Влияние экстрактов банановой кожуры Sucrier на ингибирование меланогенеза через сигнальный путь ERK
Apr 25, 2023
Абстрактный
Гиперпигментация представляет собой тип нарушения пигментации, вызванного гиперэкспрессией содержания меланина, активизирующего серьезные эстетические проблемы, такие как меланодермия, веснушки, эфелиды, лентиго и другие формы на коже человека. Некоторые отбеливающие агенты имеют ограниченное применение из-за их побочных эффектов или стабильности, например, койевая кислота, аскорбиновая кислота и гидрохинон могут действовать как цитотоксические вещества, вызывающие дерматит и рак кожи. Чтобы найти безопасное вещество, это исследование было направлено на поиск способности нескольких компонентов экстрактов банановой кожуры Sucrier (SBP) ингибировать процесс меланогенеза через сигнальный путь p38 в клетках меланомы мыши B16F10. Активность тирозиназы и содержание клеточного меланина снижались дозозависимым образом после лечения СБП. Кроме того, SBP снижал экспрессию связанных с меланогенезом белков, таких как фактор транскрипции, ассоциированный с микрофтальмом (MITF), и белок тирозиназы после 24 часов инкубации со стимулирующими меланоцитостимулирующими гормонами (MSH). Полученные данные показали, что SBP содержит эффективный агент для ингибиторов гиперпигментации через сигнальные пути p38 без какого-либо влияния на путь ERK, а затем подавляет экспрессию MITF и продукцию семейства ферментов тирозиназы.
Согласно соответствующим исследованиям,цистанхеэто обычная трава, известная как «чудо-трава, продлевающая жизнь». Его основным компонентом являетсяцистанозид, который имеет различные эффекты, такие какантиоксидант, противовоспалительное средство, ипродвижение иммунной функции. Механизм между цистанхе и отбеливанием кожи заключается в антиоксидантном действии гликозидов цистанхе.меланинв коже человека образуется при окислении тирозина, катализируемом тирозиназой, причем реакция окисления требует участия кислорода, поэтому свободные кислородные радикалы в организме становятся важным фактором, влияющим на выработку меланина.Цистанхесодержит цистанозид, который является антиоксидантом и может уменьшить образование свободных радикалов в организме, таким образомингибирование выработки меланина.
Нажмите «Где я могу купить Цистанхе».
Для получения дополнительной информации:
david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
Ключевые слова:сухарь банановой кожуры; фенольные соединения; тирозиназа; фактор транскрипции, ассоциированный с микрофтальмом; меланогенез
Введение
Меланин вырабатывается в меланосоме, которая является важной органеллой внутри клеток меланоцитов. Меланоцит располагается в базальном слое кожного эпидермиса. После производственного процесса меланин является пигментом, ответственным за окраску кожи, волос и глаз, который действует как натурализованный антиоксидант, детоксицирующий агент и мощный катионный хелатор, а также может действовать как универсальная защита от УФ-повреждений [1]. Аномальное производство меланина может вызвать нарушения пигментации, такие как гипопигментация и гиперпигментация. Гипопигментация вызывает витилиго, альбинизм и аномальные проблемы с волосами, в то время как гиперпигментация вызывает веснушки, меланодермию, пигментные пятна и поствоспалительную гиперпигментацию. Генетическая предрасположенность, гормональные изменения, особенно эстрогенные, а также другие, такие как заболевания печени, опухоли, рак, недоедание или нерегулярная функция гипофиза, являются внутренними факторами, включая внешние факторы, такие как воздействие ультрафиолета, а токсичные вещества являются основной причиной гиперпигментации [2] .
