Экстравирусная ДНК в препаратах аденоассоциированных вирусных векторов индуцирует TLR9-зависимые врожденные иммунные ответы в плазмацитоидных дендритных клетках человека

Суспензии векторов аденоассоциированного вируса (AAV), полученные либо из клеток HEK человеческого происхождения, либо из клеток насекомых Spodoptera frugiperda (Sf9), различаются с точки зрения остаточных компонентов клеток-хозяев, а также видоспецифичных посттрансляционных модификаций, проявляющихся на капсидных белках AAV. . Здесь мы проанализировали влияние этих различий на иммуногенные свойства вектора. Мы стимулировали плазмоцитоидные дендритные клетки человека различными партиями векторов AAVCMV-eGFP, продуцируемых клетками HEK и клетками Sf9, полученных от разных производителей. Мы обнаружили, что векторы AAV8-CMV-eGFP, а также AAV2-CMV-eGFP индуцируют воспалительные цитокиновые реакции, специфичные для партии, но не специфичные для производственной платформы или производителя. Их можно уменьшить или устранить путем блокирования передачи сигналов toll-подобного рецептора 9 или путем ферментативного восстановления ДНК в партиях векторов с использованием ДНКазы. Успешная трансдукция клеток HEK с помощью партий AAV, обработанных ДНКазой, и анализ ДНК продемонстрировали, что ДНКаза не влияла на целостность вектора, но разрушала вневирусную ДНК. Мы пришли к выводу, что препараты AAV, полученные из клеток HEK и Sf9-, могут содержать иммуногенные компоненты вневирусной ДНК, которые могут вызывать специфичные для партии воспалительные иммунные реакции. Это говорит о том, что улучшенные стратегии удаления примесей вневирусной ДНК могут сыграть важную роль в снижении иммуногенных свойств препаратов вектора AAV.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Последнее десятилетие стало свидетелем огромного интереса к разработке новых стратегий на основе рекомбинантных аденоассоциированных вирусов (ААВ) как для фундаментальных исследований, так и для клинических применений1-3. Основная причина заключается в том, что векторы AAV являются чрезвычайно универсальными инструментами в области генной терапии, учитывая их способность эффективно и безопасно доставлять терапевтические гены в ткани-мишени4. Однако все большее число исследователей независимо сообщают о результатах, указывающих на местные и системные иммунные реакции после введения AAV в доклинических и клинических исследованиях5-8.

Было показано, что векторы AAV активируют рецепторы распознавания врожденных иммунных образов, такие как toll-подобный рецептор (TLR)2 и TLR9, что приводит к высвобождению воспалительных цитокинов и интерферонов I типа (IFN)9,10. Иммуногенные компоненты AAV, которые могут стимулировать эти реакции, включают капсидные белки и векторный геном9,10. Иммунные реакции после применения AAV также могут быть вызваны примесями в суспензии вектора5,11. Эти примеси определяются как любой компонент, присутствующий в очищенной суспензии вектора AAV, кроме желаемого продукта12, и являющийся результатом процесса производства вектора. Два основных метода получения клинических рекомбинантных векторов AAV включают трансфекцию плазмидной ДНК в клетки HEK и инфицирование клеток насекомых Spodoptera frugiperda (Sf9) баколювирусом13. Соответственно, потенциально иммуногенные примеси, содержащиеся в суспензиях векторов AAV, могут включать эндотоксины, компоненты среды для культивирования клеток, реагенты, которые используются для очистки AAV, белки и ДНК, полученные из клеток-хозяев, а также остаточную бакуловирусную ДНК или плазмидную ДНК5. Дополнительными факторами, которые могут влиять на иммуногенность суспензий векторов AAV, являются посттрансляционные модификации (ПТМ), импринтированные на капсиде различными платформами для производства векторов5. Важно отметить, что векторы AAV, полученные из клеток HEK и клеток Sf9, сильно различаются с точки зрения их PTM, остаточных белковых примесей клеток-хозяев11 и, возможно, также по примесям их ДНК (ДНК клеток HEK по сравнению с ДНК клеток Sf9, а также остаточной плазмидной ДНК). по сравнению с бакуловирусной ДНК)14. Плазмоцитоидные дендритные клетки (pCD) представляют собой специализированный тип клеток врожденного иммунитета, который секретирует большие количества IFN типа I и провоспалительных цитокинов при вирусных инфекциях9,15 и играет важную роль в распознавании векторов AAV9. Соответственно, чтобы проанализировать, приводят ли различия между векторами AAV, продуцируемыми клетками HEK и клетками Sf9-, к различиям в их иммуногенных свойствах, мы стимулировали пДК человека разными партиями одного и того же вектора AAV, полученного из двух продукционных систем. и разных производителей. Мы обнаружили, что половина исследованных партий векторов вызывала специфичные для партии провоспалительные иммунные реакции, которые не были связаны ни с системой производства вектора, ни с производителем. Эти ответы были опосредованы передачей сигналов TLR9 и чувствительны к обработке партий векторов ДНКазой. Успешная трансдукция клеток HEK как необработанными, так и обработанными ДНКазой партиями векторов AAV и анализ ДНК препаратов AAV позволили предположить, что ДНКаза не влияла на целостность частиц AAV, а скорее воздействовала на неинкапсулированную экстравирусную ДНК. В совокупности это позволяет предположить, что препараты вектора AAV могут содержать неинкапсулированную вневирусную ДНК, которая может влиять на иммуногенные свойства препаратов вектора AAV в пДК человека.

Преимущества цистанхе трубчатой-укрепить иммунную систему

Полученные результаты

AAV индуцирует специфичные для партии врожденные иммунные реакции в pDC человека.

