Эластаза и обострение нейтрофильного врожденного иммунитета участвуют в мультивисцеральных проявлениях COVID-19

Абстрактный

Фон:

Многие аргументы предполагают, что нейтрофилы могут играть важную роль в развитии COVID-19. Однако роль ключевых компонентов нейтрофильного врожденного иммунитета при тяжелых формах COVID-19 заслуживает недостаточного внимания. Мы стремились оценить участие нейтрофильной эластазы, гистоновой ДНК и ДНКаз в системных и полиорганных проявлениях COVID-19.

Количество и активность нейтрофилов являются важными показателями, отражающими иммунный статус организма. Когда организм стимулируется инфекцией или воспалением, нейтрофилы быстро увеличиваются и попадают в поврежденную ткань или место воспаления, высвобождая достаточное количество ферментов и белков для удаления вредных веществ. Эта способность быстрого реагирования делает нейтрофилы важной частью иммунной защиты организма. В то же время нейтрофилы также участвуют в процессе иммунной регуляции. Они могут сотрудничать с другими иммунными клетками, чтобы регулировать иммунный ответ организма и поддерживать баланс иммунной системы. При некоторых болезненных состояниях, таких как аутоиммунные заболевания, аллергические реакции и т. д., аномальное увеличение или активность нейтрофилов негативно влияет на иммунную систему организма, вызывая ненужные воспалительные реакции и повреждение тканей. В повседневной жизни мы также должны обращать внимание на наш иммунитет. Цистанхе может повысить наш иммунитет в повседневной жизни. Полисахариды в мясе могут регулировать иммунный ответ иммунной системы человека и усиливать стресс иммунных клеток. Способность усиливать бактерицидное действие иммунных клеток.

Нажмите Польза цистанхе для здоровья

Методы:

Проведено многоцентровое исследование маркеров нейтрофильного врожденного иммунитета у 155 больных, последовательно набранных в скрининговом центре, районных больницах и двух областных университетских больницах. Случаи оценивались по клиническим и биологическим маркерам тяжести и полиорганным проявлениям и сравнивались с 35 здоровыми людьми.

Полученные результаты:

Уровень эластазы нейтрофилов крови, гистоновой ДНК, миелопероксидазной ДНК и свободной двухцепочечной ДНК резко увеличился, а активность ДНКазы снизилась в 10- раза по сравнению с контролем. Нейтрофильная эластаза и гистоновая ДНК были связаны с поступлением в реанимацию, температурой тела, повреждением легких, маркерами сердечно-сосудистых исходов, почечной недостаточностью и повышением уровня интерлейкина-6 (ИЛ-6), ИЛ-8 и CXCR2. Нейтрофильная эластаза была независимым предиктором компьютерной томографии поражения легких COVID-19 и количества пораженных органов в многофакторном анализе. Повышенные концентрации в крови NE и нейтрофильных внеклеточных ловушек были связаны с усилением стимуляции нейтрофилов через повышенные концентрации IL-8 и CXCR2 и повышенные уровни DAMP в сыворотке, а также с нарушением деградации NET вследствие резкого снижения уровня ДНКазы в крови. активность.

Заключение:

Наши результаты указывают на ключевую роль обострения нейтрофильного врожденного иммунитета при COVID-19. Нейтрофильная эластаза и ДНКаза могут быть потенциальными биомаркерами и терапевтическими мишенями для тяжелых системных проявлений COVID-19.

ГРАФИЧЕСКАЯ АБСТРАКЦИЯ

Уровни нейтрофильной эластазы и гистоновой ДНК в крови связаны с тяжелыми, системными и полиорганными проявлениями COVID-19. Повышение концентрации в крови нейтрофильной эластазы и нейтрофильных внеклеточных ловушек связано с обострением стимуляции нейтрофилов посредством активированного пути IL-8/CXCR2. Нейтрофильная эластаза и ДНКаза могут быть потенциальными биомаркерами и терапевтическими мишенями для тяжелых системных проявлений COVID-19.

1|ВВЕДЕНИЕ

Коронавирусная болезнь 2019 г. (COVID-19) вызывает тромбоэмболические явления и полиорганные проявления, включая поражение сердца, печени и почек.1,2 Они частично являются результатом чрезмерного вовлечения врожденного иммунитета3 и цитокинового шторма, вызванного лимфоцитами и активация макрофагов.4–6 Аргументы предполагают, что нейтрофилы также играют заметную роль в тяжелых и угрожающих жизни формах заболевания.6–9 Однако участие нейтрофилов в системных и полиорганных исходах COVID-19 заслуживает недостаточного внимания.8

Нейтрофилы обладают арсеналом защитных стратегий, которые включают высвобождение антимикробных гранул и нейтрофильной эластазы (NE), а также формирование нейтрофильных внеклеточных ловушек (NET). патогены.6,8 Исследование показало, что два маркера НЭО, внеклеточная ДНК и миелопероксидаза (МПО)-ДНК, были повышены у госпитализированных пациентов с COVID-19 по сравнению с 30 контрольными и коррелировали с С-реактивным белком, D-димер, лактатдегидрогеназа и абсолютное количество нейтрофилов.9

Другое исследование, проведенное нашей группой, показало, что уровень МПО-ДНК повышается на ранней стадии тяжелого острого респираторного синдрома, вызванного коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), в амбулаторных случаях.10 Гомеостаз циркулирующих НЭО зависит от НЭ. и ДНКаза 1 и ДНКаза 11L3.6 Чрезмерное количество НЭ и НЭО в крови вызывает сосудистые и тканевые поражения при острой вирусной пневмонии, которые напоминают наблюдаемые при инфекции COVID-19.6,11,12 Несмотря на эти доказательства, является ли НЭ, Участие ДНКаз и гистоновой ДНК в поливисцеральных проявлениях COVID-19 до настоящего времени не оценивалось.

Настоящее исследование является первым, в котором изучались НЭ, общая ДНКазная активность и гистоновая ДНК у пациентов с COVID-19, набранных в скрининговых центрах, местных больницах и региональных больницах, чтобы оценить их в зависимости от тяжести заболевания и полиорганного поражения. проявления. Мы обнаружили, что НЭ был независимым предиктором полиорганного поражения, вызванного COVID-19. Высвобождение NE и NET было связано с активацией нейтрофилов молекулярными паттернами, связанными с повреждением сыворотки (DAMP), и путем IL -8/CXCR2.

