Эстрогенная активность гликозидов Cistanche Deserticola в качестве адъюванта эстрогеновых рецепторов in vitro

ВВЕДЕНИЕ

Цистанхе пустынная(«Роу Конг Ронг» по-китайски), традиционное китайское лекарственное растение, впервые зарегистрированное вШэньНонгБэньЦаоЦзин, использовался для лечения почечной недостаточности, импотенции, старческих запоров и дефицита крови на протяжении тысячелетий.[1] Он в основном распространен в пустынных регионах Северо-Западного Китая, таких как Ганьсу и Синьцзян..[2]Современные фармакологические исследования показали, что C. Deserticola может выполнять широкие лечебные функции, такие как гормональная регуляция, иммуномодулирование, антиоксидантное, нейропротекторное, противовоспалительное и противовоспалительное действие.эстрогенная активность.[3,4] Гликозиды цистанхов(ГК) рассматривались как одни из основных активных компонентов, обладающих разнообразным биологическим действием.

Рецепторы эстрогена (ER) и ER представляют собой подтипы ER, которые могут регулировать физиологические функции. Эти белки могут регулировать транскрипцию генов-мишеней путем связывания со связанными регуляторными последовательностями ДНК в ядре клетки. Оба подтипа заметно экспрессируются в сердечно-сосудистой и центральной нервной системах. [8,9] ЭР существует главным образом в молочной железе, матке, яичниках, костях, мужских репродуктивных органах и предстательной железе. ЭР присутствует в основном в предстательной железе, яичниках и мочевом пузыре. [10,11] Более того, существуют некоторые общие физиологические роли для этих двух подтипов, например, в развитии и функционировании яичников и защите сердечно-сосудистой системы. 12,13] Предыдущие исследования нашей группы выявили эстрогеноподобный механизм действия ГК методом метаболомного анализа.[14] В непрерывном исследовании мы проанализировали механизм эстрогенной активности ГК на клеточных линиях MCF-7, родственных ЭР.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША TUBULOSA ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯЭСТРОГЕННАЯ АКТИВНОСТЬPHGS75% ЭХ 30% АКТ 12%

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Инструменты

Инкубатор ECO-170P-230 был произведен компанией New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., считыватель микропланшетов Bio-Rad 680 и аппарат для электрофореза были произведены компанией Bio-Rad Laboratories, Inc., микроскоп CX21 был произведен компанией Olympus Co., Ltd., Система визуализации геля GIS-2019 была от Tanon Science and Technology Co., Ltd., планшет с плоским дном - от Corning Inc., проточная цитометрия EPICS-XL - от Beckman-Coulter Inc., а полимеразная цепная реакция StepOnePlus в реальном времени ( ПЦР) была от Thermo Fisher Scientific.

Химикаты и реагенты

GC были приготовлены в нашей лаборатории по ранее описанному методу [14], и чистота GC была определена как 52% (актеозид использовался в качестве маркера для определения GC) с помощью ультрафиолетовой спектрофотометрии. Эстрадиол (Е2) был приобретен у Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Фетальная бычья сыворотка (FBS) и RPMI-1640 были от Gibco Co., Ltd., 96-луночный планшет с плоским дном от Corning Inc., а диметилсульфоксид (ДМСО) и 3-[4,5-диметил-2-тиазолил ]-2,5-дифенилтетразолия бромид (МТТ) был приобретен у Sigma-Aldrich Corporation. Реагент TRIzol, набор для обратной транскрипции (RT) и набор TB Green™ RT‑PCR были приобретены у TaKaRa Co., Ltd., Далянь, Китай. pAb кролика против ER, pAb кролика против ER и антитела к актину были приобретены у Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Все остальные распространенные химические вещества были приобретены у стандартных коммерческих поставщиков.

Базовые приготовления

Приготовление исходного раствора гликозидов Цистанчи.

Экстракт GC растворяли в ДМСО для получения исходного раствора с концентрацией 0,1051 г/мл и хранили при температуре 4 градуса. RPMI-1640, не содержащий фенолового красного, использовался для разбавления исходного раствора до различных концентраций перед использованием.

Приготовление маточного раствора эстрадиола

Экстракт E2 растворяли в ДМСО для получения исходного раствора с концентрацией 0,27 мг/мл и хранили при температуре 4 градуса. RPMI-1640, не содержащий фенолового красного, использовался для разбавления исходного раствора до различных концентраций перед использованием.

