из плотно скрученных канальцев, называемых семенными канальцами. Клетки Сертоли обнаруживаются в стенках семенных канальцев и обеспечивают питание незрелых сперматозоидов. Исследование параметров спермы показало, что в группе СД количество и подвижность сперматозоидов снизились, а отклонения увеличились (табл. 5). Противоположный эффект наблюдался в группах, получавших CTE и RSG. Как клетки Лейдига, так и клетки Сертоли в группе СД показали значительную атрофию, и в просвете была видна полость. Толщина семенных канальцев также уменьшилась в группе СД. Улучшенный результат наблюдался в группах, получавших CTE и RSG (рис. 9). В дополнение к этому уровень ЛГ и тестостерона снизился в группе СД и увеличился в группах, получавших ХТЭ (табл. 4). У мужчин низкий уровень тестостерона в сыворотке и более низкая частота пульсации ЛГ часто были связаны с ожирением и сахарным диабетом 2 типа [33].

Кисспептины, кодируемые геном KiSS1, известны как мощный стимулятор оси HPG, и любая мутация в гене кисспептина приведет к снижению уровня половых стероидов и гонадотропина. Исследования показывают, что у крыс с диабетом, индуцированным STZ, уровни мРНК Kiss1 были снижены [33]. Инициирование и поддержание бесплодия у млекопитающих связано с рецептором 54, связанным с G-белком (GPR54). Мутация GPR 54 характеризуется отсутствием полового созревания и низким уровнем гонадотропных гормонов (ЛГ и ФСГ). Провоспалительные цитокины, такие как IL-6 и TNF-, усиливают экспрессию супрессора передачи сигналов цитокинов 3 (SOCS3), участвующего в опосредованной воспалением резистентности к инсулину в печени и адипоцитах [34]. SIRT 1 — это ген, связанный с регуляцией нескольких заболеваний старения. Этот ген активно экспрессируется в клетках поджелудочной железы, регулирует секрецию инсулина и предотвращает апоптоз. Текущие исследования показали, что экспрессия KiSS1, GPR54 и SIRT1 снизилась в группе СД, но экспрессия увеличилась в группах, получавших ХТЭ (рис. 10). Увеличение экспрессии SOCS-3 в группе СД указывает на воспалительное состояние. Первой молекулярной связью, выявленной между ожирением и воспалением, был TNF-. Следовательно, повышенный уровень TNF- является индикатором воспаления. Сниженный уровень провоспалительных цитокинов, таких как TNF- и IL-6, наблюдался в группах, получавших CTE (фигуры 12 и 13).

Дисбаланс между АФК и антиоксидантами приводит к диабетическому состоянию. Супероксиддисмутаза (СОД), каталаза (КАТ) и глутатионпероксидаза (ГПХ) известны как первичные антиоксиданты, ответственные за поддержание оптимального уровня АФК [35]. По результатам установлено, что активность антиоксидантов была значительно ниже в группе СД. Группы, получавшие КТ, показали улучшение выработки антиоксидантов. В группе, получавшей RSG, не было выявлено каких-либо значительных улучшений антиоксидантной активности (таблицы 6 и 7).

Оксид азота (NO) известен как важный АФК, который способствует воспалению. Наши исследования показывают, что уровень NO был снижен в группах, получавших ХТЭ (рис. 11). Результаты показали, что содержание супероксид-анионов в сперме крыс с диабетом значительно увеличилось, и не было значительного улучшения после введения РСГ. Продукция супероксида была снижена в группах ХТЭ.

Определение МДА очень полезно для оценки перекисного окисления липидов. Перекисное окисление липидов — это процесс окисления липидов, который в конечном итоге приводит к повреждению клеток. МДА образуется в результате перекисного окисления липидов полиненасыщенных жирных кислот. Исследования показывают, что уровень MDA коррелирует с возрастом и уровнем глюкозы в крови натощак [36]. Текущее исследование показало, что ХТЭ улучшает перекисное окисление липидов в плазме, семенниках и сперме (таблица 8).

НАТУРАЛЬНЫЙ ЦИСТАНШ ТУБУЛОЗНЫЙ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

5. Выводы

Окислительный стресс при диабете нарушает мужскую репродуктивную систему из-за ухудшения спермы и дисфункции половых желез. Цистанхе трубчатая — пустынное растение, широко распространенное в китайской медицине благодаря своим фармакологическим эффектам.Эхинакозид (ECH)является основным компонентом CTE, ответственным за его антиоксидантную и противовоспалительную активность. Наши результаты in vitro показали, что ECH восстанавливает путь синтеза тестостерона и снижает уровень экспрессии белков NF-κB и RAGE. ЭХГ эффективно ингибировал выработку супероксид-аниона и H2O2 в клетках Лейдига. Исследования in vivo показали, что ЭХГ снижает уровни холестерина, триглицеридов, ФНО- и ИЛ-6. В дополнение к этому, экспрессия мРНК в гипоталамусе крыс с диабетом значительно улучшилась. Также следует отметить, что ЭХГ уменьшал перекисное окисление липидов и улучшал резистентность к инсулину у самцов крыс с диабетом. Антиоксидантная активность увеличивалась как в плазме, так и в семенниках. Таким образом, наши исследования показали, что ЭХГ обеспечивает эффективную защиту от репродуктивной дисфункции у самцов крыс с диабетом, вызванным СТЗ.