Тирозиназа представляет собой ступенчатый фермент, ограничивающий скорость, который нацелен как на стимуляцию, так и на ингибирование процесса производства меланина. Стимуляция меланина используется в качестве средства для загара или лечения депигментации волос. Экспрессия тирозиназы контролируется фактором транскрипции, ассоциированным с микрофтальмом (MITF), который является специфичным для меланоцитов фактором транскрипции, который контролирует дифференцировку, пролиферацию и выживание меланоцитов [3, 4]. Ответственность MITF за меланогенез заключается в увеличении экспрессии тирозиназы путем связывания с ДНК в структуре гомодимера или гетеродимера с белком MiT, эти сайты связывания включают E-Box и M-Box, фланкирующие тимидиновый нуклеотид, который стимулирует непрерывные этапы производства меланогенных ферментов. например, родственный тирозиназе белок 1 (TRP-1), родственный тирозиназе белок-2 (TRP-2) и дофахромтаутомераза. Регуляция MITF начинается с передачи сигнала после того, как -MSH связывается с рецептором MC1R, который стимулирует митоген-активированную протеинкиназу (MARK), которая представляет собой серин/треонинкиназу, а также включает киназу, регулируемую внеклеточной передачей сигналов (ERK), а также p38. Несколько исследований показали, что синтез меланина контролируется несколькими сигнальными путями, такими как фосфотидилиназитал-3-киназа (PI3K/AKT), которая может подавляться природными веществами, содержащими полифенольные группы, через сигнальный путь ERK клеток меланомы мыши B16F10 [5,6]. ].
Это исследование было направлено на поиск эффекта ингибирования меланогенеза экстрактами банановой кожуры Sucrier (SBP). SBP может содержать несколько типов полифенольных соединений, которые действуют как ингибиторы тирозиназы, такие как катехин, процианидин, феруловая кислота и галловая кислота, которые обнаруживаются по экспрессии сигнальных путей ERK, которые влияют на выработку меланогенных ферментов, таких как TRP-1 и ВНЖ-2 [7-10].
Материалы и методы
Химикаты и материалы
Разорванная (через 7 дней после сбора) кожура банана Sucrier (Musa spp.) из провинции Кампангпетч, Таиланд. Промытые банановые кожуры водой, затем запекаются на солнце до полного высыхания, измельчаются блендером и экстрагируются путем замачивания в 60-процентном метаноле в течение 24 часов (MW24), центрифугирования в 95-процентном этаноле в течение 10 минут при 4 градусах (E4), кипячения в деионизированной среде. вода при 60 градусах в течение 20 минут (W60) и кипячение в 95-процентном метаноле при 60 градусах в течение 20 минут (M60). Следующим шагом было уменьшение объема с помощью роторного испарителя при температуре 40 градусов и сушка с помощью сублимационной сушилки Christ Alpha- 4 LD plus.
Культура клеток
Клетки мышиной меланомы B16F10 культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM), с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки при 37°С в инкубации с 5% СО2. После 24 часов инкубации среду меняли на среду без сыворотки с различными концентрациями экстрактов банановой кожуры Sucrier (SBP) со стимуляцией -MSH. Затем клетки собирали путем трипсинизации для следующих экспериментов.
Анализ жизнеспособности клеток
Цитотоксичность экстрактов SBP измеряли с помощью анализа МТТ. Клетки (5×10 3) высевали в 96-луночные планшеты и культивировали в среде DMEM в течение 24 часов при 37°С в инкубации с 5% CO2, затем меняли среду на бессывороточную среду с различными концентрациями экстрактов SBP в течение 48 часов. После обработки среду удаляли и дважды промывали холодным PBS, в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора МТТ (5 мг/мл), инкубировали при 37° в течение 4 часов, затем измеряли с помощью считывателя ELISA при 420 нм.
Анализ содержания меланина
Собранные клетки лизировали в буфере для холодного лизиса (20 мМ фосфата натрия, рН 6,8, 1% тритона X-100, 1 мМ PMSF и 1 мМ ЭДТА), а затем центрифугировали при 1200 об/мин при 4 градусах в течение 10 минут, чтобы отделить надосадочную жидкость от осадка меланина. растворяли в 200 мкл 1 н. NaOH в течение 60 минут при 80°С. Считыватель ELISA использовали для измерения поглощения при 415 нм. и рассчитано по сравнению с содержанием белка из анализа содержания белка на основе бицинхониновой кислоты (BCA) (Pierce Biotechnology, Packford, IL, USA).