Получение фетальной бычьей сыворотки, обработанной активированным углем и декстраном

Сто миллилитров FBS смешивали с 250 мг порошка активированного угля и 25 мг декстрана. После инкубации в течение 45 минут при 55 градусах смесь центрифугировали при 4 градусах, 1000 об/мин в течение 15 минут. Супернатант фильтровали с использованием мембраны Millipore Express PES для получения обработанного активированным углем декстрана (CDT)-FBS и хранили при -20 градусах Цельсия.

Культура клеток

Клеточные линии рака молочной железы человека MCF‑7 были получены из Американской коллекции типовых культур (ATCC). Кроме того, клетки культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин, при 37 градусах в увлажненной атмосфере с содержанием CO2 5%. Клетки культивировали в среде RPMI-1640, не содержащей фенолового красного, содержащей 5% CDT-FBS, за 4 дня до анализа МТТ, чтобы можно было очистить клетки от эстрогена.

Анализ клеточной пролиферации эстрадиола на клеточных линиях MCF-7

Пролиферацию клеток измеряли с помощью МТТ-анализа для клеток MCF-7. [15,16] E2 растворяли в культуральной среде RPMI-1640, содержащей 0,1% ДМСО в конечных концентрациях {{27). }}.1, 1, 10, 100 и 1000 нМ. Клеточные линии MCF-7 культивировали в среде RPMI-1640, не содержащей фенолового красного, в течение 4 дней. После трехкратной промывки фосфатно-солевым буфером (PBS) 100 мкл среды RPMI-1640 без FBS добавляли в 96-луночные планшеты из расчета 1,5 × 104 на лунку и инкубировали при 37 градусах в течение 24 часов. Затем клетки обрабатывали раствором Е2 различных концентраций в течение 72 часов. Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора МТТ (0,5 мг/мл). Клетки инкубировали в течение 4 часов. Наконец, добавляли 150 мкл ДМСО для растворения кристаллов формазана. Поглощение измеряли при 570 нм с помощью микропланшет-ридера и рассчитывали скорость пролиферации (PR).

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША TUBULOSA ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ПОЛОВОЙ ФУНКЦИИ PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Анализ клеточной пролиферации гликозидов цистанхов на клеточных линиях MCF-7

Пролиферацию клеток измеряли с помощью анализа МТТ для клеток MCF-7. ГХ растворяли в культуральной среде RPMI-1640, содержащей 0,1% ДМСО в конечных концентрациях 0.0175, 0,175, 1,75, 17,5 и 175 мкг. /мл. Клеточные линии MCF-7 культивировали в среде RPMI-1640, не содержащей фенолового красного, содержащей 5% CDT-FBS, в течение 4 дней. После трехкратной промывки PBS 100 мкл среды RPMI-1640 без FBS добавляли в 96-луночные планшеты из расчета 1,5 × 104 на лунку и инкубировали при 37 градусах в течение 24 часов. Далее клетки обрабатывали раствором ГЦ различной концентрации в течение 24, 48 и 72 ч соответственно. Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора МТТ (0,5 мг/мл). Клетки инкубировали в течение 4 часов. Наконец, добавляли 150 мкл ДМСО для растворения кристаллов формазана. Поглощение измеряли при 570 нм с помощью микропланшет-ридера и рассчитывали PR. RPMI-1640 без фенолового красного и среда, содержащая E2 (2,725 × 10-3 мкг/мл), представляли собой отрицательную и положительную группы соответственно.

Анализ клеточной пролиферации гликозидов цистанхов с фулвестрантом на клеточных линиях MCF-7