2|МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1|Набор пациентов и клинические характеристики исследуемой популяции

Исследование NICO (Врожденный иммунитет нейтрофилов при COVID-19) было зарегистрировано Институциональным наблюдательным советом по клиническим исследованиям (DRCI) Университетской больницы Нанси (№ 2020PI087) и одобрено Комитетом по этике. Мы провели перекрестное последовательное исследование 155 положительных пациентов, набранных после информированного согласия в центре скрининга, местных больницах, отделениях медицины и отделениях интенсивной терапии двух университетских больничных центров в пиковый период пандемии COVID-19 в Франция. Мы следовали рекомендациям EQUATOR и BRISQ по представлению клинических и биологических данных и использованию биологических образцов. Инфекция была охарактеризована с помощью ОТ-ПЦР образцов мазков из носа. 34 последовательных амбулаторных пациента посетили центр скрининга в первую неделю заболевания, как описано ранее. {11}}) и региональных университетских больниц Марселя и Нанси (n=78).

Среди них 13 лечились в отделениях реанимации. Медиана задержки между появлением симптомов и забором крови составила 7 дней (МКР: 4–13) в медицинских отделениях и 13 дней (МКР: 4–14) в отделениях интенсивной терапии. Мы сообщили о клинических характеристиках и результатах госпитализированных пациентов, перечисленных в таблице S1. Оценка повреждения легких оценивалась с помощью компьютерной томографии по 5 баллам (оценка КТ), как описано.13 В контрольную группу входили здоровые люди, у которых не было сообщений о контакте с инфицированными и отрицательный результат скрининга на COVID-19.

2.2|Забор крови и биологическая оценка

Сыворотки использовали после завершения биохимического тестирования по указанию клинициста. Остальные образцы хранились в одинаковых условиях среди групп при температуре -20 градусов в течение 24 часов после забора крови. Рутинные биохимические маркеры определяли на анализаторах Cobas 8000 (Roche Diagnostics, Швейцария) и Atellica (Eschborn, Германия).

2.3|Измерение эластазы, МПО-ДНК, ДНК-гистоновых комплексов, двухцепочечной ДНК и цитокинов в сыворотке

Уровни циркулирующих комплексов гистон-ДНК измеряли в сыворотке с помощью набора ELISA для обнаружения гибели клеток (Roche Diagnostics, Sigma-Aldrich, США), как описано ранее.14 Значения приведены в единицах поглощения при 450 нм. Комплексы ДНК-МПО измеряли путем замены антигистонового антитела кроличьим поликлональным антителом против миелопероксидазы (Merck, Дармштадт, Германия). Концентрацию НЭ определяли с использованием набора ELISA для нейтрофильной эластазы человека (Invitrogen, Карлсбад, США). Значения представлены в нг/мл. Бесклеточную двухцепочечную ДНК количественно определяли с использованием набора для анализа двухцепочечной ДНК Quant-iT PicoGreen® после вычитания фона (Invitrogen). IL-6, IL-8 и CXCR2 анализировали с помощью наборов ELISA от Reagentbio Ireland Ltd, Дублин, Ирландия, IL-1 от Invitrogen, HMGB1 от Novus Biologicals (Centennial, США) и TNF- с помощью набора ELISA от R&D Systems Inc. (Миннеаполис, США).

2.4|Общая дезоксирибонуклеазная (ДНКазная) активность в сыворотке с помощью анализа однократной радиальной ферментативной диффузии (SRED)

Активность ДНКазы количественно определяли на агарозном геле, содержащем 0,13 мг. мл–1 ДНК из спермы лосося в буфере, содержащем 100 мМ MES pH 6,5, 20 мМ MgCl2, 2 мМ CaCl2 и гель-краситель SYBR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen, Life Technology), как описано15,16. Два микролитра сыворотки помещали в колодцы. Гели инкубировали в течение 24 ч при 37°С во влажной камере. Флуоресценцию ДНК-СИБР регистрировали с помощью флуоресцентного сканера.

2,5|Количественное определение связанных с клетками NET в нейтрофилах, инкубированных с сывороткой пациента

Чтобы определить, влияет ли сыворотка пациентов с COVID-19 на клеточно-связанные сети, кровь одного здорового донора смешивали (1:1 по объему) с сывороткой пациента перед лечением PMA и инкубировали в течение 6 часов, как описано.14 Лизис эритроцитов был достигнут добавлением 1 мл реагента FACS Lyse (BD Biosciences, разведение 1:10) в течение 5 минут. Затем добавляли бычий сывороточный альбумин (BSA, 1 мл, 2%) в фосфатно-солевом буфере (PBS) и смесь центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин. Осадок, ресуспендированный в PBS, анализировали с использованием проточного цитометра Gallios (Beckman Coulter, Villepinte, France). Стратегия гейтирования последовательно фокусировалась на (i) CD66-положительных клетках, а затем (ii) на H3Cit-положительных и MPO-положительных клетках.

2,6|Анализ на высвобождение ДНК НЭО нейтрофилов в сыворотке пациента in vitro

Изолированные нейтрофилы ресуспендировали в RPMI 1640, и 1 × 105 клеток высевали в 96-луночные планшеты для тканевых культур, как описано.14 Планшеты инкубировали при 37°С, чтобы позволить клеткам прилипнуть. После стимуляции 100 мкл 0,1 нг/мл ФМА в течение 4 ч лунки инкубировали с 1 ЕД/мл МНазы или ДНКазы 1 (обе фирмы Worthington) в течение 10 мин или с 10 мкл сыворотки пациента или контрольной сыворотки в течение 6 ч, а затем с 2 мМ ЭДТА добавляли для остановки активности нуклеазы. Содержание ДНК, выделившееся в супернатант, количественно определяли с использованием набора для анализа dsDNA Quant-iT PicoGreen® (Invitrogen). Количество высвободившейся ДНК в нестимулированных нейтрофилах здоровых доноров принимали за 100%.

