Влияние перфузионного давления на потерю подоцитов в изолированной перфузируемой почке мыши

edmund.chen@wecistanche.com

Абстрактный

Предпосылки/цели. Подоциты теряются при большинстве гломерулярных заболеваний, что приводит к гломерулосклерозу и прогрессирующему заболеванию.Болезнь почек. Обычно предполагается, что подоциты подвергаются воздействию фильтрующего потока и, следовательно, значительным силам сдвига, приводящим к их отделению от базальной мембраны клубочков (GBM). В этом контексте стирание отростков стопы было предложено в качестве потенциального адаптивного ответа для увеличения адгезии подоцитов к GBM. Методы. Мы проверили эти гипотезы с помощью оптического просветления и высокоразрешающего 3-мерного морфометрического анализа в изолированных перфузированных мышиных клетках.почка.Мы исследовали динамику отслойки подоцитов при различном перфузионном давлении (50, 300 и более 450 мм рт. ст.) у здоровых молодых или старых мышей (возраст 20 и 71 нед) или у мышей, которым вводили анти-ГБМ сыворотку для индукции глобальной стопы. стирание процесса. Результаты: Результаты показывают, что здоровые подоциты у молодых мышей плотно прикреплены к ГБМ, и даже сверхмаксимальные давления не вызывают значительного отслоения. По сравнению с молодыми мышами, у старых мышей и мышей с анти-GBM нефритом и сглаживанием отростка стопы уже до перфузии происходила постепенная прогрессирующая потеря подоцитов. Высокие перфузионные давления приводили к относительно небольшой дополнительной потере подоцитов у старых мышей. У мышей с анти-GBM нефритом значительная дополнительная потеря подоцитов происходила в этот ранний момент времени при повышении перфузионного давления до 300 мм рт.ст. или выше. Вывод: эта работа представляет собой первое экспериментальное свидетельство того, что подоциты необычайно устойчивы к резкому повышению перфузионного давления в изолированном ex vivoпочкаПерфузионная модель. Только при гломерулярной болезни значительное количество поврежденных подоцитов отделяется после острого повышения перфузионного давления.

Ключевые слова:Клубочковая гипертензия; Клубочковая гиперфильтрация; механические нагрузки; прогресс; Хроническое заболевание почек

CISTANCHE УЛУЧШИТ ЗАБОЛЕВАНИЕ ПОЧЕК / ПОЧЕК

Введение

Клубочковая гипертензия и гиперфильтрация повреждают клубочки, что приводит к прогрессирующему заболеванию клубочков. Широко распространено мнение, что повышенное перфузионное давление подвергает пучок повышенному механическому стрессу, препятствующему адгезии подоцитов к базальной мембране клубочков (GBM), способствуя их отслоению [1, 2]. Подоциты представляют собой высокодифференцированные постмитотические клетки, необходимые для интактного барьера клубочковой фильтрации. Потеря подоцитов, скорее всего, является результатом отделения жизнеспособных клеток от ГБМ, а не апоптоза или некроза [3-6], поскольку было возможно культивировать подоциты, извлеченные из мочи пациентов [4]. Отсоединение жизнеспособных подоцитов от ГБМ может быть результатом нарушения механизмов прикрепления или альтемеханических сил. Нарушение прикрепления к ГБМ может быть связано с повреждением клеток или снижением экспрессии молекул адгезии и в основном связано с воспалительными заболеваниями клубочков. Что касается механических сил, имеющих отношение к подоциту, есть два ключевых детерминанта, а именно давление фильтрации и поток фильтрата [7-9]. Давление фильтрации создает окружное напряжение стенки и действует как растягивающая сила на GBM. Изменения трансмурального гидростатического давления эффективно компенсируются способностью ГБМ действовать как эластичная мембрана и расширяться или сжиматься на площади поверхности [8, 10]. С другой стороны, поток фильтрата через ГБМ оказывает тангенциальное воздействие на поверхность подоцитов, т.е. напряжение сдвига. Из исследований in vitro мы знаем, что подоциты очень чувствительны к напряжению сдвига, отделяясь от своего субстрата при воздействии напряжения сдвига более 0,025 Па [11] и приобретая промежуточный фенотип, который может помочь им противодействовать силам, создаваемым потоком [12]. Остается неясным, влияет ли клубочковая гипертензия на подоциты через повышенное фильтрационное давление и/или повышенную фильтрацию. В этом исследовании мы предоставляем первый анализ способности подоцитов противостоять повышенным механическим силам в модели ex vivo. Потеря подоцитов была количественно определена с высоким разрешением с использованием просветления тканей и 3-размерного морфометрического анализа у молодых и здоровых мышей.