Вестерн-блот анализ
Супернатант, который был отделен во время прогрессирующего лизиса клеток, был взят для фракционирования в SDS-PAGE, а затем перенесен на нитроцеллюлозную мембрану с улучшенной хемилюминесценцией Hybond (Amersham, Little Chalfont, UK) и зонд с первичным антителом против тирозиназы (Santa Cruz, Biotechnology, Santa Cruz). , Калифорния, США), MITF (Merck Millipore Darmstadt, Германия), ERK (Merck Millipore Darmstadt, Германия), P38 (Merck Darmstadt Millipore, Германия) и моноклональные антитела против B-актина (AC-15, Sigma Aldrich ). С этого момента инкубируйте мембрану с визуализацией комплекса вторичного антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена, и количественно определяйте сигналы с помощью программного обеспечения ImageJ.
Статистический анализ Вся информация была проанализирована с помощью среднего значения ± стандартное отклонение (SD). Односторонний тест ANOVA используется для измерения различий между каждым набором информации. Значение P менее 0,05 считалось статистически значимым.
Полученные результаты
Фенольное соединение
Цель этого эксперимента состояла в том, чтобы измерить эффективность растворителей, используемых для экстракции, а также метод, который может максимально экстрагировать фенольные соединения. Большинство фенольных соединений очень хорошо растворяются при экстрагировании высокополярными растворами, такими как вода, метанол (MeOH), этанол (EtOH), ацетон, этилацетат, пропанол, уксусная кислота или их смесь в различных порциях [11]. На рисунке 1А показано, что W60 может экстрагировать фенольные соединения до 16,24 мкг/мл, за которыми следуют M60, E4 и MW24 с общим содержанием фенола 13,89, 9,21 и 8,38 мкг/мл соответственно. Цитотоксичность SBP была исследована с помощью анализа восстановления МТТ, в котором измерялась среда восстановления от митохондриальной функции живых клеток путем измерения образования формазана для доступа к цитотоксическим эффектам. В результате установлено, что СБП в указанных концентрациях (до 500 мкг/мл) выдерживается в течение 48 часов. Цитотоксичность не показывает значительного эффекта после лечения SBP (рис. 1B).
Влияние SBP на активность ферментов и содержание меланина в клетках B16F10
Чтобы проверить подавление меланогенеза SBP, первым шагом было тестирование способности ингибировать фермент тирозиназы грибов по сравнению с койевой кислотой, которая является коммерческим отбеливающим агентом. SBP (MW24) обладает более высокой эффективностью, чем койевая кислота и другие экстракты при той же концентрации (100-500 мкг/мл). MW24 имеет самый высокий процент ингибирования тирозиназы (66,39-77,05 процента), в то время как койевая кислота имеет только процент ингибирования тирозиназы на уровне 44,68-59,93 процента, как показано на рис. 1C. С этого момента MW24 с самым высоким процентом ингибирования тирозиназы был выбран для измерения антимеланогенеза по продукции меланина клетками B16F10. Содержание меланина в клетках B16F10 снижалось после обработки SBP (MW24) (рис. 2А). Количество содержания меланина в клетках B16F10 значительно снижается после стимуляции -MSH и обработки SBP (MW24) в течение 24 часов дозозависимым образом, как показано на фиг. 2B.
Влияние SBP (M24) на уровни экспрессии белков тирозиназы и MITF
Вестерн-блоттинг использовали для определения активности тирозиназы и MITF путем измерения уровней экспрессии белка после обработки SBP (MW24) в течение 24 часов. Регуляция меланогенных ферментов, таких как TRP-1 и TRP-2, была результатом транскрипционного эффекта MITF и уровня белка тирозиназы. Результаты показывают, что SBP (MW24) способен дозозависимо подавлять экспрессию как тирозиназы, так и белка MITF, как показано на рис. 3.