2,7|Статистический анализ

Все количественные переменные показаны как медиана и межквартильный диапазон (IQR, 25-75-й процентиль), а качественные переменные - как проценты и 95-процентный доверительный интервал (95-процентный ДИ). Непараметрические тесты использовались, когда распределение данных не было нормальным. Однофакторный анализ проводился с использованием критерия хи-квадрат или точного критерия Фишера для категориальных переменных, а также U-критерия Манна-Уитни и критерия Крускала-Уоллиса и ранговой корреляции Спирмена для непрерывных переменных. Апостериорные парные сравнения между подгруппами проводились с использованием теста Коновера. Впоследствии мы выполнили анализ рабочих характеристик приемника (ROC), чтобы найти оптимальные пороговые значения, связанные с исходами заболевания.17 Затем мы выполнили анализ рабочих характеристик приемника (ROC), чтобы найти оптимальный порог, связанный с исходами заболевания, в соответствии с DeLong et al.17 Классификационной переменной, используемой в ROC-анализе, был исход изучаемого заболевания.

For each ROC analysis, we reported the area under the receiver operating characteristic curve (AUROC) and the associated p-value. The exact binomial method was applied to estimate the 95% confidence intervals (CIs) of the AUROC. The optimal diagnostic cutoff was defined using the Youden index J. Bias-corrected and accelerated (BCa) bootstrap interval after 10,000 iterations for the Youden index and its associated values was performed.18 Clinical and biological criteria were used to define organ injuries (see the Methods section in this article's Online Repository at www.jacionline.org). Bias-corrected and accelerated (BCa) bootstrap interval after 10,000 iterations for the Youden index and its associated values were performed.18 In step #2, using multivariable logistic regression analysis, we assessed whether the ROC-defined threshold defined for elastase (>593 нг/л) был связан с «количеством пораженных органов, большим или равным 2» после учета потенциальных искажающих факторов. Мы оценили дискриминацию модели с помощью ROC-анализа (AUROC и 95-процентный доверительный интервал) и калибровки модели с использованием теста согласия Хосмера и Лемешова и статистики Nagelkerke R2.19

In step #3, we assessed the association between elastase level (>или меньше или равно 593 нг/л), а также демографические данные пациентов, истории болезни и исходы заболеваний. Размер выборки из 7 пациентов на группу был необходим для выявления увеличения более или равного 200 процента и 38 пациентов для выявления увеличения более или равного 100 процентов среднего значения эластазы между группами , с 1- на уровне 80 процентов и на уровне 0,05. Статистический анализ проводили с использованием MedCalc, версия 19.1 (MedCalc Software, Остенде, Бельгия) и Stata SE, версия 12.1 (College Station, Техас, США), на основе двусторонней ошибки I типа с альфа-уровнем 0,05.

3|ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1|NE, MPO-ДНК и гистоновая ДНК резко повышены, а активность ДНКазы резко снижена при COVID-19 амбулаторно и госпитализированно

пациенты

34 амбулаторных случая имели средний возраст (плюс /-SD) 42 плюс /-17 года и соотношение полов (М/Ж) 0,88. У всех было по крайней мере два симптома, включая лихорадку, сухой кашель и одышку в течение менее одной недели. Ни у кого не было тяжелой формы на этой стадии заболевания. Клинические характеристики 122 госпитализированных случаев приведены в таблице S1, их биологические маркеры, включая IL-6, IL-8, CXCR2, TNF-, IL-1 и HMGB1, указаны в таблице S2, а характеристики 35 здоровых контролей представлены в таблице S3. Уровни НЭ, МПО-ДНК, гистоновой ДНК и двухцепочечной ДНК у амбулаторных и госпитализированных пациентов с COVID-19 представлены в таблице S4. Они были значительно выше, чем у контрольных субъектов. Напротив, глобальная активность ДНКазы была 10-кратно ниже в случаях COVID-19 (рис. 1A, B).

Концентрация компонентов НЭ и НЭО в сыворотке не была связана с возрастом и полом среди групп, а концентрация в сыворотке 1-антитрипсина (ААТ), основного ингибитора НЭ в крови, была нормальной (таблица S2). Концентрация НЭ была значительно выше у госпитализированных по сравнению с амбулаторными случаями и у пациентов, получавших реанимацию по сравнению с местными больницами и медицинскими отделениями университетских больниц (рис. 1А). НЭ был распределен в два кластера высокой и низкой концентрации у амбулаторных больных и пациентов, госпитализированных в лечебные отделения областных университетских больниц. Кластеры с самыми высокими концентрациями имели значения, аналогичные тем, о которых сообщалось в отделениях интенсивной терапии (рис. 1А). Как видно для компонентов NE и NET, концентрация двухцепочечной ДНК была выше у пациентов, поступивших в отделения интенсивной терапии (рис. 1В). Кроме того, сывороточная концентрация компонентов NE и NET была связана с количеством пораженных органов (рис. 1C).

3.2|НЭ, гистоновая ДНК и общая активность ДНКазы связаны с тяжестью и мультивисцеральными проявлениями COVID-19

Мы изучили ассоциации между эластазой, ДНК, конъюгированной с миелопероксидазой, комплексом гистон-ДНК, и клиническими и биологическими характеристиками пациентов (таблица 1). Мы сообщили о значительных корреляциях НЭ с гистоновой ДНК, МПО-ДНК, биомаркерами тяжести заболевания, SaO2 при поступлении в стационар, лейкоцитами, нейтрофилами, соотношением нейтрофилов к лимфоцитам, ЛДГ, маркерами сердечно-сосудистого и тромботического риска, включая тропонин-Т ( cTnT), фибриноген и D-димер, а также маркеры почечной недостаточности, включая мочевину и креатинин (таблица 1 и рисунок 2). Мы также наблюдали значительную связь НЭ с IL-6, IL-8 и CXCR2, но не с TNF, IL-1 и HMBG1 (рис. 3). Сообщалось о значительной связи гистоновой ДНК с показателем компьютерной томографии (оценка КТ) повреждения легких,13 маркерами сердечно-сосудистого и тромботического риска,13 (таблица 1), включая cTnT и фибриноген, маркерами почечной недостаточности, включая мочевину и креатинин, и маркеры воспаления, включая С-реактивный белок, ферритин и температуру тела (рис. S1). Напротив, МПО-ДНК ассоциировалась только с лейкоцитами (p=0,005) и нейтрофилами (p=0,004), а при меньшей значимости - с D-димером (p=0). 0,045) и фибриноген (р=0,047). Суммарная ДНКазная активность была связана с щелочной фосфатазой (ЩФ) и общим билирубином, тогда как дцДНК была связана только с ферритином (табл. 1).