Материалы и методы

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с положениями немецкого закона о благополучии животных и были одобрены Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (Az 84-02.04. 2015.A469). Мышей содержали в отдельном помещении, свободном от патогенов, со свободным доступом к пище и воде и циклом день/ночь в 12-часов. Селекцию и генотипирование проводили в соответствии со стандартными процедурами. Мыши Pod-rtTA/LC1/R26R/H2BeGFP на генетическом фоне FVB/N были описаны ранее [13]. Чтобы активировать экспрессию трансгена Pod-rtTA-eGFP, мыши получали доксициклин через питьевую воду без ограничений в течение 7 дней (2 г/л, 5% сахарозы, защищенная от света) с последующим периодом вымывания в течение 1 недели, как в предыдущих отчетах. Анти-ГБМ-нефрит вызывали однократной внутрибрюшинной инъекцией 5 мг/г массы тела нефротоксичной сыворотки, как описано ранее [14].

CISTANCHE УЛУЧШИТ ФУНКЦИЮ ПОЧЕК / ПОЧЕК

Перфузия почек

Изолированныйпочкамодель перфузии использовали, как описано в другом месте [15]. Вкратце, мышей наркотизировали внутрибрюшинной инъекцией ксилазина/кетамина (0, 1 мл/10 г массы тела внутрибрюшинно), а затем почки перфузировали сложным модифицированным раствором Кребса-Хенселейта (таблица 1) с добавлением 5 процент альбумина бычьей сыворотки (BSA) при 37 градусах, чтобы имитировать физиологическую среду во время эксперимента. Максимальная вазодилатацияпочкасосудистую сеть индуцировали 1. подкожной инъекцией верапамила (50 мкл) сразу после индукции анестезии и 2. добавлением папаверина к перфузионному раствору. После начальной перфузии в течение 5 минут при 50 мм рт.ст. для мечения эндотелиальных клеток вводили флуоресцентно-меченый лектин (Communis I - RCA120; Vector Laboratories: RL-1082; 4 мкл в 986 мкл физиологического раствора).почкиперфузировали в течение дополнительных 5 минут модифицированным раствором Кребса-Хензелейта с 5% БСА. После этого слевапочкаслуживший парным контролем в каждом эксперименте, удаляли после тщательной перевязки левойпочечныйсосуды, нарезанные на ломтики, и непосредственно погруженные в 3-процентный параформальдегид (PFA) в фосфатно-солевом буфере (PBS). Правопочка was perfused either for additional 5 minutes at 300 mmHg or with supramaximal pressure (>>300 мм рт. ст., давление фильтрации, по оценкам, значительно выше 400 мм рт. ст.), наносится вручную, общий объем перфузионного раствора составляет 50 мл.почкиперфузировали при постоянном давлении 50 мм рт.ст. или 300 мм рт.ст. с помощью насоса с регулируемым давлением (Universal Perfusion Systems UP-100, Hugo-Sachs Electronics, Германия). Тогда правопочкаудаляли, разрезали на ломтики толщиной 2 мм и погружали в 3-процентный раствор параформальдегида (PFA) в фосфатно-солевом буфере (PBS).