Исследования показали, что векторы AAV, полученные из клеток HEK и клеток Sf9, различаются с точки зрения их PTM и примесей, содержащихся в вирусных суспензиях11. Мы предположили, что эти факторы могут привести к различиям в иммуногенных свойствах между партиями векторов, полученных из клеток HEK и клеток Sf9. Чтобы проверить эту гипотезу, мы проанализировали в общей сложности восемь партий векторов AAV серотипа 8 (AAV8), содержащих идентичную последовательность ДНК промотора цитомегаловируса (CMV) и идентичный трансген белка усиленной зеленой флуоресценции (eGFP) (AAV8-). CMV-eGFP; пять партий HEK- и три партии клеточного происхождения Sf9) и четыре партии AAV2-CMV-eGFP (две партии HEK- и две партии клеточного происхождения Sf9) от трех разных производителей [производитель A; Viral Vector Core Facility Университета Айовы (Айова, США), производитель Б; Вировек (Калифорния, США) и производитель С; Vigene Biosciences (MD, США)]. Чтобы максимизировать сходство партий, семь партий AAV8 от производителя А и производителя B (таблица 1) были произведены с использованием одной и той же исходной плазмиды. Кроме того, была выполнена регистрация векторных геномов (vg) партий векторов AAV методом капельной цифровой ПЦР (ddPCR) при параллельном измерении с использованием двух разных мишеней: одна в последовательности CMV, а другая в последовательности eGFP. векторы. Результаты, полученные путем количественного определения мишени CMV, были использованы для титрования партий вектора AAV в следующих экспериментах (Таблица 1). pDC представляют собой специализированные вирусные сенсоры, которые массово продуцируют IFN типа I при вирусной инфекции15, включая векторы AAV9. Чтобы выяснить, различаются ли векторы AAV, продуцируемые клетками HEK и продуцируемые клетками Sf9-, по своей способности вызывать врожденные иммунные ответы в иммунокомпетентных клетках, мы стимулировали pDC человека перечисленными выше партиями векторов AAV. С этой целью пДК были очищены из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) отдельных здоровых доноров путем негативной селекции с использованием сортировки магнитно-активированных клеток (MACS). Анализ проточной цитометрии подтвердил чистоту выделенных пДК более 90% (рис. S1). Десять пДК отдельного донора засевали и стимулировали партиями векторов AAV8 и AAV2 при MOI 1:1×106 мкг/клетку в течение 18 часов. MOI 1:106 мкг/клетку, примененный в общей сложности к 12500 клеткам в 50 мкл/лунку, соответствует титру 2,5×1011 мкг/мл. Мы использовали этот титр, поскольку он находится в пределах диапазона, применяемого в исследованиях генной терапии сетчатки у людей (например, 1×1012 vg/мл16 или 4×1011–1,3×1012 vg/мл17) и приматов (например, 5×1012 vg/мл17). 1011–5 × 1012 мкг/мл6). Стимуляция транспортным средством служила контролем. Инкубация с партиями векторов AAV8 и AAV2 не приводила к какой-либо обнаруживаемой экспрессии трансгена в pDC. Однако четыре из восьми партий AAV8 (партии A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf9-1) и две из четыре партии AAV2 (партии B-Sf9-1, B-Sf9-2) индуцировали реактивную пролиферацию клеток в стимулированных пДК (рис. 1а). Это сопровождалось высвобождением провоспалительных цитокинов (IP-10, MIP-1 и TNF-) и IFN типа I (IFN-). И наоборот, оставшийся AAV8 (партии A-Sf9-1, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK{{92}) не индуцировал ни пролиферацию клеток, ни высвобождение цитокинов. }) и лоты AAV2 (лоты C-HEK-1, C-HEK-2). Эти результаты были подтверждены в трех-четырех независимых экспериментах, каждый из которых проводился с клетками одного индивидуального донора (рис. 1а-в и таблица S1). Специфические для партии различия в концентрациях цитокинов в этих независимых экспериментах были статистически проанализированы с использованием линейной модели смешанного эффекта и апостериорного критерия Даннетта (Q=2.6) путем сравнения средних значений наименьших квадратов различных партий вектора AAV с управление автомобилем (таблицы S2 и S3). Это продемонстрировало статистически значимые различия в цитокиновых ответах между партиями «иммуногенных» векторов AAV (партии AAV8 A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf{ {114}} или партии AAV2 B-Sf9-1, B-Sf9-2 соответственно) и контроль, но существенных различий между партиями "неиммуногенных" векторов AAV (партии AAV8 A-Sf{{) нет. 123}}, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK-1 или партии AAV2 C-HEK-1, C-HEK-2 соответственно) и контроль (таблица S3). Концентрации остальных измеренных цитокинов, включенных в мультиплексный анализ, либо были ниже диапазона анализа (т.е. IL-1 , IL-2, IL-4, IL-5 , IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, GM-CSF, IFN-) или ни "иммуногенные", ни партии «неиммуногенных» векторов вызывали любое значительное увеличение их высвобождения (т. е. IL-7, IL-8, G-CSF, MCP-1) (рис. S2), что позволяет предположить, что степень специфичности цитокинового ответа, опосредованного AAV. Для исследования цитокиновых ответов в более ранний момент времени пДК стимулировали «иммуногенной» партией вектора AAV8 A-HEK-1. Мы наблюдали значительное увеличение концентрации TNF- в супернатанте уже через 2 ч после стимуляции pDC. Этот образец ответа мог быть подтвержден в трех экспериментах, каждый из которых проводился с клетками одного индивидуального донора (рис. S3). Чтобы выяснить, способна ли более высокая доза «неиммуногенной» партии векторов AAV8 вызвать иммунный ответ, мы стимулировали пДК технически максимально применимым MOI (1:4,61×106 vg). Интересно, что ни реактивная пролиферация клеток, ни цитокиновые ответы не были обнаружены при стимуляции этим повышенным титром (рис. S4). Вопреки нашей гипотезе, эти результаты демонстрируют, что врожденные иммунные реакции на AAV в pDC были специфичными для партии и не были связаны с конкретной производственной системой или производителем/методом очистки.

Таблица 1. Различные партии вирусных векторов AAV8 и AAV2, использованных в этом исследовании.