РИСУНОК 1 Нейтрофильная эластаза (NE), миелопероксидаза-ДНК (MPO-ДНК), гистоновая ДНК и (B) бесклеточная двухцепочечная ДНК и общая ДНКазная активность в сыворотке 155 случаев COVID-19-положительных. Симптоматические амбулаторные случаи (n=34) были набраны в центрах скрининга и госпитализированных пациентах (n=122) ​​в местных больницах (n=43) и медицинских отделениях (n=65) и отделения интенсивной терапии (n=13) двух областных университетских больниц. P-значения концентраций норадреналина между группами были следующими: здоровые по сравнению с амбулаторными.<0.0001; healthy versus proximity hospital <0.0001; healthy versus medical department <0.0001; healthy versus intensive care <0.0001; ambulatory versus proximity hospital 0.7870; ambulatory versus medical department 0.0028; ambulatory versus intensive care <0.0001; proximity hospital versus medical department 0.0003; proximity hospital versus intensive care <0.0001; and medical department versus intensive care 0.0239. The p-values of MPO concentrations between groups were healthy versus ambulatory <0.0001; healthy versus proximity hospital <0.0001; healthy versus medical department <0.0001; healthy versus intensive care <0.0001; ambulatory versus proximity hospital 0.1237; ambulatory versus medical department 0.8589; ambulatory versus intensive care 0.1276; proximity hospital versus medical department 0.1463; proximity hospital versus intensive care 0.5811; and medical department versus intensive care 0.1482. 

P-значения значений гистонов_ДНК между группами были здоровыми по сравнению с амбулаторными<0.0001; healthy versus proximity hospital <0.0001; healthy versus medical department <0.0001; healthy versus intensive care <0.0001; ambulatory versus proximity hospital 0.0013; ambulatory versus medical department 0.0525; ambulatory versus intensive care <0.0001; proximity hospital versus medical department 0.2740; proximity hospital versus intensive care 0.0.0033; and medical department versus intensive care 0.0003. The thresholds (dotted lines) were evaluated in healthy controls recruited several months before the epidemy. 

Порог НЭ оценивали в 73 нг/мл, порог МПО-ДНК в 0.562 а.е. (45{6}} нм), гистон-ДНК в 0,591 а.е., суммарную активность ДНКазы при 9,94 ед/мл и дцДНК в сыворотке при 95,60 нг/мл (C) NE, МПО-ДНК и гистоновая ДНК в зависимости от количества органов, пораженных COVID-19. Данные (A), (B) и (C) сравнивали с помощью критерия Манна-Уитни. Пунктирные линии представляют пороговые значения, определяемые средним значением плюс 2 стандартных отклонения для NE, МПО-ДНК, гистоновой ДНК и бесклеточной ДНК, а также средним значением — 2 стандартных отклонения для активности ДНКазы.

3.3|Диагностическая точность НЭ, МПО-ДНК, гистоновой ДНК, двухцепочечной ДНК, активности ДНКазы и родственных цитокинов для выявления исходов заболевания при анализе рабочих характеристик приемника (ROC)

Мы провели анализ ROC, чтобы оценить диагностическую точность NE, MPO-ДНК и гистоновой ДНК для прогнозирования исходов, связанных с заболеванием (таблица S5 и график Фореста на рисунке 4). НЭ имела значимые пороги госпитализации в отделения интенсивной терапии, возникновения дыхательной недостаточности, сатурации крови кислородом<85%, and the presence of at least two affected organs (Figure 4). The latter was best predicted with a cutoff at 593 ng/ml of NE. Histone-DNA had significant thresholds for admission into intensive care units, kidney injury, and blood oxygen saturation <85%. MPO-DNA had significant thresholds for heart decompensation, kidney injury, respiratory failure, and blood oxygen saturation <85%. The ROC analyses identified also very significant cutoffs for IL-6, IL-8, and CXCR2 for admission into intensive care units, heart decompensation, kidney injury, and respiratory failure. In contrast, we did not observe these associations with IL-1β and TNF-α.

3.4  |  Associations between NE >593 нг/мл и характеристики пациентов и исходы

In univariate analyses, NE >593 ng/ml was significantly associated with CT score, blood oxygen saturation, respiratory failure, presence of at least two affected organs, and admission into the intensive care unit (Table S6). We retained chronic kidney disease, diabetes, and hypertension as potential confounders in multivariable analyses (Table S7). In the multivariable models that were used to account for the collinearity issue, NE >593 нг/мл независимо ассоциировалось с оценкой по КТ и наличием как минимум двух пораженных органов (таблица S8). Оптимальная многопараметрическая модель имела площадь под рабочими характеристиками приемника (AUROC) 0,876 (95-процентный доверительный интервал, 0,758–0,950) и процент правильных случаев. классифицируется на 85 процентов. Мы провели анализ соответствия между пороговыми значениями НЭ и цитокинов при прогнозировании как минимум двух пораженных органов. Мы сообщили о совпадении NE с CXCR2 и IL-6 на уровне 70,4% и 72,7% соответственно (рис. 3).

3,5|Сыворотка пациентов снижает удержание NET и увеличивает высвобождение двухцепочечной ДНК в изолированных контрольных нейтрофилах.

Мы исследовали связанные с клетками сети контрольных нейтрофилов, инкубированные с сывороткой пациентов, с использованием проточной цитометрии. Мы наблюдали снижение удержания связанных с клетками NET, что отражало повышенное высвобождение клеток, инкубированных с сывороткой пациента, по сравнению с контрольной сывороткой (рис. 5А). Далее мы изучили высвобождение двухцепочечной ДНК из контрольных нейтрофилов, продуцируемых сывороткой пациентов. Мы наблюдали повышенное высвобождение двухцепочечной ДНК из нейтрофилов, инкубированных с сывороткой пациента, по сравнению с контрольной сывороткой (рис. 5В). Ингибирование NE и других сериновых протеаз сыворотки с помощью 10 мкМ апротинина оказывало слабое ингибирующее действие на высвобождение двухцепочечной ДНК (фиг. 5C). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что сыворотка пациентов увеличивает высвобождение компонентов NET с ограниченной ролью NE.

4|ОБСУЖДЕНИЕ

Our study showed that NE, global DNase activity, and components of NETs are involved in the early and later steps of COVID-19. NE and histone-DNA were associated with clinical manifestations and biomarkers related to pulmonary damage, cardiovascular manifestations, renal insufficiency, and inflammation. Elastase >593 нг/мл был независимым предиктором полиорганного повреждения в многомерном анализе.