3D-визуализация и вычислительный анализпочкасрезы инкубировали на механической качалке в течение 5 дней при комнатной температуре. После этого фиксированные образцы промывали 1x PBS и помещали в механический шейкер на ночь при комнатной температуре.ПочкаЗатем срезы помещали в высококачественный 100-процентный этанол (Merck; 100983) на 1 час при комнатной температуре при осторожном встряхивании (не менее 1 замены на свежий этанол) с последующим непосредственным погружением в этилциннамат (ECi) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури; 112372) и оставляли на ночь в мягком шейкере при комнатной температуре под защитой от света. Полупрозрачность тканей достигается менее чем за 1 час. Для прямых микроскопов мы использовали одноразовые камеры собственного производства, как описано ранее [16]. Большинство экспериментов было выполнено с использованием 2-фотонного микроскопа (LaVision BioTec TriMScope, "Medizinische Fakultät RWTH Aachen, IZKF Aachen, Core Diseases"). Для перемещения по оси Z каждой стопки последовательных оптических срезов использовалось программное обеспечение Fiji. и выделить отдельные клубочки с помощью 3D кадрирования [16].40 клубочков напочка(20 субкортикальных и 20 юкстамедуллярных) были отобраны для анализа. Таким образом, всего в этом исследовании было проанализировано 1200 клубочков, чтобы получить результаты с достаточной точностью. Подоциты идентифицировали как клетки eGFP plus. Количественную оценку объема капилляров, объема клубочков, а также количества ядер (точки) и объема выполняли с использованием программного обеспечения для трехмерного рендеринга и анализа (Imaris v9.1; Bitplane AG, Цюрих, Швейцария). Расстояние подоцитов от сосудистого полюса рассчитывали с помощью Bitplane XTension "Ближайшая точка. Расстояние". Автоматическую количественную оценку подоцитов проводили, как описано ранее [17]. Анализ изображения выполняли с помощью Imaris (Biplane AG Zurich, Швейцария). Каждый клубочек определялся меченой лектином афферентной артериолой. 20 субкортикальных и 20 юкстамедуллярных (определяется их расстоянием от поверхности коры).

CISTANCHE УЛУЧШИТ БОЛИ В ПОЧЕКАХ

Световая микроскопия и иммунофлуоресценция

Для световой микроскопии используют 4-процентный буферный раствор формалина.почкафрагменты обезвоживали, заливали в парафин и окрашивали йодной кислотой-Шиффом (ПАШ). Процент аномальных/поврежденных клубочков рассчитывали на основе идентификации 50 репрезентативных гломерулярных поперечных срезов на мышь, выбранную во время систематического хождения по комнате.почечныйкора. Наш стандартный протокол иммунофлуоресценции [18] был выполнен на срезах, залитых парафином толщиной 2 мкм. Использовали следующие антитела: куриные поликлональные анти-GFP (ab13970; Abcam), мышиные моноклональные анти-синаптоподиновые (sc-515842; Santa Cruz Biotechnology), поликлональные кроличьи антимышиные p57 (sc-8298; Santa -Cruz Biotechnology), кроличьи поликлональные анти-WT1 (sc-192; Santa-Cruz Biotechnology), ослиный антикуриный Cy2 (703-225-155; Dianova, Гамбург, Германия), Alexa Fluor546 козий антимышиный IgG1 (A-21123; Thermo Fischer), поликлональный осел против кроликов AF555 (A31572; Life Technologies, Карлсбад, Калифорния).

Электронная микроскопия

Небольшие кусочки коры фиксировали в растворе Карновского и заливали в Epon (Serva, Heidelberg, Germany). Ультратонкие срезы исследовали на просвечивающем электронном микроскопе ZEISS Leo 906 при 60 кВ при увеличении от 3597-6000х. Образцы промывали в 0,1 М фосфате Серенсена (Merck, Дармштадт, Германия), затем фиксировали в 1 % OsO 4 (Roth, Карлсруэ, Германия) в 17-процентном буфере сахарозы (Merck, Дармштадт, Германия) и обезвоживали восходящей последовательностью этанола ( 30, 50, 70, 90 и 100 процентов) по 10 минут каждый. Последний шаг повторяется 3 раза. Обезвоженные образцы инкубировали в пропиленоксиде (Serva, Гейдельберг, Германия) в течение 30 мин, в смеси эпона (Serva, Гейдельберг, Германия) и пропиленоксида (1:1) в течение 1 ч и, наконец, в чистом эпоне в течение 1 ч. Полимеризацию эпона проводили при 90°С в течение 2 часов. Ультратонкие срезы (70-100 нм) делали на ультрамикротоме (Reichert Ultracut S, Leica) с помощью алмазного ножа (Leica) и наносили на сетки Cu/Rh (HR23 Maxtaform, Plano, Wetzlar, Германия). Контраст усиливали с помощью окрашивание 0,5-процентным уранилацетатом и 1-процентным цитратом свинца (оба EMS, Мюнхен, Германия).Образцы просматривали при ускоряющем напряжении 60 кВ с использованием просвечивающего электронного микроскопа Zeiss Leo 906 (Carl Zeiss, Оберкохен, Германия).