Влияние SBP (M24) на ингибирование меланогенеза через сигнальный путь митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK)
В меланогенезе семейство киназ MAPKs, особенно ERK и p38, непосредственно связано с этой процедурой [12]. Передача сигналов ERK будет подавляться, в то время как передача сигналов p38 будет повышаться во время производства меланина. Однако фосфорилирование ERK и p38 будет иметь обратную процедуру производства меланина. Результаты показали явный эффект после обработки SBP (MW24) с помощью -MSH, активированного иммуноблотингом на сигнальный путь MAPK. SBP (MW24) слегка снижал экспрессию белка р38 и усиливал фосфорилирование р38. Этот результат показал способ ингибирования процесса меланогенеза через путь p38 без какого-либо влияния на ERK, но уровень фосфорилирования белка ERK немного снизился после обработки -MSH и SBP (MW24), как показано на рис. 4.
Обсуждение
Кожура бананов Sucrier является сельскохозяйственными отходами, содержащими большое количество многих активных ингредиентов, особенно группы фенольных соединений и каротиноидов, которые являются вторичным метаболитом, который растения создают для механизмов самозащиты [7]. Эти вещества можно найти в листьях, коре, плодах, кожуре и семенах практически всех растений. Фенольные соединения и каротиноиды являются фитохимическими веществами, обладающими полезными свойствами для здоровья человека. Вещества включают противовоспалительные, противовирусные, обезболивающие, антиоксидантные, антиканцерогенные и др. [13]. Обычно фенольные соединения хорошо растворяются в высокополярных растворителях. Для эксперимента экстракция MW24 должна обеспечивать максимальное извлечение фенольных соединений из-за процедуры экстракции из анализа Фолина-Чикуальтеу. Сначала экстрагировали низкополярные соединения, затем высокополярные вещества, в зависимости от конечного соотношения растворителя в смеси. Результаты показывают, что W60 может извлекать фенольные соединения в наибольшей степени, возможно, из-за температуры 60 градусов Цельсия, которая может быть подходящей температурой для извлечения фенольных соединений [11]. Можно также предположить, что СБП может содержать высокополярные вещества, хорошо растворяющиеся в воде. При сравнении общего количества фенольных соединений, как показано на фиг. 1А, W60, M60, E4 и MW24 значительно продемонстрировали возможность растворимости вещества.
После того, как было известно общее количество фенольных соединений, мы можем перейти к точному определению типа и количества флавоноидных и каротиноидных веществ. Мы обнаружили, что экстракты SBP (MW24) содержат феруловую кислоту до 906,62 мг/100 г, а также обнаружили небольшое количество лютеина и бета-каротина, которые относятся к группе каротиноидов: 1,23 и 2,37 мг/100 г соответственно. SBD (MW24) по-прежнему имеет высокий процент ингибирования тирозиназы. Поэтому для дальнейшего изучения был выбран SBP (MW 24).
При тестировании на цитотоксичность не было обнаружено значительной цитотоксичности SBP, хотя используемая концентрация составляла до 500 мкг/мл. возможно, потому что небольшое количество каротиноидов в экстракте обладает способностью защищать клетки. Вещества этой группы обладают антиоксидантными свойствами, которые могут уничтожать яд через цитохром P-450, особенно -каротин, который играет стимулирующую роль в иммунных функциях, взаимодействуя с активными формами кислорода (АФК). Это будет поддерживать эффективность фенольного соединения, обладающего свойством удаления АФК, для уменьшения воспалительных цитокинов [14]. Таким образом, SBD (MW24) не только не оказывает токсического действия, но и выполняет роль защиты клеток.