Резкое повышение уровня НЭ и НЭО в крови в амбулаторных случаях показывает их участие в раннем ответе хозяина на SARS-CoV-2, как ранее наблюдалось для других вирусных пневмоний.4,6,11,20 Увеличение НЭ и НЭО все еще наблюдается на более поздней стадии инфекции, о чем свидетельствуют госпитализированные случаи, в частности те, которые были набраны в отделение интенсивной терапии через две недели после появления симптомов. Альвеолярные эпителиальные клетки из легких, инфицированных вирусом гриппа, стимулируют NETosis.21 Однако ведутся споры о вредном и защитном действии NETs при остром респираторном дистресс-синдроме (ARDS).22,23 Цитруллинированный H3 и бесклеточная ДНК отражают производство внеклеточных ловушек нейтрофилами, гранулоцитами и моноцитами.23,24 Значительное увеличение концентрации норадреналина в крови более конкретно отражает активацию нейтрофилов.24,25 Следует отметить, что концентрация норадреналина лучше коррелирует с альвеолярным воспалением, чем число нейтрофилов, при остром респираторный дистресс-синдром.25,26.

НЭ, но не гистоновая ДНК и МПО-ДНК, был независимым предиктором полиорганного повреждения у пациентов с COVID-19. Этот результат отражает выдающуюся роль NE в высвобождении компонентов NET и механизмов врожденного иммунитета нейтрофилов. 24 NE распределяется в тканях и крови путем дегрануляции или высвобождения с NET. 24, 27–29 Индукция АФК вирусной инфекцией активирует МПО. , который затем активирует высвобождение NE.29,30 Очень значимая корреляция между NE и гистоновой ДНК и MPO-ДНК иллюстрирует роль NE в формировании NET. При стимуляции нейтрофилов NE перемещается в ядро, где он участвует в деградации гистонов, прежде чем он высвобождается вместе с ДНК/хроматиновым материалом NETs.6,30 Важно отметить, что NE, связанный с NET, остается активным и избегает эндогенной антипротеазной активности AAT. 31 НЭ может вызывать повреждение тканей в легких, сердце, печени, сосудах и почках и оказывает протромботическое действие при вирусной инфекции.6,26,31–37

Деградация компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ) под действием НЭ вызывает такие же повреждения легких и сосудов, как и те, что наблюдаются в образцах вскрытия пациентов с COVID-19.34–39 Ассоциации НЭ и гистоновой ДНК с SaO2 при поступлении в больницу и КТ-оценка повреждения легких при COVID-18 согласуется с их эффектами при других легочных вирусных инфекциях. COVID-19.39–41 Повреждение миокарда во время COVID-19 до конца не изучено.42–44 Механизмы включают прямую вирусную инфекцию, тромбоз, повреждение микрососудов и миокарда, связанное со снижением доставки кислорода и высвобождения цитокины.34,43,45 Повышение cTnT, связанное с НЭ, может быть вторичным по отношению к тромбозу коронарных артерий и инфаркту миокарда и/или миокардиту.34,43,44 НЭ и НЭО также могут способствовать ассоциации с повреждением сердца через системные эффекты в почках. и других органов.2,45,46 Связь НЭ и гистоновой ДНК с мочевиной и креатинином предполагает их участие в остром повреждении почек, зарегистрированном примерно у 30 процентов пациентов с COVID-19.33,47-49 .

Наше исследование способствует лучшему пониманию патологических механизмов COVID-19, указывая на ключевую роль нарушения врожденного иммунитета нейтрофилов во время и после репликации вируса, как показано в графическом резюме. IL-6, IL-8 и TNF- объясняют цитокины, преимущественно связанные с тяжестью COVID-19.50 Мы подтвердили эту связь для IL-6 и IL{{7}. }. Повышенные концентрации IL-1 положительно коррелировали с тяжестью заболевания в нескольких исследованиях.51 Однако мы не обнаружили какой-либо связи IL-1 с исходами тяжести COVID-19, как сообщалось ранее в исследовании. недавний мета-анализ.52 Эти результаты согласуются с данными недавнего крупного исследования, в котором ИЛ-1 был плохо обнаружен и, как следствие, имел лишь незначительное прогностическое значение тяжести заболевания.50 ИЛ{{17 }} и IL-8 продуцируются при активации NF-κB инфицированных альвеолярных макрофагов посредством механизмов, которые, вероятно, включают тирозинкиназу Брутона (BTK). тяжелая форма COVID-19.53 IL-8 действует как хемокин, активирующий нейтрофилы, путем связывания с CXCR2, который является основным хемокиновым рецептором нейтрофилов.15 Таким образом, резкое увеличение НЭ при тяжелой форме COVID{{27 }} может быть связано с активацией нейтрофилов путями IL-8/CXCR2.16 ЛДГ, ферритин и D-димер тесно связаны с НЭ и могут отражать активацию макрофагов при COVID-19.49, 54

И наоборот, НЭ и НЭО также могут играть роль в активации макрофагов и обработке провоспалительных цитокинов. Фрагменты ДНК циркулирующего хроматина (графический реферат).55–58 Следует отметить, что мышиная модель Dnase1–/– Dnase1 l3–/–, подвергшаяся воздействию патогенов, вызывает поражения легких, подобные тем, которые наблюдаются у пациентов с респираторным дистресс-синдромом и/или сепсисом и аутопсией Пациенты с COVID-19.40,59 В недавнем исследовании постоянно сообщалось о снижении активности ДНКазы I при бактериальной и вирусной пневмонии у детей.60.