Пролиферацию клеток измеряли с помощью анализа МТТ для клеток MCF-7. ГХ растворяли в культуральной среде RPMI-1640, содержащей 0,1% ДМСО, в конечных концентрациях 1,75, 17,5 и 175 мкг/мл. Клеточные линии MCF-7 культивировали в среде RPMI-1640, не содержащей фенолового красного, содержащей 5% CDT-FBS, в течение 4 дней. После трехкратной промывки PBS 100 мкл среды RPMI-1640 без FBS добавляли в 96-луночные планшеты из расчета 1,5 × 104 на лунку и инкубировали при 37 градусах в течение 24 часов. Затем клетки обрабатывали раствором ГЦ различных концентраций и инкубировали с фулвестрантом (6,06 × 10–5 мкг/мл) в течение 48 ч. Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора МТТ (0,5 мг/мл). Клетки инкубировали в течение 4 часов. Наконец, добавляли 150 мкл ДМСО для растворения кристаллов формазана. Поглощение измеряли при 570 нм с помощью микропланшет-ридера и рассчитывали PR. RPMI-1640 без фенолового красного и среда, содержащая E2 (2,725 × 10-3 мкг/мл), представляли собой отрицательную и положительную группы соответственно.

Анализ клеточного цикла

ГХ растворяли в культуральной среде RPMI-1640, содержащей 0,1% ДМСО, в конечных концентрациях 1,75, 17,5 и 175 мкг/мл. Клеточные линии MCF-7 культивировали в среде RPMI-1640, не содержащей фенолового красного, содержащей 5% CDT-FBS, в течение 4 дней. После трехкратной промывки PBS 1 мл среды RPMI-1640 без FBS добавляли в 6-луночные планшеты из расчета 2,5 × 105 на лунку и инкубировали при 37 градусах в течение 24 часов. Затем клетки обрабатывали раствором ГЦ различных концентраций и инкубировали с фулвестрантом (6,06 × 10–5 мкг/мл) в течение 48 ч. Затем клетки собирали и трижды промывали PBS, центрифугировали при 4 градусах, 1000 об/мин в течение 10 минут и фиксировали 70% этанолом при -20 градусах в течение ночи. После двукратной промывки PBS клетки окрашивали раствором ПИ (50 мг/мл), содержащим 1 мг/мл РНКазы А и 0,1% тритона Х‑100, в течение 30 мин в темноте при 4 градусах. Клеточный цикл детектировали с помощью проточной цитометрии, а индекс пролиферации (PI) рассчитывали следующим образом. RPMI-1640 без фенолового красного и среда, содержащая E2 (2,725 × 10-3 мкг/мл), представляли собой отрицательную и положительную группы соответственно.

ПИ {{0}} (S + G2 M)/(G0 /G1  + S + G2 M) × 100%

Выделение РНК и количественный анализ полимеразной цепной реакции в реальном времени

Для измерения уровня мРНК использовали RT-количественный ПЦР (кПЦР). Тотальную клеточную РНК экстрагировали реагентом TRIzol. Для кПЦР РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК из 4 мкг тотальной РНК с использованием набора для RT. Анализы RT‑PCR проводились с использованием набора TB Green™ RT‑PCR Kit. Все протоколы выполнялись в соответствии с инструкциями производителя. Пара праймеров, использованная для амплификации ER, представляла собой 5'-GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG-3' (прямой) и 5'-TGGCTGGACACATAGTCGTT-3' (обратный); пара праймеров, использованная для амплификации ER, представляла собой 5'-AGTGCCGCTCTTGGAGAGCTG-3' (прямой) и 5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (обратный). Условия ПЦР для ER и ER составляли 94 градуса в течение 3 минут с последующими 37 и 40 циклами соответственно: 94 градуса в течение 30 секунд, 58 градусов в течение 2 минут и 72 градуса в течение 2 минут. Пара праймеров, использованная для амплификации GAPDH, представляла собой 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' (прямой) и 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (обратный). Условия ПЦР для GAPDH составляли 94 градуса в течение 3 минут с последующими 30 циклами по 94 градуса в течение 30 с, 58 градусов в течение 2 минут и 72 градуса в течение 2 минут. Каждый раз эксперимент RT‑qPCR повторялся более двух раз. Для этого в качестве внутреннего контроля использовали GAPDH. Рассчитывали относительную экспрессию генов ЭР/ЭР трансфектантов относительно контрольных клеток: 2-(∆∆Ct).