Рисунок 1. Индукция специфичных для партии вектора AAV иммунных ответов в пДК человека. Человеческие пДК стимулировали различными партиями AAV8-CMV-eGFP и AAV2-CMV-eGFP (MOI: 1:1× 106 vg) в течение 18 часов (а) Репрезентативные светлопольные изображения пДК, стимулированных контроль транспортного средства (верхнее изображение) или партия иммуногенного вектора AAV (нижнее изображение). Масштабная линейка составляет 100 мкм. (б) Высвобождение цитокинов IP-10, MIP-1, TNF- и IFN- 2 AAV8-стимулированными пДК. (C) Высвобождение цитокинов AAV2-стимулированными пДК. Репрезентативные графики одного из трех-четырех независимых экспериментов. Поскольку при измерениях IFN- 2 (b,c) и TNF- (c) некоторые значения упали ниже диапазона анализа, для представления ко всем измеренным значениям IFN- 2 и TNF- была добавлена ​​константа 1. на полулогарифмическом графике. Показаны медианы и межквартильные размахи. На этикетках отдельных партий вектора три производителя обозначены буквами A, B и C; Векторы, полученные из клеток HEK, и векторы, полученные из клеток Sf9-, обозначены «HEK» и «Sf9», а соответствующие партии одного и того же производителя и одной и той же производственной системы пронумерованы «1, 2, 3». Круг: полученные из HEK. векторная партия; треугольник: векторная партия, полученная из Sf9-; черный: векторная партия от производителя A; оранжевый: векторная партия от производителя B; зеленый: векторная партия от производителя C.

На иммунный ответ на стимуляцию AAV в pDCs не влияют различия в соотношении капсид/VG.

Доклинические исследования показали, что различия в количестве полных и пустых векторных частиц в суспензиях векторов AAV могут влиять на иммунный ответ18. Чтобы оценить, обусловлены ли различия иммуногенных свойств между анализируемыми партиями вектора различиями в соотношении полных и пустых векторных частиц, во всех партиях ААВ методом титрования ААВ определяли титр капсидов вектора и рассчитывали соотношение капсид/ВГ. соотношение. Интересно, что между всеми партиями AAV были обнаружены большие различия в соотношении капсид/vg (рис. 2). Примерно в два раза больше капсидов, чем vg (2:1), было обнаружено в партиях AAV8-CMV-eGFP A-HEK-1, A-HEK-3, A-Sf{{11} } и AAV2-CMV-eGFP B-Sf9-1; и в четыре раза больше (4:1) в лоте AAV8 A-Sf9-1. В остальных лотах наблюдалось соотношение 1:1. Однако не было обнаружено существенных различий между соотношениями капсид/vg «иммуногенных» и «неиммуногенных» партий векторов AAV ни в AAV8 (P=0.27), ни в AAV2 (P=0.37). векторные лоты (рис. 2). Это позволяет предположить, что различия в иммуногенных свойствах анализируемых партий вектора AAV также не были связаны с различиями в соотношении полных и пустых векторных частиц.

Преимущества добавки цистанхе – как укрепить иммунную систему

Распознавание «иммуногенных» партий вектора AAV8 с помощью TLR9.

Было показано, что распознавание AAV врожденным иммунитетом pDC мыши и человека опосредуется ДНК-чувствительным TLR99. Соответственно, мы оценили, участвует ли TLR9 в распознавании наших «иммуногенных» партий вектора AAV8. С этой целью пДК засевали, как описано, и культивировали с антагонистом TLR9 H154 (50 мкМ) с последующей стимуляцией «иммуногенными» партиями векторов AAV8 A-HEK-1, A-HEK-2, A -HEK-3 и A-Sf9-1 (MOI: 1:1×106 vg). Через 18 часов не наблюдалось никаких признаков пролиферации клеток (рис. 3а), и было измерено значительное снижение высвобождения IP-10, MIP-1, TNF- и IFN- (рис. 3б). Это указывает на то, что иммунные ответы на «иммуногенные» партии вектора AAV8 в пДК человека опосредованы передачей сигналов TLR9.

Рисунок 2. Сравнение соотношений капсид/vg между различными партиями векторов AAV8-CMV-eGFP и AAV2-CMV-eGFP. Соотношения Te капсид/vg получены на основе измерений оптической плотности (ELISA) и результатов ddPCR (а) восьми партий вектора AAV8 и (b) четырех партий вектора AAV2. Пунктирные линии отделяют партии «иммуногенных» и «неиммуногенных» векторов AAV. Столбцы указывают средние значения и стандартные отклонения повторов. Статистическую значимость определяли с использованием непарного t-критерия Стьюдента.

Рисунок 3. Распознавание «иммуногенных» партий векторов AAV8-CMV-eGFP pDC зависит от TLR9. Человеческие пДК обрабатывали антагонистом TLR9 H154 (50 мкМ) с последующей стимуляцией партиями «иммуногенных» векторов AAV8 (MOI: 1:1×106 vg) в течение 18 часов. ( а ) Репрезентативные светлопольные изображения очищенных пДК, обработанных «иммуногенными» партиями вектора AAV (верхнее изображение) или «иммуногенными» партиями вектора AAV и H154 (нижнее изображение). Масштабная линейка равна 100 мкм. (б) Высвобождение цитокинов IP-10, MIP-1, TNF- и IFN- 2 стимулированными pDC. Поскольку при измерениях IFN- 2 некоторые значения оказывались ниже диапазона анализа, ко всем измеренным значениям IFN- 2 добавлялась константа 1 для представления на полулогарифмическом графике. Показаны средние значения и стандартные отклонения. Статистическую значимость определяли с использованием однофакторного дисперсионного анализа и апостериорного анализа Холма-Сидака. Значения P: Меньше или равно 0,05: *; Меньше или равно 0,01: **; Меньше или равно 0,001: ***.

Обработка ДНКазой снижает иммунные ответы «иммуногенных» партий векторов AAV8 и AAV2.