Сыворотка пациентов с COVID-19 уменьшала удержание клеток NET и увеличивала высвобождение двухцепочечной ДНК нейтрофилов здоровых доноров. Аналогичные результаты были ранее получены с сывороткой COVID-19 с использованием клеточного красителя SYTOX Green для количественного определения NET.9 Эти результаты показывают, что NETosis может быть вызван эндогенными стимулами, выделяемыми в кровь поврежденными тканями, такими как DAMP, включая свободную двухцепочечную ДНК. .61 HMGB1, по-видимому, не участвует в усилении NETosis, поскольку его концентрация не увеличивалась в случаях COVID-19, как сообщалось ранее.62

Наше исследование открывает терапевтические перспективы. Чрезмерная активность NE, о которой сообщалось в нашем исследовании, предполагает оценку использования мощных ингибиторов NE нового поколения, включая лоноделестат (POL6014), альвелестат, CHF6333 и элафин, при COVID-19.8,27 Резкое снижение ДНКазы, о котором сообщалось в наше исследование также предлагает оценить использование рекомбинантной дезоксирибонуклеазы I (дорназа альфа) и/или ДНКазы 1L3.63–65. Одним из ожидаемых эффектов является высвобождение NE из деградировавших NET с увеличением свободного NE в крови и последующим повышением эффективности ингибиторов NE. 30 По этой причине мы считаем, что при лечении COVID-19 следует учитывать ассоциацию ингибиторов ДНКазы с ингибиторами NE. Другим терапевтическим вариантом, который следует рассмотреть, может быть использование ингибиторов CXCR2 для блокирования рекрутирования и активации нейтрофилов. Нарушение NE и/или высвобождение NET на ранней стадии COVID-19 может принести пользу, но также и риски, связанные со снижением врожденного иммунитета хозяина. Напротив, мы предполагаем, что эта стратегия может уменьшить системные проявления COVID-19 в пострепликационной фазе заболевания.

Наше исследование имело ограничения. Мы не могли систематически сообщать обо всех биомаркерах у всех пациентов. Набор и перекрестная оценка не позволили нам изучить кинетику НЭ и НЭО при последующем наблюдении пациентов. Тем не менее, мы смогли сравнить концентрацию НЭ и НЭО у амбулаторных пациентов с симптомами, набранных в течение первой недели COVID-19, и у пациентов, госпитализированных в течение второй-четвертой недели заболевания. Многоцентровый набор в местных больницах и региональных университетских больницах был сильной стороной нашего исследования для оценки случаев с противоположной тяжестью заболевания. Исчерпывающая запись клинических данных позволила нам провести многофакторный анализ связи НЭ и НЭО с тяжестью и полиорганным поражением COVID-19 после принудительной корректировки на историю болезни.

В заключение, наше исследование указывает на резкое увеличение НЭ, активности ДНКазы и НЭО во время первой фазы COVID-19 и их ключевую роль в тяжести острого респираторного дистресс-синдрома и сердечно-сосудистых, почечных и системных воспалительных заболеваний. проявления на поздних стадиях заболевания. Они предлагают оценить НЭ, ДНКазу 1 и НЭО в качестве потенциальных терапевтических мишеней.

БЛАГОДАРНОСТИ

Исследование NICO было зарегистрировано Институциональным наблюдательным советом по клиническим исследованиям (DRCI) Университетской больницы Нанси (№ 2020PI087) и одобрено Этическим комитетом Университетской больницы Нанси. Авторы не заявляли о конфликте интересов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Ни у одного из авторов не было никаких финансовых отношений с самим собой и их ближайшими родственниками/значимыми другими людьми.

АВТОРСКИЙ ВКЛАД

JL Guéant имел полный доступ ко всем данным, руководил исследованием и брал на себя ответственность за целостность и точность анализа данных. JL Guéant и V Regnault задумали и разработали исследование. JL Guéant, V Regnault, RM Guéant-Rodriguez, A Oussalah и P Lacolley получили данные, проанализировали данные или интерпретировали данные. JL Guéant принимал участие в основном составлении рукописи. V Regnault, RM Guéant-Rodriguez и A Oussalah участвовали в частичном проектировании конкретных частей. Все авторы критически пересмотрели рукопись. RM Guéant-Rodriguez, Julien Fromonot и A Oussalah занимаются управлением базами данных. Р. М. Геант-Родригес и А. Уссала участвовали в статистическом анализе.

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Чжоу П., Ян С.Л., Ван С.Г. и др. Вспышка пневмонии, связанная с новым коронавирусом вероятного происхождения от летучих мышей. Природа. 2020;579:270-273.

2. Грасселли Г., Зангрилло А., Занелла А. и др. Исходные характеристики и исходы у 1591 пациента, инфицированного SARS-CoV-2, госпитализированного в отделения интенсивной терапии региона Ломбардия, Италия. ДЖАМА. 2020;323(16):1574.

3. Азкур А.К., Акдис М., Азкур Д. и др. Иммунный ответ на SARS-CoV-2 и механизмы иммунопатологических изменений при COVID-19. Аллергия. 2020;75:1564-1581.

4. МакГонагл Д., Шариф К., О'Реган А., Бриджвуд С. Роль цитокинов, включая интерлейкин-6, в вызванной COVID-19- пневмонии и синдроме активации макрофагов. Аутоиммунная версия, 2020; 19:102537.

5. Мо П., Син Ю, Сяо Ю и др. Клинические характеристики рефрактерной пневмонии к COVID-19 в Ухане, Китай. Клин Инфекция Дис. 2020: ciaa270. [Epub перед печатью]. https://doi.org/10.1093/cid/ciaa270

6. Папаяннопулос В. Нейтрофильные внеклеточные ловушки в иммунитете и патологии. Нат Рев Иммунол. 2018;18:134-147.

7. Лагунас-Рангел Ф.А. Соотношение нейтрофилов к лимфоцитам и отношение лимфоцитов к С-реактивному белку у пациентов с тяжелой коронавирусной болезнью 2019 (COVID-19): метаанализ. J Med Virol. 2020;92(10):1733-1734.

8. Барнс Б.Дж., Адровер Дж.М., Бакстер-Штольцфус А. и соавт. Ориентация на потенциальные движущие силы COVID-19: нейтрофильные внеклеточные ловушки. J Эксперт Мед. 2020;217:e20200652.

9. Zuo Y, Yalavarthi S, Shi H, et al. Нейтрофильные внеклеточные ловушки при COVID-19. JCI. Понимание. 2020;5:e138999.

10. Gueant JL, Fromonot J, Gueant-Rodriguez RM, Lacolley P, Guieu R, Regnault V. Миелопероксидаза-ДНК крови, биомаркер раннего ответа на инфекцию SARS-CoV-2? Аллергия. 2020. [Epub перед печатью]. https://doi.org/10.1111/all.14533

11. Кортьенс Б., де Бур О.Дж., де Йонг Р. и др. Нейтрофильные внеклеточные ловушки вызывают обструкцию дыхательных путей при респираторно-синцитиальном вирусном заболевании. Джей Патол. 2016;238:401-411. 12. Твадделл С.Х., Бейнс К.Дж., Грейндж С., Гибсон П.Г. Новая роль нейтрофильных внеклеточных ловушек в респираторных заболеваниях. Грудь. 2019;156:774-782.