Наше исследование также показало, что SBP (MW24) обладает способностью ингибировать меланогенез клеток B16F10. Экспрессия тирозиназы и MITF снижалась после обработки SBP (MW24) как при оценке грибной тирозиназы, так и при вестерн-блоттинге в зависимости от дозы. Этот тест показал, что SBP (MW24) может подавлять образование меланина путем подавления сигнального пути р38 и активизации фосфорилирования р38, которые активируют деградацию белка MITF, а затем снижают экспрессию семейства меланогенных ферментов, таких как тирозиназа. Подавление p38 снижает функции цАМФ-ответного связывающего белка (CREB), который является важным фактором транскрипции, который работает с PAX3 и SOX10, который присоединяется к M-BOX гена MITF, чтобы активировать экспрессию белка MITF, который влияет на процесс производства меланина и выживаемость клеток [15]. ]. В общем, активация ERK приводит к фосфорилированию MITF по серину 73, что вызывает убиквитинирование и, в конечном итоге, деградацию. Большинство природных соединений могут ингибировать меланогенез посредством процесса стимуляции сигнального пути ERK, но SBP (MW24) не оказывал значительного влияния на сигнальный путь ERK [16].
Многие исследования показали, что фенольные соединения и каротиноиды могут ингибировать выработку пигментов меланина, потому что бета-каротин обладает способностью поглощать фотоны UVB, а также обладает свойством жирорастворимого антиоксиданта, а фенольные соединения могут активировать Nrf2, блокируя рецепторы АФК, уменьшая воспаление. продукцию цитокинов и индуцировать экспрессию y-GSC, что подтверждает наше исследование, но другим способом ингибирования меланогенеза [17]. Помимо того, что феруловая кислота, обнаруженная в SBP (MW24), была основным веществом в группе фенольных соединений, подтвержденным несколькими исследованиями, что она обладает свойством антимеланогенеза, поскольку может модулировать экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), индуцирует оксид азота. синтазы, действуют как ген-супрессор опухолей, а также связаны с процессом производства пигментов меланина. В растворе SBP (MW24) феруловая кислота может повышать эффективность при смешивании с каротиноидами или другими фосфолипидами, поскольку растворимость в воде, растворимость в липидах и биодоступность увеличиваются, что приводит к улучшению ингибирования меланогенеза клеток B16F10 [18]. Смысл всех результатов заключается в том, что SBP (MW24) может эффективно снижать меланогенез.
Сокращения
MITF: фактор транскрипции, ассоциированный с микрофтальмом; -МСГ: -меланоцитостимулирующий гормон; MC1R: рецептор меланокортина-1; TRP1: родственный тирозиназе белок 1; TRP2: родственный тирозиназе белок 2; МАРК: митоген-активируемая протеинкиназа.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами от Royal Golden Jubilee Ph.D.: RGJPHD. Таиланд. (PHD/0017/2558).
Вклад автора
RH, KT, KS и UP задумали и разработали эксперименты; RHCHL и MC провели эксперименты; RH, MC и CHL проанализировали данные; RH предоставила реагенты/материалы/инструменты для анализа; RH и CHL написали статью.
Конкурирующие интересы
Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.
Рекомендации
1.Реньо М.Р., Гадауд Н., Булингес С., Турнье Э., Ламан Л., Гладифф Л. и др. Ретикулярная гиперпигментация, связанная с химиотерапией: серия случаев и обзор литературы. Дерматология 2015; 231: 312-8.
2. Али А. Дерматология. Обзор иллюстраций. McGraw Hill Education 2010. ISBN978-0-07-179323-0.
3. Гаррауэй Л.А., Видлунд Р., Рубин М.А., Гетц Г., Бергер А.Дж., Рамасвами С., Бероухим Р. и соавт. Интегративный геномный анализ идентифицирует MITF как онкоген выживания линии, амплифицированный при злокачественной меланоме. Природа 2005; 436: 117–22.
4. Busca R, Ballotti R. Cyclic AMP – ключевой мессенджер в регуляции пигментации кожи. Исследования пигментных клеток и меланомы, 2000 г.; 13: 60-9.
5. Чжоу Дж., Рен Т., Ли Ю., Ченг А., Се В., Сюй Л. и др. Олеоилэтаноламид ингибирует меланогенез, стимулированный меланоцитстимулирующим гормоном, посредством сигнальных путей ERK, Akt и CREB в клетках меланомы B16. Онкотаргет 2017; 8: 56868-79.