Хотя «иммуногенные» векторы AAV8 вызывали TLR9-зависимый иммунный ответ в pDC, такие ответы не индуцировались «неиммуногенными» партиями. TLR9 активируется в ответ на ДНК, в частности на ДНК, содержащую неметилированные мотивы CpG9. Важно отметить, что наши измерения с помощью ddPCR подтвердили, что одни и те же компоненты вирусной ДНК присутствовали как в «иммуногенных», так и в «неиммуногенных» партиях векторов. В совокупности это позволило предположить, что неупакованная/свободная ДНК в вирусной суспензии, а не внутривирусная ДНК, может быть возбудителем наблюдаемых иммунных ответов на «иммуногенные» партии векторов AAV. Следовательно, если в вирусной суспензии партий «иммуногенных» векторов AAV8 присутствовала остаточная свободная ДНК, врожденный иммунный ответ должен быть ослаблен ДНКазой. Чтобы проверить эту гипотезу, партии «иммуногенных» векторов AAV8 и AAV2 предварительно обрабатывали ДНКазой I (100 мкг/мл) в течение 30 минут перед стимуляцией AAV. Чтобы исключить неспецифическое воздействие обработки ДНКазой на pDC или частицы AAV, при стимуляции только AAV векторы подвергали обработке DNasemock перед стимуляцией pDC. В этих имитационных обработках без ДНКазы частицы AAV инкубировали при 37 градусах в идентичной среде расщепления ДНКазой в течение того же периода времени, что и AAV, обработанные ДНКазой. Десять pDC засевали и стимулировали партиями «иммуногенных» векторов AAV, предварительно обработанных ДНКазой или обработанных макетом (MOI: 1:1×106 vg). Контролем служили пДК, которые инкубировали только с ДНКазой или ложно обрабатывали носителем. Интересно, что обработка ДНКазой «иммуногенных» партий векторов AAV8 и AAV2 уменьшала реактивную пролиферацию клеток (рис. 4а) или полностью прекращала ее (партии AAV8, A-HEK-2 и A-Sf9-1; партии AAV2). B-Sf9-1 и B-Sf9-2) или значительно уменьшено (партии AAV8 A-HEK-1 и A-HEK-3) выпуск IP{{40} }, MIP-1, TNF- и IFN- после стимуляции AAV (рис. 4б, в). Чтобы подтвердить, что наблюдаемый эффект ДНКазы на самом деле был вызван перевариванием вневирусной ДНК, а не влиянием ДНКазы на целостность вектора, мы исследовали, влияет ли обработка ДНКазой партий вектора AAV на трансдукционную способность AAV. Поскольку применение AAV не привело к какой-либо обнаруживаемой трансдукции pDC, для этих анализов использовались клетки HEK, поскольку клетки HEK представляют собой хорошо известную клеточную модель для анализа эффективности трансдукции при трансдукции AAV19. Мы стимулировали клетки HEK293T обработанными ДНКазой и ложнообработанными партиями векторов AAV8 и AAV2 (MOI: 1:8×104 vg) и оценивали эффективность трансдукции с помощью флуоресцентной микроскопии через 3 дня после применения вектора. Как описано, векторы AAV2 показали более высокую эффективность трансдукции по сравнению с векторами AAV8. Важно отметить, что предварительная обработка ДНКазой не снижала эффективность трансдукции в партиях векторов AAV8 и AAV2, полученных из HEK или Sf9-клеток (рис. S5a,b). Эти результаты являются дополнительным доказательством того, что влияние ДНКазы на иммуногенные свойства партий векторов обусловлено деградацией вневирусной ДНК. Хотя антагонист TLR9 H154 по существу подавлял высвобождение провоспалительных цитокинов для всех четырех иммуногенных партий AAV8 (рис. 3), предварительная обработка ДНКазой также могла устранять провоспалительную цитокиновую реакцию для партий AAV8 A-HEK{{75} } и A-Sf9-1, хотя он не удалил его полностью для партий AAV8 A-HEK-1 и A-HEK-3 (рис. 4). Чтобы проверить, может ли увеличение времени обработки ДНКазой отменить этот цитокиновый ответ, мы повторили эксперименты по моделированию pDC после десятикратного увеличения времени инкубации ДНКазы соответствующих партий (A-HEK-1 и A-HEK{{87}). }). Мы наблюдали, что после обработки векторов ДНКазой в течение 5 часов средние концентрации цитокинов в супернатанте стимулированных AAV клеток еще больше снижались и больше не отличались существенно от концентраций контрольного носителя. Этот образец ответа мог быть подтвержден в трех экспериментах, каждый из которых проводился с клетками одного индивидуального донора (рис. S6). Это позволяет предположить, что основной причиной TLR9-зависимого провоспалительного иммунного ответа в пДК действительно является вневирусная ДНК. Чтобы проверить, увеличивает ли высвобождение внутривирусной ДНК иммуностимулирующую активность векторов AAV, мы намеренно вскрыли вирусные капсиды «иммуногенной» партии AAV8 A-HEK-1 путем термической обработки при 95 градусах в течение 10 мин. . Затем партию термообработанных векторов использовали для стимуляции pDC. Хотя не было различий в пролиферации реактивных клеток при стимуляции A-HEK-1 партии AAV8 с термической обработкой и без нее, наблюдалось значительное увеличение высвобождения IP-10, MIP-1 , TNF- и IFN- в условиях термической обработки, что указывает на то, что высвобождение инкапсулированной вирусной ДНК в суспензию вектора может способствовать индукции иммунных ответов (рис. 5). В совокупности эти данные указывают на то, что препараты вектора AAV могут содержать вневирусные примеси ДНК, которые могут вызывать специфичные для партии иммунные реакции в pDC. Эти ответы опосредуются передачей сигналов TLR9 и могут быть уменьшены/устранены путем обработки партий векторов ДНКазой.

Рисунок 4. Предварительная обработка ДНКазой снижает иммунные ответы, индуцированные «иммуногенными» партиями векторов AAV8-CMV-eGFP и AAV2-CMV-eGFP. pDC человека стимулировали обработанными ДНКазой партиями «иммуногенных» векторов AAV8 в течение 18 часов (MOI: 1:1×106 vg). ( а ) Репрезентативные светлопольные изображения очищенных пДК, стимулированных «иммуногенными» партиями векторов AAV (верхнее изображение) и «иммуногенными» партиями векторов AAV, предварительно обработанными 1{{30}}0 мкг/мл ДНКазы. Я (нижнее изображение). Масштабная линейка составляет 500 мкм. (б) Высвобождение цитокинов IP-10, MIP-1, TNF- и IFN- 2 AAV8-стимулированными пДК. (c) Высвобождение цитокинов AAV2-стимулированными пДК. Поскольку при измерениях IFN- 2 (b и c) и измерении TNF- (b) некоторые значения находились ниже диапазона анализа, константа 1 была добавлена ​​ко всем измеренным значениям IFN- 2 и TNF- для представление в полулогарифмическом графике. Показаны средние значения и стандартные отклонения. Статистическую значимость определяли с использованием однофакторного дисперсионного анализа и апостериорного анализа Холма-Сидака. Значения P: Меньше или равно 0,05: *; Меньше или равно 0,01: **; Меньше или равно 0,001: ***.