13. Ли К., Фанг Ю., Ли В. и др. Визуальная количественная оценка изображений КТ и клиническая классификация коронавирусного заболевания (COVID-19). Евро Радиол. 2020;30:4407-4416.

14. Попович Б., Заннад Ф., Луи Х. и др. Эндотелиальное увеличение образования тромбина в плазме, характеризующее новый фенотип гиперкоагуляции при острой сердечной недостаточности. Int J Кардиол. 2019;274:195-201.

15. Уддин М., Ватц Х., Мальмгрен А., Педерсен Ф. НЕТопатическое воспаление при хронической обструктивной болезни легких и тяжелой астме. Фронт Иммунол. 2019;10:47.

16. Didangelos A. Гипервоспаление COVID-19: как насчет нейтрофилов? мсфера. 2020;5:e00367-e00420.

17. Делонг Э.Р., Делонг Д.М., Кларк-Пирсон Д.Л. Сравнение площадей под двумя или более коррелированными кривыми рабочих характеристик приемника: непараметрический подход. Биометрия. 1988;44:837-845. 18. Эфрон Б., Тибхирани Р.Дж. Введение в бутстрап. КПР пресс 1994.

19. Нагелькерке, Нью-Джерси. Примечание к общему определению коэффициента детерминации. Биометрика. 1991;78:691-692.

20. Фуншал Г.А., Ягер Н., Чепелевски Р.С. и соавт. Слитый белок респираторно-синцитиального вируса способствует TLR-4-зависимому образованию нейтрофильных внеклеточных ловушек нейтрофилами человека. ПЛОС Один. 2015;10:e0124082.

21. Pillai PS, Molony RD, Martinod K, et al. Mx1 выявляет врожденные пути к устойчивости к противовирусным препаратам и смертельному заболеванию гриппом. Наука. 2016;352:463-466.

22. Bendib I, de Chaisemartin L, Mekontso Dessap A, Chollet-Martin S, de Prost N. Понимание роли нейтрофильных внеклеточных ловушек у пациентов с тяжелой пневмонией и ОРДС. Грудь. 2019;156:1278-1280.

23. Грейнджер В., Фей Д., Марани В. и др. Моноциты крови человека могут образовывать внеклеточные ловушки. J Leukoc Biol 2017;102:775-781.

24. Кеттриц Р. Нейтральные сериновые протеазы нейтрофилов. Immunol Rev. 2016; 273:232-248.

25. Lengas A, Poletti V, Pacifico L, di Domizio C, Patelli M, Spiga L. Острое воспаление легких: эластаза нейтрофилов по сравнению с нейтрофилами в бронхоальвеолярном лаваже — эластаза нейтрофилов лучше отражает интенсивность воспаления. Интенсивная терапия Мед. 1994;20:354-359.

26. Polverino E, Rosales-Mayor E, Dale GE, Dembowsky K, Torres A. Роль ингибиторов нейтрофильной эластазы в заболеваниях легких. Грудь. 2017;152:249-262.

27. Коркмаз Б., Моро Т., Готье Ф. Нейтрофильная эластаза, протеиназа 3 и катепсин G: физико-химические свойства, активность и физиопатологические функции. Биохимия. 2008;90:227-242.

28. Faurschou M, Borregaard N. Нейтрофильные гранулы и секреторные пузырьки при воспалении. микробы заражают. 2003;5:1317-1327.

29. Папаяннопулос В., Метцлер К.Д., Хакким А., Зыхлинский А. Нейтрофильная эластаза и миелопероксидаза регулируют образование нейтрофильных внеклеточных ловушек. Джей Селл Биол. 2010;191:677-691.

30. Kolaczkowska E, Jenne CN, Surewaard BGJ, et al. Молекулярные механизмы образования и деградации NET, выявленные с помощью прижизненной визуализации в сосудистой сети печени. Нац коммун. 2015;6:6673.

31. Тейлор С., Дирир О., Заманян Р.Т., Рабинович М., Томпсон А.АР. Роль нейтрофилов и нейтрофильной эластазы в легочной артериальной гипертензии. Front Med (Лозанна). 2018;5:217.

32. Наказава Д., Маршнер Дж. А., Платен Л., Андерс Х. Дж. Внеклеточные ловушки при заболеваниях почек. почки инт. 2018;94:1087-1098.

33. Doring Y, Libby P, Soehnlein O. Нейтрофильные внеклеточные ловушки участвуют в сердечно-сосудистых заболеваниях: последние экспериментальные и клинические данные. Цирк рез. 2020;126:1228-1241.

34. Бронз-да-Роча Э., Сантос-Сильва А. Ингибиторы нейтрофильной эластазы и хроническое заболевание почек. Int J Biol Sci. 2018;14:1343-1360.

35. Алам С.Р., Ньюби Д.Е., Хенриксен П.А. Роль эндогенного ингибитора эластазы элафина в сердечно-сосудистых повреждениях: от эпителия к эндотелию. Биохим Фармакол. 2012;83:695-704.

36. Клэнси Д.М., Генри К.М., Салливан Г.П., Мартин С.Дж. Нейтрофильные внеклеточные ловушки могут служить платформами для процессинга и активации цитокинов семейства IL-1. FEBS J. 2017; 284: 1712-1725.

37. Alfaidi M, Wilson H, Daigneault M, et al. Эластаза нейтрофилов способствует секреции интерлейкина-1бета эндотелием коронарных артерий человека. Дж. Биол. Хим. 2015;290:24067-24078.

38. Korkmaz B, Horwitz MS, Jenne DE, Gauthier F. Нейтрофильная эластаза, протеиназа 3 и катепсин G как терапевтические мишени при заболеваниях человека. Pharmacol Rev. 2010;62:726-759.

39. Акерманн М., Верледен С.Е., Кюнель М. и соавт. Легочный сосудистый эндотелиит, тромбоз и ангиогенез при Covid-19. N Engl J Med. 2020;383:120-128.

40. Бикдели Б., Мадхаван М.В., Хименес Д. и соавт. COVID-19 и тромботические или тромбоэмболические заболевания: последствия для профилактики, антитромботической терапии и последующего наблюдения: обзор JACC. J Am Coll Кардиол. 2020;75:2950-2973.