статистический анализ

Статистический анализ был выполнен с помощью программного обеспечения GraphPad Prism v8. Все значения выражены как среднее значение ± стандартное отклонение. Для сравнения 2 групп использовали t-критерий. Сравнение нескольких групп проводили с помощью дисперсионного анализа; Для множественных сравнений использовали апостериорную коррекцию Тьюки. Все тесты были 2-хвостатыми, а статистическая значимость была определена как P <>

Полученные результаты

Полуавтоматический метод определения числа подоцитов в клубочке. Исследовали три группы, т.е. здоровых молодых и старых мышей и мышей с анти-ГБМ гломерулонефритом (♂:♀ 1:1). Молодым здоровым мышам было 15-21 недель, тогда как старым (старым) мышам было 74 недели. Сглаживание глобального отростка стопы индуцировали у мышей в возрасте 14-20 недель однократной инъекцией анти-GBM сыворотки за 3 дня до установки изолированной перфузируемойпочкамодели (рис. 1А), как описано ранее [19].

Чтобы определить влияние внутрипочечного перфузионного давления на подоциты,почкиподвергались различному перфузионному давлению в изолированныхпочкаПерфузионная модель. Во-первых, обапочкивсегда перфузировались при 50 мм рт.ст. в течение 5 мин. Чтобы проверить, сохранил ли наш перфузионный раствор целостность клубочка в жизнеспособном нефиксированномпочки2 мышам перфузировали при постоянном давлении 100 мм рт.ст. в течение 90 мин. Перфузия, поток мочи (25 мкл/мин/г массы тела), а также клиренс инулина (22 мкл/мин) оставались стабильными в течение всего времени (дополнительный рисунок 1 – все дополнительные материалы см.www.cellphysiolbiochem.com).У экспериментальных мышей после начальной перфузии при 50 мм рт.почка was removed and served as a control in all experiments. Next, constant pressure of 300 mmHg or a pressure significantly higher than 300 mmHg (>>300 мм рт.ст.; супрамаксимальное фильтрационное давление около 450-500 мм рт.почкав течение 5 мин. (рис. 1Б). В изолированном перфузированномпочки, подоциты идентифицировали с помощью мечения ядра eGFP-гистоном у наших трансгенных мышей, экспрессирующих eGFP под промотором подоцина (мыши eGFP:Pod-rtTA). Количество подоцитов определяли количественно с использованием комбинации этого метаболического мечения in vivo и трехмерной морфометрии (рис. 1C).

Потеря подоцитов у здоровых и старых мышей

Healthy mice contained 87.46 ± 5.66 (SD) podocytes per glomerulus at baseline (i.e.at physiological perfusion pressure of 50 mmHg) (Fig. 2A). Juxtamedullary glomeruli were larger than those in the outer cortex (Supplementary Fig. 2), but this was not associated with higher podocyte numbers (87.0± 23.65 vs. 90.1 ± 18.49, respectively, Fib 2B). No differences in the number of podocytes related to sex were observed (see below). In young mice, there was no significant loss of podocytes at high (300 mmHg) or maximal (>>300 mmHg) perfusion pressures (85.62 ± 10.83 and 81.98 ± 6.45 podocytes per glomerulus, respectively) (Fig. 1A). On PAS sections, mild histological changwere observed particularly in aged mice (Fig. 2A), which were independent of perfusion pressures. In addition, tubular dilatation and interstitial edema were apparent as a result of perfusion. In humans, older age (53 ± 10 years) has been associated with absolute and relative podocyte depletion [20]. Compared to young mice, our mice aged 72 weeks contained significantly lower numbers of podocytes per glomerulus at baseline (52.81 ± 13.8 SD), indicating that about 40% of the podocytes had been lost. Perfusion at high or maximal pressures resulted in only a very mild reduction of podocyte numbers (48.65 ± 16.8 SD and 41.06 ± 17.7 SD, respectively). Because of the precision of the counting method (absolute podocyte numbers in 40 glomeruli per mouse) [21], the loss of podocytes of 7.9% and 22% after perfusion with 300 or >>300 мм рт. ст. соответственно по сравнению с исходным уровнем предполагает, что это незначительное увеличение потери подоцитов при более высоком давлении не является случайным. На срезах PAS у старых мышей исходно наблюдались легкие гломерулярные изменения (мезангиальное расширение и иногда склероз, рис. 2F). А