Эксплоративный анализ вневирусных примесей ДНК в препаратах вектора AAV8.

Для проведения первой исследовательской характеристики компонентов вневирусной ДНК в партиях вектора AAV были использованы репрезентативные «иммуногенные» (A-HEK-1) и «неиммуногенные» (B-HEK-1) Анализировали партию векторов, полученных из клеток HEK. Эти партии либо обрабатывались ДНКазой в среде pDC в течение 30 минут при температуре 37 градусов, как описано выше, либо подвергались имитационной обработке и ультрафильтрации с использованием фильтрующего устройства с отсечкой 100 кДа, либо подвергались только имитационной обработке (рис. S7a– г). Последовательное разделение и оценка очищенной ДНК с помощью биоанализатора LabChip выявило наличие сопоставимых количеств векторной ДНК (рис. S7b-g) в обработанных и искусственно обработанных образцах каждой партии, что подтверждает, что ни ультрафильтрация, ни обработка ДНКазой не повлияли на содержание ДНК. внутри капсида. Кроме того, было показано, что только «иммуногенная» (рис. S7a–d), но не «неиммуногенная» партия векторов (рис. S7a,e–g) содержала дополнительные молекулы ДНК размером от 100 до 450 п.н. (рис. S7a,e–g) (рис. S7a,e–g). S7c,d и h). Важно отметить, что эти дополнительные молекулы ДНК можно было обнаружить в образце, обработанном макетом, и образце, подвергнутом ультрафильтрации, но практически отсутствовали в образце, обработанном ДНКазой (рис. S7a–d). Это указывает на то, что эти молекулы ДНК представляют собой вневирусные примеси ДНК, которые могут разлагаться ДНКазой, но не могут быть удалены из суспензии вектора ультрафильтрацией. Финансирование, согласно которому эти примеси можно было обнаружить только в «иммуногенной», но не в «неиммуногенной» партии векторов, доказывает, что появление этих вневирусных молекул ДНК специфично для партии и может дополнительно предполагать, что эти молекулы индуцируют или способствуют иммуностимулирующим свойствам вектора. Чтобы оценить потенциальный источник загрязняющей ДНК в «иммуногенных» (A-HEK-1) и «неиммуногенных» (B-HEK-1) партиях количественного (q)ПЦР-анализа HEK. Анализировали клеточную ДНК, плазмидную ДНК и векторную ДНК AAV. ДНК-матрицу из образцов каждой партии, обработанных ДНКазой, обработанных макетом, ультрафильтрованных и только обработанных макетом, использовали для амплификации повтора Alu, мультикопийного гена NPIP ядерного генома и последовательностей гена митохондриальной 16S рРНК (mt16S) клеточного происхождения HEK. , для амплификации ампликона инвертированного концевого повтора AAV8 (ITR2; вектор и происхождение трансгенной плазмидной ДНК) и для амплификации ампликона гена blah (резистентности к ампициллину) (Amp; происхождение плазмидной ДНК) (Таблица S4). Сравнение соотношений значений ΔCt ампликона, специфичного для ДНК клеток HEK, и ампликона ITR2 (т. е. Alu против ITR2, NPIP против ITR2 и mt16S против ITR2) и специфичного для плазмидной ДНК ампликона против ампликона ITR2 (Amp против ITR2), соответственно, указывает на то, что две партии содержат незначительные количества ядерной и митохондриальной ДНК клеток HEK. Напротив, анализ выявил приличное количество плазмидной ДНК как в «иммуногенной», так и в «неиммуногенной» партии вектора (около 1/32 и 1/50 соответственно с точки зрения количества копий относительно ДНК AAV). эта доля находится в пределах диапазона значений, зарегистрированных для других векторов AAV12 (рис. S7). Тем не менее, не было очевидных различий в относительном соотношении векторной ДНК к плазмиде и ДНК клеток HEK между обработанными ДНКазой и имитированными или ультрафильтрованными и имитирующими образцами обеих партий векторов (рис. S8). Это может свидетельствовать о том, что неупакованная примесная ДНК по составу целевой последовательности аналогична составу упакованной ДНК. Однако ограничением анализа qPCR является размер примесной ДНК (100–450 п.н.), которая будет содержать приличную долю фрагментов с неполной целевой последовательностью.

Рисунок 5. Высвобождение внутривирусной ДНК при тепловой обработке векторов усиливает провоспалительные цитокиновые реакции в пДК. Высвобождение цитокинов IP-10, MIP-1, TNF- и IFN- 2 pDC через 18 часов после стимуляции термообработанной партией AAV8 A-HEK-1 (MOI: 1:1×106 вг). Горизонтальные линии обозначают средние значения и стандартные отклонения. Статистически значимые различия между цитокиновыми ответами, индуцированными термообработанными и необработанными векторами, определяли с помощью t-критерия Стьюдента. Значение P: Меньше или равно 0.01: **; Меньше или равно 0,001: ***.