41. Дриггин Э., Мадхаван М.В., Бикдели Б. и др. Вопросы сердечно-сосудистой системы для пациентов, медицинских работников и систем здравоохранения во время пандемии COVID-19. J Am Coll Кардиол. 2020;75:2352-2371.

42. Бабапур-Фаррокран С., Гилл Д., Уокер Дж., Расехи Р.Т., Бозорния Б., Аманулла А. Повреждение миокарда и COVID-19: возможные механизмы. Жизнь наук. 2020;253:117723. 43. Doyen D, Moceri P, Ducreux D, Dellamonica J. Миокардит у пациента с COVID-19: причина повышения тропонина и изменений на ЭКГ. Ланцет. 2020;395:1516.

44. Рену К., Прасанна П.Л., Валсала Г.А. Патогенез коронавируса, сопутствующие заболевания и полиорганное поражение — обзор. Жизнь наук. 2020;255:117839. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2020.117839

45. Либби П. Сердце при COVID-19: основная цель или второстепенный наблюдатель? JACC Basic Transl Sci. 2020;5(5):537-542.

46. ​​Cheng Y, Luo R, Wang K, et al. Заболевание почек связано с внутрибольничной смертью пациентов с COVID-19. Почки Интернэшнл. 2020. 97:829-838.

47. Уссала А., Глей С., Клерк Урмес И. и др. Длительное применение ингибиторов АПФ/БРА связано с тяжелой почечной дисфункцией и острым повреждением почек у пациентов с тяжелой формой COVID-19: результаты когорты специализированных центров на северо-востоке Франции. Клин Инфекция Дис. 2020;71(9):2447-2456.

48. Cheng Y, Luo R, Wang K, et al. Заболевание почек связано с внутрибольничной смертью пациентов с COVID-19. почки инт. 2020;97:829-838.

49. Лю Т., Чжан Дж., Ян Ю и др. Роль интерлейкина-6 в мониторинге тяжелых случаев коронавирусной болезни 2019 г. EMBO Mol Med. 2020;12:e12421.

50. Del Valle DM, Kim-Schulze S, Hsin-Hui H, et al. Сигнатура воспалительных цитокинов помогает предсказать тяжесть течения COVID-19 и смерть. Нат Мед. 2020;26:1636-1643.

51. Гао Ю.Д., Дин М., Донг Х и др. Факторы риска для тяжелых и критически больных пациентов с COVID-19: обзор. Аллергия. 2020; https://дои. орг/10.1111/все.14657.

52. Акбари Х., Табризи Р., Ланкарани К.Б. и др. Роль цитокинового профиля и субпопуляций лимфоцитов в тяжести коронавирусной болезни 2019 г. (COVID-19): систематический обзор и метаанализ. Жизнь наук. 2020;258:118167.

53. Рощевски М., Лионакис М.С., Шарман Дж. П. и соавт. Ингибирование тирозинкиназы Брутона у пациентов с тяжелой формой COVID-19. Научный Иммунол. 2020;5(48):eabd0110.

54. Колафранческо С., Алессандри С., Конти Ф., Приори Р. COVID-19 ухудшился: новый характер в спектре синдрома гиперферритинемии? Аутоиммунная версия, 2020; 19:102573.

55. Takeshita H, Yasuda T, Nakajima T, Hosomi O, Nakashima Y, Kishi K. Мышиная дезоксирибонуклеаза I (DNase I): биохимическая и иммунологическая характеристика, структура кДНК и распределение в тканях. Биохим Мол Биол Инт. 1997;42:65-75.

56. Уэки М., Такешита Х., Фуджихара Дж. и др. Кавказский специфический аллель в несинонимичных однонуклеотидных полиморфизмах гена, кодирующего дезоксирибонуклеазу I-подобный 3, потенциально связанный с аутоиммунитетом, продуцирует неактивный фермент. Клин Чим Акта. 2009;407:20-24.

57. Уэки М., Кимура-Катаока К., Такешита Х. и др. Оценка всех несинонимичных однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в генах, кодирующих человеческую дезоксирибонуклеазу I и I-подобную 3, как функционального SNP, потенциально вовлеченного в аутоиммунитет. Журнал ФЭБС. 2014;281:376-390.

58. Кейель П.А. ДНК в норме и болезни. Дев биол. 2017;429:1-11.

59. Хименес-Алькасар М., Рангасвами С., Панда Р. и др. ДНКазы-хозяева предотвращают окклюзию сосудов нейтрофильными внеклеточными ловушками. Наука. 2017;358:1202-1206.

60. Чен Д., Ян С.Л., Шен З.Б. и др. Значение нейтрофильной внеклеточной ловушки и ее маркеров в ранней диагностике внебольничной пневмонии у детей. Чжунго Данг Дай Эр Ке За Чжи. 2019;21:868-875.

61. Деннинг Н.Л., Азиз М., Гуриен С.Д., Ван П. DAMP и сети при сепсисе. Фронт Иммунол. 2019;10:2536.

62. Chen L, Long X, Xu Q и др. Повышенные уровни S100A8/A9 и HMGB1 в сыворотке при поступлении в больницу коррелируют с худшими клиническими исходами у пациентов с COVID-19. Селл Мол Иммунол. 2020;17:992-994.

63. Зиттер Дж. Н., Малджян П., Бримакомб М., Феннелли К.П. Ингаляционная дорназа альфа (пульмозим) как неинвазивный метод лечения ателектазов у ​​пациентов на ИВЛ. J Крит Уход. 2013;28(218):e1-e7.

64. Pottecher J, Noll E, Borel M, et al. Протокол для ТРАУМАДОРНАЗЫ: проспективное, рандомизированное, многоцентровое, двойное слепое, плацебо-контролируемое клиническое исследование аэрозольной дорназы альфа для снижения частоты гипоксемии от умеренной до тяжелой у пациентов с травмами на ИВЛ. Испытания. 2020;21:274.

65. Fuchs TA, Jimenez-Alcazar M, Göbel J, Englert H. Engineered ферменты ДНКазы и использование в терапии. 2019.

ВСПОМОГАТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Дополнительную вспомогательную информацию можно найти в Интернете в разделе «Вспомогательная информация».

Для получения дополнительной информации: 1950477648@nn.gmail.com