Zerumbone, сесквитерпен тропического имбиря Zingiber Officinale Roscoe, ослабляет индуцированный MSH меланогенез в клетках B16F10, часть 1

Абстрактный:Было показано, что Zerumbone (ZER), активный компонент семейства Zingiberaceae, проявляет несколько биологических активностей, таких как противовоспалительное, противоаллергическое, противомикробное и противораковое; однако его антимеланогенные свойства не изучались. В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что ZER и Zingiber являются официнальными (ZO) экстрактами, которые значительно ослабляют накопление меланина в меланогенных клетках мыши B16F10, стимулированных меланоцит-стимулирующим гормоном (-MSH). Кроме того, чтобы выяснить молекулярный механизм, с помощью которого ZER подавляет накопление меланина, мы проанализировали экспрессию фактора транскрипции, связанного с меланогенезом, фактора транскрипции, связанного с микрофтальмом (MITF), и его генов-мишеней, таких как тирозиназа, родственный тирозиназе белок 1 ( TYRP1) и белок 2, родственный тирозиназе (TYRP2), в клетках B16F10, которые стимулируются -MSH. Здесь мы обнаружили, что ZER ингибирует опосредованную MITF экспрессию меланогенных генов при стимуляции -MSH. Кроме того, клетки, обработанные различными концентрациями zerumbone и ZO, показали повышенное фосфорилирование внеклеточных сигнал-регулируемых киназ 1 и 2 (ERK1/2), которые участвуют в механизме деградации MITF. Фармакологическое ингибирование ERK1/2 с использованием U0126 в значительной степени обращало антимеланогенный эффект ZER, предполагая, что повышенное фосфорилирование ERK1/2 необходимо для его антимеланогенной активности. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что экстракты ZER и ZO могут использоваться в качестве активных ингредиентов в косметических средствах для отбеливания кожи из-за их антимеланогенного действия.

Согласно соответствующим исследованиям, цистанхе — распространенное растение, известное как «чудодейственное растение, продлевающее жизнь». Его основным компонентом являетсяцистанозид, который имеет различные эффекты, такие какантиоксидант,противовоспалительное средство, и продвижение иммунной функции. Механизм междуцистанхеиотбеливание кожизаключается в антиоксидантном действии цистанхегликозиды. Меланин в коже человека образуется в результате окисления тирозина, катализируемоготирозиназа, а реакция окисления требует участия кислорода, поэтому свободные радикалы кислорода в организме становятся важным фактором, влияющим на выработку меланина. Цистанхе содержит цистанозид, который является антиоксидантом и может уменьшить образование свободных радикалов в организме, таким образомингибирование выработки меланина.

Нажмите «Как использовать Cistanche».

Для получения дополнительной информации:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Ключевые слова:зерумбон; Имбирь лекарственный Роско; меланогенез; МИТФ; ЭРК1/2

1. Введение

Меланогенез, выработка меланина эпидермальными меланоцитами, стимулируется -меланоцитстимулирующим гормоном (-МСГ), который секретируется кератиноцитами при воздействии ультрафиолетового (УФ) излучения [1,2]. Фактор стволовых клеток (SCF) является еще одним меланогенным фактором, который строго контролирует миграцию, пролиферацию и дифференцировку меланоцитов для поддержания постнатального кожного меланогенеза [3]. Фактор транскрипции, связанный с микрофтальмом (MITF), который является меланогенным фактором транскрипции, активируется через сигнальный путь цАМФ-PKA-CREB (белок, связывающий ответный элемент циклической аденозинмонофосфат-протеинкиназы A-цАМФ) при стимуляции -МСГ через рецептор меланокортина 1. (MC1R) в цитоплазматических мембранах эпидермальных меланоцитов [4]. Известно, что некоторые химические вещества, такие как форсколин и IBMX (3-изобутил-1-метилксантин), активируют сигнальный путь цАМФ-PKA-CREB, что приводит к индукции меланогенеза [5]. Несколько исследований показали, что устойчивая активация внеклеточно регулируемых киназ 1 и 2 (ERK1/2), которая участвует в молекулярном механизме онкогенеза, способствует фосфорилированию MITF по Ser73 и его последующей деградации посредством убиквитин-зависимого протеолиза [6,7]. ]. Действительно, сообщалось, что U0126, селективный ингибитор пути ERK1/2, увеличивает экспрессию MITF и активность тирозиназы, что приводит к продукции меланина [6]. Стабилизированный и активированный MITF увеличивает экспрессию меланогенных генов, таких как тирозиназа, родственный тирозиназе белок 1 (TYRP1) и родственный тирозиназе белок 2 (TYRP2). Превращение тирозина в 3,4-дигидроксифенилаланин (L-ДОФА), являющееся начальной стадией меланогенеза, катализируется тирозиназой. Белки, родственные тирозиназе (TRP), катализируют дальнейшие реакции окисления и таутомеризации [8]. После синтеза меланина зрелый меланин транспортируется из эпидермальных меланоцитов в цитоплазму базальных кератиноцитов для защиты клеток от УФ-излучения [2].