Вестерн-блоттинг

Экспрессию белков ER и ER определяли с помощью вестерн-блот-анализа в соответствии с описанным методом с небольшими модификациями. Вкратце, клетки MCF-7 выращивали в 6-луночных планшетах по 2,5 × 105 клеток на лунку и обрабатывали GC в конечной концентрации 1,75, 17,5 и 175 мкг/мл в течение 48 часов соответственно. После инкубации экстракты цельных клеток готовили с использованием буфера RIPA, содержащего 1 мМ PMSF. Белки в экстрактах цельных клеток разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле с 12% додецилсульфатом натрия, а затем переносили на мембраны из поливинилидендифторида. Мембрану блокировали 5% (мас./об.) обезжиренным молоком, растворенным в буфере TBST, и инкубировали поочередно с первичными и вторичными антителами. Связанные антитела наблюдались.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША TUBULOSA ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯЭСТРОГЕННАЯ АКТИВНОСТЬPHGS75% ЭХ 30% АКТ 12%

статистический анализ

Результаты выражали в виде средних значений и стандартных отклонений, а статистическую значимость определяли с использованием t-критерия Стьюдента с программным обеспечением SPSS 21.0 (IBM Co., Ltd. America). п<0.05 was considered statistically significant. 

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

После 24 часов обработки E2 пролиферация клеток MCF-7 усиливалась (рис. 1а). Очевидно, что 10 нМ раствора Е2 могли стимулировать рост клеток (123,89%). Однако с увеличением концентрации Е2 способность клеток к пролиферации ослабевала. Следовательно, 10 нМ была оптимальной концентрацией E2 в этом эксперименте. Группа ГК в концентрациях 1,75, 17,5 и 175 мкг/мг могла усиливать пролиферацию клеточных линий MCF-7 в зависимости от времени и дозировки и демонстрировала значительную разницу с отрицательной группой (рис. 1b). По сравнению с отрицательной группой, группа E2 демонстрировала очевидную пролиферацию (120,06%). Комбинированную группу препаратов (КМГ) (фулвестрант с Е2 или ГК) в среде CDT-FBS инкубировали с клетками MCF-4. Через 72 часа

инкубации CMG может привести к наклону PR по сравнению с группой индивидуального лечения (IMG) (P< 0.01) [Figure 1c]. Flow cytometry analysis showed that GCs could slightly increase the PI value suggesting that GCs could advance G0/G1 phase cells to S and G2/M phase [Figure 2 and Table 1] and promote cell DNA synthesis. The result indicated that the mechanism of GCs on MCF‑7 was similar to that of E2. In CMG  (fulvestrant with GCs), the PI value of cell PI declined to that of IMG slightly (P < 0.05). RT‑PCR analysis indicated that the expressions of ERα and ERβ mRNA were increased compared with the control group  (P  <  0.01) in a dose‑dependent manner after being treated with different concentrations of GCs for 48 h [Figure 3a and b]. Western blot result indicating that after treatment with various concentrations of GCs for 48  h, contents of ERα and ERβ proteins in MCF‑7 increase with the GCs increased in a dosage‑dependent manner [Figure 3c‑e]. 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данном исследовании влияние ГК на пролиферацию и клеточный цикл MCF-7 оценивали методом МТТ и проточной цитометрии соответственно.ГК могут увеличить пролиферацию клеток MCF-7в концентрации 1,75, 17,5 и 175 мкг/мл после инкубации в течение 72 ч. Однако увеличение имеет тенденцию замедляться при совместном применении СС и фулвестранта. GC могли увеличивать значение PI клеток MCF‑7, уменьшать ячейки фазы G1 и увеличивать клетки фаз S и G2.

Фулвестрант является специфичным для ЭР антагонистом, который блокирует ядерную локализацию ЭР, нарушая димеризацию рецептора и энергозависимый ядерный транспорт.[17] В этом исследовании был сделан вывод, что фулвестрант может ослабить пролиферацию GC на клетках MCF-7 и повлиять на трансформацию клеточного цикла. Таким образом, это исследование показало эстрогенную активность ГК, а также то, что ЭР является

цель GC. В эксперименте RT-PCR и вестерн-блоттинга экспрессия мРНК и белков ER и ER в клетках MCF-7 увеличивалась с увеличением концентрации GC. Следовательно,ГК могут играть роль в эстрогенной активностив соответствии с активированной мРНК и белками ER и ER.

НАТУРАЛЬНАЯ ЦИСТАНША TUBULOSA ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯЭСТРОГЕННАЯ АКТИВНОСТЬPHGS75% ЭХ 30% АКТ 12%