Обсуждение

Векторы AAV являются одним из наиболее перспективных инструментов генной терапии. Однако накапливающиеся данные оспаривают мнение о том, что иммуногенность AAV незначительна5. В свете этого становится все более важным лучше понять механизмы, с помощью которых происходят иммунные ответы на AAV. В этом исследовании мы демонстрируем, что (1) AAV8 и AAV2 индуцируют специфичные для партии врожденные иммунные реакции в pDC человека, которые не являются специфичными ни для соотношения капсид/vg, ни для производственной платформы, ни для производителя/метода очистки; (2) врожденные иммунные реакции в pDC зависят от передачи сигналов TLR9 и могут быть снижены путем предварительной обработки ДНКазой; (3) обработка ДНКазой не влияет на целостность векторной частицы, поскольку она не снижает скорость трансдукции партий векторов AAV8 и AAV2 в клетках HEK293T; и (4) партии векторов AAV могут содержать молекулы вневирусной ДНК, которые можно удалить путем обработки партии векторов ДНКазой. Это говорит о том, что препараты AAV, полученные из клеток HEK и Sf9-, могут содержать примеси вневирусной ДНК, которые стимулируют врожденный иммунный ответ. В недавнем исследовании был проведен сравнительный анализ с использованием векторов AAV из разных видов клеток-хозяев (клеток HEK и клеток Sf9)11. Авторы обнаружили, что векторы, полученные из HEK и Sf9-, различаются по своим PTM и остаточным белковым примесям клеток-хозяев для всех протестированных ими серотипов AAV и производителей. Кроме того, они проанализировали цитокиновый ответ первичных фибробластов человека на трансдукцию AAV и обнаружили, что векторы, полученные из HEK и Sf9-, могут различаться по своим иммуногенным свойствам. В нашем исследовании мы также сравнили эти две основные производственные системы, используя разные партии одной и той же конструкции AAV от разных производителей и двух разных серотипов. Однако иммунные реакции, индуцированные вектором, которые мы наблюдали в нашей модели pDC человека, не были конкретно связаны с данной производственной системой, производителем или серотипом, а были специфичными для партии. Предыдущие доклинические и клинические исследования генной терапии сетчатки показали, что на иммунные ответы на векторы AAV, такие как воспаление глаз или инфильтрация иммунных клеток, могут влиять различия в соотношениях капсид/vg18 или различия в дозах5. Тиммерс и др.18 показали, что удаление пустых капсидов AAV из вирусной суспензии уменьшает воспаление и улучшает трансдукцию вируса в доклиническом исследовании на приматах, кроме человека. Тем не менее, наши результаты показали, что повышенные соотношения капсид/vg присутствовали как среди «иммуногенных», так и «неиммуногенных» партий векторов AAV, а это означает, что большее количество капсидов (пустые капсиды) в вирусной суспензии не было ответственно за индукцию иммунные реакции, специфичные для векторной партии, в нашей модели pDC человека. Кроме того, ранее мы показали, что AAV8 индуцирует иммунные реакции дозозависимым образом у приматов, кроме человека6,8. Однако увеличение дозы «неиммуногенных» векторов AAV в этом исследовании было недостаточным для запуска иммунного ответа в пДК человека. Поэтому, чтобы понять причину различий в иммуногенных свойствах векторов, мы исследовали механизм распознавания «иммуногенных» партий AAV. Использование моделей иммунокомпетентных клеток in vitro позволило ученым более точно изучить роль путей TLR во врожденных иммунных реакциях, генерируемых векторами AAV9,10. Zhu et al.9 впервые описали, что pDC, но не обычные DC или не-pDC, высвобождают большие количества IFN типа I и провоспалительных цитокинов в ответ на стимуляцию AAV, и продемонстрировали участие пути TLR9 в распознавании AAV8 и AAV2. с использованием мышиных контроллеров домена. Авторы также заметили, что AAV2 индуцирует TLR9-зависимые иммунные ответы в pDC человека. В нашем исследовании с использованием одного из наиболее специфичных антагонистов TLR9, H1549,21–24, мы косвенно показали, что не только векторы AAV2, но и AAV8 индуцируют TLR9-зависимые врожденные иммунные ответы в пДК человека, но очень специфическим образом. Поскольку TLR9 является рецептором ДНК, это позволяет предположить, что иммунные ответы на партии «иммуногенных» векторов AAV индуцируются компонентами ДНК. Однако, хотя наши измерения ddPCR подтвердили, что одни и те же компоненты упакованной ДНК присутствовали как в «иммуногенных», так и в «неиммуногенных» партиях векторов, «неиммуногенные» партии не вызывали иммунных ответов в pDC. Кроме того, обработка ДНКазой либо уменьшала, либо отменяла иммуностимулирующие свойства партий «иммуногенных» векторов AAV, но не снижала трансдукционную эффективность этих векторов в клетках HEK, что позволяет предположить, что обработка ДНКазой AAV воздействовала на неинкапсулированную экстравирусную ДНК в клетках HEK. суспензия вектора, но не влияла на целостность векторного генома внутри интактного капсида. Это было дополнительно подтверждено сравнительными анализами ДНК репрезентативных партий «иммуногенных» и «неиммуногенных» векторов, обработанных ДНКазой и обработанных имитацией.

цистанхе трубчатой ​​– улучшает иммунную систему

Нажмите здесь, чтобы просмотреть продукты Cistanche Enhance Immunity

【Запросить дополнительную информацию】 Электронная почта:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