6. Onkoksoong T, Jeayeng S, Poungvarin N, Limsaengurai S, Thamsermsang O, Tripatara P, Akarasereenont P, Panich U. Формула тайского травяного жаропонижающего средства 22 (APF22) ингибирует UVA-опосредованный меланогенез за счет активации Nrf2-регулируемого антиоксиданта. защита. Фитотерапевтические исследования 2018; 32: 1546-54.
7. Сингх Б., Сингх Дж. П., Каур А., Сингх Н. Биоактивные соединения в бананах и их польза для здоровья — обзор. Пищевая химия 2015; 1: 1-11.
8. Leerach N, Yakaew S, Phimnuan P, Soimee W, Nakyai W, Luangbudnark W, Viyoch J. Влияние тайского банана (группа Musa AA) на снижение накопления конечных продуктов окисления в коже мыши, облученной UVB. Журнал фотохимии и фотобиологии, B: Biology 2017; 168: 50-58.
9. Хунг Б.И., Ким С.Ю., Юнг Д.М., Вон Ч., Чой Д.Х., Ли М.В. Противогрибковый агент клотримазол ингибирует меланогенез, ускоряя ERK и PI3K-/Akt-опосредованную деградацию тирозиназы. Экспериментальная дерматология 2015; 24: 381-400.
10. Шен Т., Хео С.И., Ван М.Х. Участие сигнального пути p38 MAPK и ERK в антимеланогенном действии метил-3,5- кофеилхината в клетке меланомы мыши B16F10. Химико-биологическое взаимодействие 2012; 199: 106-11.
11. Рюсгас-Рамон М., Фигероа-Эспиноза М.С., Дюран Э. Применение растворителей глубокой эвтектики (DES) для экстракции фенольных соединений: обзор, проблемы и возможности. Журнал сельскохозяйственной и пищевой химии 2017; 10: 3591-3601.
12. Цао Ю.Т., Куо С.И., Куан Ю.Д., Лин Х.К., Ву Л.Х., Ли Ч.Х. Экстракты астрагала перепончатого ингибируют меланогенез через сигнальный путь ERK. Международный журнал медицинских наук 2017; 3: 1049-53.
13. Чанг Т.С. Обновленный обзор ингибиторов тирозиназы. Международный журнал молекулярных наук, 2009 г.; 26: 2440-75.
14. Ютуру В., Боуман Дж. П., Дешпанде Дж. Общий тонус кожи и эффекты улучшения осветления кожи при пероральном приеме изомеров лютеина и зеаксантина: двойное слепое плацебо-контролируемое клиническое исследование. Клиническая, косметическая и исследовательская дерматология 2016; 7: 325-332.
15. Белл Р.Э., Леви С. Три «м»: меланома, фактор транскрипции, связанный с микроофтальмией, и микроРНК. Исследование меланомы пигментных клеток, 2011 г.; 24: 1088–106.
16. Zhou J, Ren T, Li Y, Cheng A, Xie W, Xu L, Peng L. Олеоилэтаноламид ингибирует β-меланоцит-стимулирующий гормон-стимулированный меланогенез через сигнальные пути ERK, Akt и CREB в клетках меланомы B16. Онкотаргет 2017; 23: 56868-79.
17. Тэйвс ДПЛ, Хофмайстер Н.Р., Тейлор С.А. Эволюция и генетика процессинга каротиноидов у животных. Тенденции генетики 2017; 33: 171-182.
18. Li L, Liu Y, Xue Y, Zhu J, Wang X, Dong Y. Получение комплекса феруловая кислота-фосфолипид для улучшения растворимости, растворения и активности ингибирования клеточного меланогенеза B16F10. Центральный химический журнал 2017; 22: 11-26.
Для получения дополнительной информации: david.deng@wecistanche.com WhatsApp:86 13632399501