Потеря подоцитов после острой травмы

Сыворотку против GBM наносили на молодых здоровых мышей, чтобы вызвать значительное и специфическое повреждение подоцитов. В очень ранний момент времени (т.е. через 3 дня) после индукции анти-GBM гломерулонефрита генерализованное сглаживание отростков стопы наблюдалось во всех клубочках с помощью просвечивающей электронной микроскопии (рис. 3A-D). В изолированной перфузиипочкиobtained from these mice, at baseline (i.e. perfusion with 50mmHg) podocyte numbers per glomerulus were reduced by 20% compared to controls (69.76 ± 7.07 vs 87.46 ± 5.66, respectively) (Fig. 3E). Perfusion with higher pressures (300 and >>300 mmHg) resulted in significant further reductions of podocyte numbers per glomerulus (50.84 ± 7.82 and 53.18 ± 4.26, respectively), i.e. 27% and 24% additional reduction (Fig. 3E). When analyzing individual glomeruli, the anti-GBM mice, perfusion with >>300 мм рт. ст. вызывали потерю более 80% подоцитов в меньшинстве клубочков (рис. 3Е). Это согласуется с фокальным характером модели заболевания против ГБМ. В юкстамедуллярных клубочках потеря подоцитов была более выраженной по сравнению с подкорковыми клубочками (56,66 ± 16,9 и 47,35 ± 17,07 соответственно) (рис. 3F).

By transmission electron microscopy (TEM), specific changes were observed after high perfusion pressures, in particular focal podocyte detachment from the GBM and denuded basement membrane (Fig. 3D). Cellular debris was present within the capillaries as well as within Bowman's space (>>300 мм рт.ст.); эндотелий не показал существенных изменений. Окрашивание PAS выявило дилатацию канальцев. Через три дня после инъекции сыворотки против ГБМ очаги в виде полулуний еще не развились (рис. 3G-I). У самцов наблюдалась более высокая степень потери подоцитов по сравнению с самками (63,71 ± 2,11 против 75,81 ± 3,83 подоцитов на клубочек), что согласуется с наблюдением, что самцы мышей более восприимчивы к антисыворотке против GBM и образуют больше клеточных полулуний в ходе заболевание (рис. 3J). Однако дополнительная потеря подоцитов после высокого перфузионного давления была одинаковой у самцов и самок (рис. 3J).

Рис. 3. Потеря подоцитов после острой травмы. (AB) Просвечивающая электронная микроскопия из контроляпочка per- fused at a low pressure and after supramaximal pressure (>>300 mmHg) shows normal foot process architecture. (C-D) Transmission electron microscopy reveals the typical finding of foot process effacement after injection of anti-GBM serum at baseline. After perfusion with higher pressure, areas of denuded basement membrane were observed. (E) Total number of podocytes per mouse in anti-GBM mice at baseline and under higher (300 mmHg) or supramaximal pressures (>> 300 mmHg); (each circle represents 1 kidney; n=7 control kidneys with 50mmHg, n=8 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=4 kidneys with 300 mmHg or >> 300mmHg). (F) Total number of podocytes per glomerulus in juxtamedullary and subcortical glomeruli; each circle represents 1 subcortical glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse) and each triangle represents 1 juxtamedullary glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse). (G-I) Histologic staining of anti-GBM mice at baseline identified protein casts, whereas three days after injection of anti-GBM serum no crescentic lesions could be found. After perfusion with higher pressure, tubule-interstitial dilatation and edema were observed. (J) Total podocyte number per mouse between males and females; each circle represents 1 kidney (n=4 control kidneys with 50mmHg, n=4 anti-GBM kidneys with 50mmHg, n=2 kidneys with 300 mmHg or >>300 мм рт.ст.). Для множественных сравнений ANOVA. ****П<0.0001, ***p ="" <="" 0,0001,=""><0.01,><0.05 and="" ns="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="">