В совокупности все эти эксперименты показывают, что иммунный ответ на «иммуногенные» партии векторов в пДК управлялся не ДНК, содержащейся в частицах AAV (т.е. векторным геномом или потенциальными примесями ДНК, упакованными в капсидах AAV), а доступной вневирусной ДНК. компоненты, содержащиеся в вирусных суспензиях (т.е. ДНК вне или незащищенная вирусным капсидом). Мы также наблюдали, что когда ДНК, содержащаяся в вирусных капсидах партии «иммуногенного» вектора, подвергалась воздействию клеток путем термической обработки вектора, наблюдалось усиление иммунного ответа. Неясно, было ли увеличение иммуностимулирующей активности после открытия капсидов обусловлено одноцепочечной ДНК вектора или потенциальными примесями, упакованными в капсиды AAV, такими как остаточные нуклеиновые кислоты клеток-хозяев, остаточные последовательности хелперной ДНК, последовательность основной цепи. фрагменты, упакованные вместе с кассетой, или обратное праймирование из ITR, что приводит к получению небольших фрагментов основной цепи, упакованных в AAV12,25. Точный механизм захвата вневирусной ДНК пДК остается неизвестным. Чувствительность пДК к олигонуклеотидам CpG демонстрирует, что пДК могут реагировать на свободную ДНК26. Это позволяет предположить, что иммунный ответ в пДК может быть вызван поглощением свободной контаминирующей ДНК, содержащейся в суспензии вектора. Кроме того, было показано, что пДК могут поглощать векторы AAV27, что альтернативно указывает на то, что потенциальная связанная с капсидом ДНК может транспортироваться в клетку во время поглощения частиц AAV. Наличие загрязнения вневирусной ДНК в препаратах векторов AAV может быть либо присущим свойством соответствующей партии векторов, возникающим в результате процесса производства и очистки векторов, либо может быть связано с высвобождением инкапсулированной ДНК из-за неподходящих условий хранения. . Все партии векторов, исследованные в этих экспериментах, были получены в течение одного и того же периода времени (5 из 8 исследованных партий вектора AAV8, из которых два были «иммуногенными» (A-HEK-2; A-HEK-3) и три были «неиммуногенными» (A-Sf9-2; B-Sf9-1; B-Sf9-2) даже производились параллельно специально для этого исследования), партии из каждый производитель был отправлен в одних и тех же транспортных коробках, и после получения все партии хранились рядом в одном ящике морозильной камеры при температуре -80 градусов с защитой от температуры, а затем аликвоты всех партий одновременно размораживались и наносились на pDC. в параллельных экспериментах. Это убедительно свидетельствует о том, что за различия в содержании вневирусной ДНК и иммуностимулирующих свойствах этих партий виноват процесс производства и очистки AAV, а не неправильное хранение. В прошлом партии векторов AAV клинического класса, производимые для генной терапии (алипоген типарвовек, Glybera), больше не были разрешены из-за большого количества примесей, включая потенциально иммуногенную остаточную ДНК клеток-хозяев28. Удаление примесей ДНК из вирусных суспензий обычно проводят в процессе производства. Здесь обычно применяется обработка бензоназой29 или ДНКазой30, чтобы удалить остаточную ДНК из конечной вирусной суспензии. Эта обработка, в зависимости от протокола, длится от 30 минут до 3 часов, а затем фермент инактивируется химическими веществами, такими как соли хлорида цезия30. В наших экспериментах было обнаружено, что четыре из пяти партий AAV8, полученных из Центра ядра вирусных векторов Университета Айовы, и обе партии вектора AAV2 от Virovek оказались иммуногенными в pDC. Как описано в разделе «Материалы и методы», процесс очистки партий векторов обоих производителей включает несколько стадий очистки, некоторые из которых сильно отличаются друг от друга. Таким образом, процесс очистки на основном предприятии в Айове включает обработку турбонуклеазой с последующим ультрацентрифугированием в градиенте йодиксанола, анионообменной колоночной хроматографией, флаттерной стерилизацией и заменой буфера с использованием центробежных фильтров. Напротив, Вировек применяет обработку бензоназой, ультрацентрифугирование в CsCl с последующим обессоливанием и стерилизацией фильтрованием. С другой стороны, процесс очистки Vigene не включает обработку ДНКазой, а, как это используется в Core Facility в Айове, включает ультрацентрифугирование в градиенте йодиксанола. Удивительно, однако, что ни одна из трех партий векторов, полученных из Vigene (AAV8: C-HEK-1; AAV2: C-HEK-1 и 2), не индуцировала иммунные ответы в pDC, что позволяет предположить, что «неиммуногенные» «Векторные партии также могут быть получены с помощью производственных процессов, не требующих обработки ДНКазой.

Преимущества добавки цистанхе – как укрепить иммунную систему

В целом, частично схожие и частично разные этапы очистки, используемые тремя производителями, затрудняют связь иммуногенных свойств векторов, наблюдаемых в pDC, с одним этапом производственного процесса. В клинических испытаниях используются векторы, соответствующие требованиям надлежащей производственной практики (GMP), которые проходят строгий контроль качества. Ни один из векторов трех производителей, использованных в этом исследовании, не соответствует требованиям надлежащей лабораторной практики (GLP) и, следовательно, может иметь более низкую чистоту, чем векторы клинического класса. Таким образом, важно признать, что векторы GMP, используемые в клинических испытаниях на людях, могут проявлять или не проявлять различия, которые мы наблюдали в настоящем исследовании, и что актуальность наших результатов для клинического использования генной терапии не ясна. Однако, по нашему собственному опыту, значительные различия в концентрациях загрязняющих компонентов, таких как белки клеток-хозяев, могут возникать даже при использовании векторов класса GMP, и даже для векторов класса GMP не существует единых согласованных спецификаций относительно того, какие уровни приемлемо5. В совокупности улучшение процесса производства векторов AAV является ключом к предотвращению присутствия остаточных примесей в вирусных суспензиях и минимизации возможности непреднамеренных иммунных реакций. В заключение мы продемонстрировали, что примеси вневирусной ДНК могут влиять на иммуногенные свойства векторов AAV в пДК человека. Необходимы дальнейшие исследования для изучения последствий этих результатов для безопасности генной терапии, опосредованной AAV, на животных моделях или пациентах-людях.

Рекомендации

1. Гай Т., Эпштейн Б.Е. и Шафер Д.В. Геномная инженерия с использованием аденоассоциированного вируса: приложения для фундаментальных и клинических исследований. Мол. Тер. 24, 458–464 (2016).

2. Гарита-Эрнандес М. и др. AAV-опосредованная доставка генов в трехмерные органоиды сетчатки, полученные из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток. Межд. Дж. Мол. наук. 21, 994 (2020).

3. Рассел С. и др. Эффективность и безопасность воретигена непарвовека (AAV2-hRPE65v2) у пациентов с наследственной дистрофией сетчатки, опосредованной РПЭ65-: рандомизированное контролируемое открытое исследование фазы 3. Ланцет 390, 849–860 (2017).

4. Хе, X., Урип, Б.А., Чжан, З., Нган, К.С. и Фэн, Б. Развитие терапии с использованием AAV в направлении окончательного лечения. Дж. Мол. Мед. 99, 1–25. https://doi.org/10.1007/s00109-020-02034-2 (2021 г.).