Аномально повышенный меланогенез вызывает несколько типов кожных заболеваний, таких как рак кожи, хлоазма и веснушки [4]; таким образом, небольшие молекулы или натуральные продукты, которые нацелены либо на каталитическую активность тирозиназы, либо на регуляторы сигнальных путей в меланогенезе, включая ERK1/2 или MITF-опосредованную транскрипцию меланогенных генов, были идентифицированы как активные ингредиенты для использования в косметических средствах. промышленность. Некоторые небольшие молекулы, такие как койевая кислота, арбутин и ниацинамид, широко используются в качестве косметических ингредиентов из-за их антимеланогенной активности. Однако сообщения показали, что койевая кислота вызывает множественные побочные эффекты, включая цитотоксичность, дерматит, рак кожи и гепатоцеллюлярную карциному, из-за ее генотоксической активности [9]. Хотя арбутин, выделенный из растения толокнянки, использовался для лечения гиперпигментации, в последнее время его использование в качестве косметического ингредиента было ограничено из-за нескольких побочных эффектов [9]. Сообщалось, что ниацинамид обладает антимеланогенной активностью, и эта активность осуществляется путем ингибирования переноса меланосомы от меланоцитов к окружающим кератиноцитам [10]. Таким образом, он обычно используется в качестве отбеливающего кожу соединения в косметической промышленности. Чтобы преодолеть ограничения известных средств для отбеливания кожи, которые имеют несколько побочных эффектов, важно разработать безопасные ингредиенты для отбеливания кожи, полученные из природных источников. Например, -туджаплицин, линдеранолид В, 4-бутилрезорцин и плюмбагин были идентифицированы как антимеланогенные соединения из-за их ингибирующего действия на тирозиназу [4,11]. Нобилетин, витаферин А, сезамол и хетоцин проявляют антимеланогенные свойства, модулируя сигнальные интермедиаты в пути меланогенеза [11].

Zerumbone (ZER) представляет собой натуральный продукт, который выделяют из летучих эфирных масел растений, принадлежащих к семейству Zingiberaceae, таких как Zingiber zerumbet Smith и Zingiber officinal Roscoe [12]. Несколько исследований показали, что ZER обладает широким спектром биологической активности, включая антимикробную, антиоксидантную, антидиабетическую, противораковую, противовоспалительную, антиаллергенную и антиангиогенную активность [12]. Интересно, что было показано, что ZER оказывает защитное действие против индуцированного ультрафиолетом A (UVA) окислительного повреждения кератиноцитов кожи благодаря его способности улавливать активные формы кислорода (АФК) посредством активации ядерного фактора-E{{8} }родственный фактор-2 (Nrf2) [1,13]. Это говорит о том, что ZER можно использовать в качестве функциональной добавки в косметике по уходу за кожей. Однако детальный механизм антимеланогенных свойств действия ZER еще предстоит изучить.

В настоящем исследовании изучались ингибирующие эффекты ZER и экстракта Zingiber officinal (ZO) на стимулированный MSH меланогенез и лежащие в их основе механизмы. Здесь мы показываем, что ZER значительно подавляет меланогенез, индуцированный -MSH, путем усиления фосфорилирования ERK1/2 и ингибирования MITF-опосредованной экспрессии меланогенных генов.

2. Результаты

2.1. Zerumbone (ZER) подавляет индуцированный MSH меланогенез в клетках мышиной меланомы B16F10

Чтобы изучить антимеланогенный эффект зерумбона (ZER), мы первоначально оценили его цитотоксичность как в клетках B16F10, так и в клетках HaCaT. Химическая структура ZER показана на рисунке 1А. Было замечено, что ZER при концентрациях выше 20 мкМ проявлял сильный цитотоксический эффект, тогда как при концентрациях ниже 20 мкМ ZER не проявлял цитотоксичности в обеих клеточных линиях (рис. 1В). Затем мы исследовали ингибирующее действие ZER на β-меланоциты, стимулирующие гормон (-MSH), индуцированное накоплением и секрецией меланина в клетках B16F10. Было показано, что ZER сильно подавляет -MSH-индуцированное внутриклеточное накопление меланина и его секрецию в культуральную среду (рис. 1C, D). Более того, мы обнаружили, что ZER ослабляет меланогенез более эффективно, чем 1 мМ арбутин или 0,2 мМ койевая кислота, хорошо известные активные компоненты косметических средств для отбеливания кожи (рис. 1D). Чтобы выяснить, достаточно ли ZER для подавления меланогенеза в клетках человека, мы использовали меланин-продуцирующие клетки меланомы человека G361. Как показано на рисунке 1E, ZER значительно снижает индуцированное фактором стволовых клеток (SCF) вне- и внутриклеточное содержание меланина. Эти результаты подтверждают антимеланогенную активность ZER в меланогенных клетках мыши B16F10 и человека G361.