Отслеживание потерянных подоцитов в канальцах

eGFP плюс подоциты регулярно наблюдали в просвете проксимальных канальцев, где они, по-видимому, прикреплялись к щеточной кайме клеток проксимальных канальцев (рис. 4А). Эти подоциты не вымывались в условиях гиперперфузии.почкаs, вместо этого они довольно плотно прилегали к щеточной кайме, чтобы выдерживать необычайный поток первичной мочи при очень высоком перфузионном давлении. Чтобы подтвердить их идентичность, подоциты окрашивали специфичными для подоцитов маркерами (т. е. p57, синаптоподин и WT -1) в дополнение к ядерному маркеру отслеживания генетической линии eGFP (рис. 4B). Количество подоцитов было значительно ниже в клубочках с прилипшими подоцитами в ассоциированных проксимальных канальцах, а наличие подоцитов в канальцах обратно пропорционально количеству подоцитов на клубочек (рис. 4С).

Преимущественная потеря подоцитов в прикорневой локализации

Finally, we investigated whether podocyte loss driven by an acute increase in perfusion pressures might occur in preferential locations of the glomerulus (i.e. at the vascular pole vs. the tubular pole of the glomerular tuft). To analyze the spatial distribution of podocyte detachment, the vascular pole was marked in each glomerulus (acquired in 3D) based on the lectin signal and the distance of each podocyte from the vascular pole was determined semi-automatically. The individual distances from the vascular pole were separated into quartiles (Fig. 4E). As depicted in Fig. 4E, the majority of podocytes clustered in the 2 middle quartiles (i.e. quartile 2 and 3). Less than 12 % of the podocytes localized to either in the first, i.e. vascular pole, or the fourth quartile, i.e. most distant from the vascular pole. Upon perfusion with pressures >>300 мм рт. ст., у молодых и здоровых мышей существенных изменений в пространственном распределении подоцитов не наблюдалось. У старых мышей расстояние подоцитов от сосудистого полюса в целом было увеличено, что, скорее всего, отражало гломерулярную гипертрофию, тогда как гиперперфузия приводила к преимущественному отслоению подоцитов вблизи сосудистого полюса (1-й квартиль уменьшился с 11,5 до 4,9 процентов у старых мышей, рис. 4E). ). Точно так же преимущественное отделение подоцитов вблизи сосудистого полюса наблюдалось в стертых подоцитах (анти-GBM, 1-й квартиль снижен с 25 до 5 процентов).

Обсуждение

В этом исследовании мы изучили острое влияние повышенного фильтрационного давления и фильтрационного потока на потерю подоцитов в изолированной перфузируемой мышиной почке, используя в настоящее время наиболее точный метод определения количества подоцитов. Первым важным открытием нашего исследования было то, что здоровые подоциты не восприимчивы к острому стрессу сдвига in vivo, как предполагалось ранее в исследованиях клеточных культур [11]. К нашему удивлению, даже экстремальные супрафизиологические давления (более 450 мм рт. ст.) не вызывали значительного отслоения подоцитов. Наоборот, просвечивающая электронная микроскопия показала, что все три слоя фильтрующего барьера сохранились относительно хорошо. У мышей старшего возраста наблюдалось снижение количества подоцитов (как сообщалось ранее), и это было связано лишь с очень ограниченной повышенной чувствительностью к высокому перфузионному давлению. Вторым важным открытием было то, что предшествующее повреждение подоцитов сделало подоциты восприимчивыми к отслоению при высоком перфузионном давлении. У мышей с анти-GBM наблюдалось полное сглаживание отростков стопы через три дня после инъекции антисыворотки против GBM, и значительное количество мышей отделялось при высоких перфузионных давлениях. Мы предполагаем, что у старых мышей физиология подоцитов относительно хорошо сохранилась, что делает их менее восприимчивыми к отслоению. Применяя полуавтоматический подход к подсчету, каждый клубочек анализировали отдельно (всего проанализировано 1200 клубочков). Мы подтвердили, что юкстамедуллярные клубочки имеют больший объем, чем подкорковые клубочки. Интересно, что количество подоцитов было одинаковым, показывая, что плотность подоцитов снижена в юкстамедуллярных клубочках. Кроме того, юкстамедуллярные клубочки также были более уязвимы к повышенному давлению фильтрации по сравнению с подкорковыми клубочками. Эти результаты могут частично объяснить, почему поражения ФСГС можно наблюдать с более высокой частотой в таких больших клубочках [22, 23].