5. Бухер К., Родригес-Боканегра Э., Даулетбеков Д. и Фишер М.Д. Иммунные реакции на генную терапию сетчатки с использованием аденоассоциированных вирусных векторов – значение для успеха и безопасности лечения. Прог. Ретин. Глаз Рез. 83, 100915 (2020).

6. Райхель Ф.Ф. и др. AAV8 может вызывать врожденные и адаптивные иммунные реакции в глазах приматов. Мол. Тер. 25, 2648–2660 (2017).

7. Бойд Р.Ф. и др. Снижение ретинальной трансдукции и повышение трансген-направленной иммуногенности при интравитреальной доставке rAAV после задней витрэктомии у собак. Джин Тер. 23, 548–556 (2016).

8. Родригес-Боканегра, Э. и др. Продольная оценка гиперрефективных очагов в сетчатке после субретинальной доставки аденоассоциированного вируса у приматов, не являющихся человеком. Перевод Вис. наук. Технол. 10, 15 (2021).

9. Чжу Дж., Хуанг К. и Ян Ю. Те Путь TLR9-MyD88 имеет решающее значение для адаптивных иммунных ответов на векторы генной терапии аденоассоциированных вирусов у мышей. Дж. Клин. Расследование. 119, 2388–2398 (2009).

10. Хёзель М. и др. Toll-подобный рецептор 2-опосредует врожденный иммунный ответ в непаренхиматозных клетках печени человека на аденоассоциированные вирусные векторы. Гепатология 55, 287–297 (2012).

11. Румачик Н.Г. и др. Методы имеют значение: стандартные платформы для производства рекомбинантных AAV производят химически и функционально различные векторы. Мол. Тер. Методы Клин. Дев. 18, 98–118 (2020).

12. Райт, Дж. Ф. Примеси, связанные с продуктом, в рекомбинантных векторах AAV клинического уровня: характеристика и оценка риска. Биомедицина 2, 80–97 (2014).

13. Клемент Н. и Григер Дж. К. Производство рекомбинантных аденоассоциированных вирусных векторов для клинических испытаний. Мол. Тер. Методы Клин. Дев. 3, 16002 (2016).

14. Пено-Будлоо М., Франсуа А., Клеман Н. и Аюсо Э. Фармакология производства рекомбинантного аденоассоциированного вируса. Мол. Тер. Методы Клин. Дев. 8, 166–180 (2018).

15. Йе, Ю., Гоглер, Б., Моти, М. и Малард, Ф. Биология плазмацитоидных дендритных клеток и ее роль в иммуноопосредованных заболеваниях. Клин. Перевод Иммунол. 9, е1139 (2020).

16. Фишер, доктор медицинских наук и др. Эффективность и безопасность генной терапии сетчатки с использованием аденоассоциированного вирусного вектора у пациентов с хороидеремией: рандомизированное клиническое исследование. ДЖАМА Офтальмол. 137, 1247–1254 (2019).

17. Велебер Р.Г. и др. Результаты через 2 года после генной терапии врожденного амавроза Лебера с дефицитом РПЭ65- и тяжелой дистрофии сетчатки, начавшейся в раннем детстве. Офтальмология 123, 1606–1620 (2016).

18. Тиммерс AM и др. Воспалительная реакция глаза на интравитреальную инъекцию аденоассоциированного вирусного вектора: относительный вклад генома и капсида. Хм. Джин Тер. 31, 80–89 (2020).

19. Ран, Г. и др. Сайт-направленный мутагенез повышает эффективность трансдукции рекомбинантных векторов AAV, полученных из капсидной библиотеки. Мол. Тер. Методы Клин. Дев. 17, 545–555 (2020).

20. Эллис Б.Л. и др. Исследование эффективности трансдукции ex vivo/in vitro первичных клеток и клеточных линий млекопитающих с девятью природными аденоассоциированными вирусами (AAV1-9) и одним сконструированным серотипом аденоассоциированного вируса. Вирол. Дж. 10, 1–10 (2013).

21. Ямада Х. и др. Влияние супрессивной ДНК на CpG-индуцированную иммунную активацию. Дж. Иммунол. 169, 5590–5594 (2002).

22. Чжан П. и др. Антагонист Toll-подобного рецептора 9 подавляет гуморальный иммунитет при экспериментальной аутоиммунной миастении. Мол. Иммунол. 94, 200–208 (2018).

23. Чан, Ю.К. и др. Разработка аденоассоциированных вирусных векторов для уклонения от врожденных иммунных и воспалительных реакций. наук. Перевод Мед. 13, eabd3438 (2021).

24. Байик Д., Гурсель И. и Клинман Д.М. Структура, механизм и терапевтическое применение иммуносупрессивных олигонуклеотидов. Фармакол. Рез. 105, 216–225 (2016).

25. Бримбл, Массачусетс и др. 547. Препараты AAV содержат примеси последовательностей ДНК в продуцирующих плазмидах непосредственно за пределами ITR. Мол. Тер. 24, С218–С219 (2016).

26. Латц Э. и др. Сигналы TLR9 после транслокации из ER в ДНК CpG в лизосоме. Нат. Иммунол. 5, 190–198 (2004).

27. Верон П. и др. Основные субпопуляции дендритных клеток человека эффективно трансдуцируются самокомплементарными аденоассоциированными вирусными векторами 1 и 2. J. Virol. 81, 5385–5394 (2007).

28. Отчет об оценке: Глыбера. https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/glybera-epar-public-assessment report_en.pdf. По состоянию на 3 марта 2022 г. (2012 г.)

29. Арден Э. и Мецгер Дж. Недорогой, независимый от серотипа протокол очистки нативных и биоинженерных рекомбинантных аденоассоциированных вирусов. Ж. Биол. Методы 3, e38 (2016).

30. Григер Дж. К., Чой В. В. и Самульский Р. Дж. Производство и характеристика аденоассоциированных вирусных векторов. Нат. Протокол. 1, 1412–1428 (2006).

31. Кимура Т. и др. Производство аденоассоциированных вирусных векторов для применения in vitro и in vivo. наук. Реп.9, 13601 (2019).

32. Аюсо Э. и др. Высокая чистота вектора AAV приводит к независимому от серотипа и ткани повышению эффективности трансдукции. Джин Тер. 17, 503–510 (2010).