2.2. Zerumbone подавляет экспрессию генов фактора транскрипции меланогенеза, MITF и его генов-мишеней в клетках меланомы человека G361 

Сообщалось, что эндотелин -1 и передача сигналов SCF играют важную роль в меланогенезе в меланоцитах человека и некоторых подтипах меланомы [3,14–16]. В этом исследовании мы обнаружили, что ZER подавляет меланогенез при меланогенных стимулах, -MSH и SCF, в клетках меланомы мыши B16F10 и человека G361 (рис. 1).

Таким образом, мы измерили изменения уровней экспрессии генов и белков, связанных с меланогенезом, при стимуляции SCF в клетках меланомы человека G361. Мы обнаружили, что ZER ослабляет SCF-индуцированную экспрессию белков MITF и тирозиназы через 2–4 ч и 24–48 ч после стимуляции SCF соответственно (рис. 2А). Кроме того, экспрессия генов, связанных с меланогенезом, таких как MITF, тирозиназа и родственный тирозиназе белок 1 (TYRP1), была подавлена ​​в клетках G361, обработанных ZER (рис. 2B, C). Эти результаты выявили пиковое время экспрессии генов, связанных с меланогенезом, при стимуляции SCF; максимальная индукция мРНК MITF наблюдалась в течение 1–2 часов, а уровни мРНК тирозиназы и TYRP1 достигали своего максимума через 24–48 часов после стимуляции SCF.

2.3. Zerumbone подавляет экспрессию меланогенных генов и ферментов в клетках мыши B16F10

Чтобы исследовать молекулярный механизм, с помощью которого ZER подавляет меланогенез, мы измерили экспрессию гена фактора транскрипции меланогенеза, MITF, и его генов-мишеней, таких как белок 1, родственный тирозиназе (TYRP1), тирозиназа и белок 2, родственный тирозиназе (TYRP2). при отсутствии или наличии ЗЭР. Поскольку пиковое время экспрессии генов, связанных с меланогенезом, при стимуляции SCF и -MSH известно для клеток меланомы G361 человека (рис. 2) и мышиных клеток меланомы B16F10 [4] соответственно, мы дополнительно измерили экспрессию MITF, тирозиназы, TYRP1 и TYRP2. в обработанных ZER клетках меланомы мыши B16F10 после 2 или 48 часов инкубации с -MSH. На фигуре 3A показано, что ZER достаточно для ослабления -MSH-индуцированной экспрессии MITF, TYRP1, TYRP2 и тирозиназы в клетках B16F10. Точно так же уровни экспрессии белка MITF, тирозиназы и TYRP2 снижались при лечении ZER. Опосредованное протеинкиназой А (PKA) фосфорилирование CREB является основным сигнальным путем, увеличивающим MITF на уровне транскрипции при стимуляции -MSH [4]. Таким образом, здесь мы проанализировали, может ли снижение фосфорилирования CREB с помощью ZER опосредовать супрессию MITF. Мы обнаружили, что -MSH-индуцированное фосфорилирование CREB не было затронуто обработкой ZER, предполагая, что ZER подавляет -MSH-индуцированную экспрессию MITF независимо от оси сигнального пути PKA-CREB (рис. 3B). Поскольку тирозиназа является ферментом, ограничивающим скорость, который регулирует синтез меланина [2, 4, 11], мы дополнительно проанализировали уровни внутриклеточного белка тирозиназы и его ферментативную активность при лечении арбутином, койевой кислотой и ZER. На фигуре 3C показано, что ZER в достаточной степени снижает уровни белка тирозиназы, индуцированные -MSH, в клетках B16F10. Кроме того, на рисунке 3D показано, что 10 мкМ ZER более эффективно подавляет окисление L-ДОФА, чем ингибиторы тирозиназы, арбутин и койевая кислота, что позволяет предположить, что окисление L-ДОФА в допахинон посредством ферментативной активности тирозиназы подавляется в клетках, обработанных ZER. . Эти результаты демонстрируют, что ZER ослабляет -MSH-опосредованный меланогенез путем подавления экспрессии гена MITF, фактора транскрипции, связанного с меланогенезом, и его генов-мишеней.