Рис. 4. Обнаружение подоцитов в прилежащих прокс. трубочка. (A) Репрезентативное изображение, показывающее eGFP плюс подоциты (зеленые) в канальцах. (B) Иммунофлуоресцентное окрашивание подоцитов, совместно помеченных трансгенным гистоном eGFP (зеленый) и маркерами эндогенных подоцитов p57 (красный), wt -1 (красный) и синаптоподином (фиолетовый). (C) Связь количества подоцитов на клубочек с количеством подоцитов, идентифицированных в канальцах (n=81 клубочков от контрольных мышей, n= 41 клубочков от старых мышей и n= 81 клубочки от мышей против GBM). Для множественных сравнений использовали ANOVA. ****П<0.0001,>< 0.01="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="" sd;="" in="" the="" graph,="" each="" circle="" represents="" 1="" podocyte;="" (d)="" schematic="" showing="" how="" the="" distance="" of="" podocytes="" from="" vascular="" pole="" was="" calculated.="" (e)="" distances="" of="" individual="" podocytes="" from="" the="" vascular="" pole.="" the="" individual="" distances="" from="" the="" vascular="" pole="" were="" separated="" into="">

Ограничением данного исследования является короткий период наблюдения, так как нельзя сделать никаких выводов относительно долговременной адаптации подоцитов к повышенному фильтрационному давлению. Было высказано предположение, что первой реакцией подоцитов на сдвиговое напряжение являются защитные структурные изменения [8, 24]. Эти изменения включают потерю фильтрационных щелей (т.е. FPE) и замену щелевых диафрагм закупоривающими или плотными соединениями. Окклюзионные соединения ранее были описаны в нескольких моделях гломерулярных заболеваний [25-28]. Однако в нашем исследовании мы заметили, что подоциты с FPE были более восприимчивы к более высокому перфузионному давлению=. Следовательно, наши результаты показали, что этих адаптивных изменений недостаточно для защиты от отслоения или, возможно, даже наоборот, что они делают подоциты более восприимчивыми к отслоению. Далее, можно утверждать, что изолированный перфузируемыйпочкане является физиологической системой и что применяемое давление было намного выше, чем в условиях in vivo. Насколько нам известно, ни одна другая модель, использующая неповрежденный жизнеспособныйпочкасуществует, который позволил бы непосредственно исследовать эффекты повышенного перфузионного давления. Применение сосудорасширяющих средств до и во время перфузии вызывает максимальное расширение прегломерулярных сосудов, что обеспечивает неограниченный поток (гиперфильтрация) и максимальную передачу повышенного перфузионного давления в клубочки. В настоящем исследовании изучались острые эффекты более высоких перфузионных давлений. Долгосрочные эффекты патологической гиперперфузии могут быть более опасными, приводя к еще большей потере подоцитов. Однако наше исследование предполагает, что эта хроническая потеря подоцитов обусловлена ​​не чистой силой потока фильтрации как таковой, а скорее (неправильными) адаптивными изменениями в подоцитах, которые уменьшают их прилипание к GBM. Пациенты с гломерулярными заболеваниями получают пользу от антигипертензивного лечения, предотвращая (маль-)адаптивные структурные изменения подоцитов.

Вывод

Эта работа предоставляет первое доказательство in vivo того, что здоровые подоциты необычайно прочно прикреплены к GBM в почках здоровых мышей и могут противостоять даже очень высокому перфузионному давлению. Старение или даже более выраженное острое повреждение подоцитов с глобальным сглаживанием делает подоциты восприимчивыми к отслоению при повышенном перфузионном давлении.