2.4. Антимеланогенный эффект Zerumbone через фосфорилирование ERK1/2

Известно, что активация протеинкиназы B (AKT) и киназ, регулируемых внеклеточными сигналами (ERK1/2) факторами роста или меланогенными стимулами, подавляет меланогенез за счет снижения экспрессии MITF и его генов-мишеней [11]. Фосфорилирование MITF по Ser73 и Ser409 в ответ на сигнальный путь ERK1/2 способствует его протеасомозависимой деградации [17,18]. Поэтому мы исследовали, регулирует ли ZER фосфорилирование ERK1/2 в клетках меланомы мыши B16F10 и G361 человека. Повышенное фосфорилирование ERK1/2 (p-ERK1/2), но не общего ERK1/2 (T-ERK1/2), наблюдалось при лечении ZER в зависимости от времени и дозы (рис. 4A, B). Интересно, что фосфорилирование ERK1 / 2 быстро увеличивалось в течение 10–30 минут и 1–2 часов после обработки ZER в клетках меланомы мыши B16F10 и человека G361 (рис. 4А). Однако фосфорилирование AKT и MEK не наблюдалось при лечении ZER, что позволяет предположить, что индуцированное ZER фосфорилирование ERK1/2 может подавлять MITF (рис. 4B). Поскольку фосфорилирование ERK1/2 способствует фосфорилированию и протеасомной деградации MITF [17,18], мы исследовали, предотвращает ли ингибитор протеасом снижение MITF с помощью ZER. Подавление MITF с помощью ZER не наблюдалось в присутствии MG132, что подтверждает, что ZER снижает экспрессию MITF посредством протеасомной деградации (рис. 4C). Затем мы исследовали, фосфорилирует ли ZER MITF по Ser73, который является целевым остатком ERK1/2. Для обнаружения фосфорилированного MITF клетки подвергали воздействию -MSH и MG132. Здесь мы обнаружили, что уровень фосфорилированного MITF (Ser73) значительно увеличивался под действием ZER в присутствии -MSH и MG132 (рис. 4D). U0126, селективный ингибитор митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) [19], отменял ZER-индуцированное фосфорилирование MITF (рис. 4D). Более того, уровни общего белка MITF в лизатах цельных клеток (WCL) не изменялись под действием ZER и U0126 в присутствии MG132 (рис. 4D). Эти результаты показывают, что ERK1/2-опосредованное фосфорилирование MITF (Ser73) и протеасомная деградация являются критическим механизмом в ZER-опосредованном подавлении MITF. Кроме того, на фигуре 4E показано, что U0126 значительно восстанавливал сниженные уровни белка MITF в клетках, обработанных ZER. Соответственно, сниженное внутриклеточное содержание меланина с помощью ZER было восстановлено с помощью U0126 примерно до 40 процентов (рис. 4F), что свидетельствует о том, что активация ERK1/2 необходима для антимеланогенного эффекта ZER.

2.5. Антимеланогенный эффект экстрактов Zingiber Offificinale (ZO)

ZER представляет собой фитохимическое вещество, полученное из нескольких видов растений семейства Zingiberaceae, таких как Zingiber zerumbet и Zingiber officinal [12]. Таким образом, мы первоначально измерили жизнеспособность клеток в отсутствие или в присутствии экстракта ZO в клетках B16F10 и HaCaT. На фигуре 5А показано, что жизнеспособность клеток не изменилась при обработке экстрактом ZO. Далее мы проанализировали антимеланогенные эффекты экстракта Zingiber officinal (ZO). Поскольку экспрессия MITF и его целевых меланогенных генов снижалась под действием ZER через активированный сигнальный путь ERK1/2 (рис. 2 и 3), мы проверили, подавляет ли экстракт ZO индуцированный -MSH MITF и экспрессию его целевых меланогенных белков в клетках B16F10. Подобно антимеланогенному эффекту ZER, -MSH-индуцированные MITF, тирозиназа и TYRP2 были значительно снижены экстрактом ZO дозозависимым образом (рис. 5B). Интересно, что фосфорилирование ERK1/2 также увеличивалось в клетках, обработанных экстрактом ZO (рис. 5В). Экспрессия MITF и его генов-мишеней, таких как тирозиназа, TYRP1 и TYRP2, значительно снижалась при обработке экстрактом ZO 5 мкг/мкл (рис. 5C). Кроме того, как внеклеточное, так и внутриклеточное содержание меланина было значительно снижено примерно до 40 процентов при обработке экстрактом ZO 5 мкг / мкл (рис. 5D). Кроме того, в клетках, обработанных экстрактом ZO, наблюдалось снижение активности тирозиназы (рис. 5Е). Эти результаты свидетельствуют о том, что экстракт Zingiber officinal (ZO) подавляет меланогенез, ослабляя MITF-опосредованную экспрессию меланогенного гена.

Для получения дополнительной информации: david.deng@wecistanche.com WhatsApp:86 13632399501