Экстракция, физико-химические свойства, антивозрастная и антиоксидантная активность полисахаридов из остатков промышленной конопли Часть 1

Абстрактный: большое количество полисахаридов конопли остается в промышленных остатках конопли (IHR) после извлечения каннабидиола, что приводит к растрате ресурсов. Поэтому систематическое изучение полисахаридов конопли полезно для развития IHR в будущем. В этом исследовании экстракция полисахаридов из остатков промышленной конопли (IHRP) была оптимизирована с помощью однофакторного эксперимента и ортогонального экспериментального плана. Оптимальными условиями экстракции нагреванием были температура экстракции 98 ◦C, соотношение твердой и жидкой фаз 1:10, время экстракции 1 ч, количество последовательных экстракций 2 и pH 4. Коэффициент экстракции и содержание полисахаридов были 20,12 ± 0,55% и 12,35 ± 0,26% в условиях соответственно. Кроме того, лучшими условиями осаждения спирта были перекачка со скоростью 2 л/ч, постоянное перемешивание и водяная баня со льдом в течение 4 часов. Неочищенные IHRP дополнительно очищали колоночной хроматографией, и содержание полисахарида/белка в очищенных IHRP составляло 34,44% и 1,61%. IHRP в основном состоят из десяти моносахаридов и некоторых несахарных компонентов, включая органические кислоты, флавоноиды, стероиды и гликозиды. FT-IR продемонстрировал полисахаридный скелет IHRP. Более того, степень очистки IHRP от DPPH и ABTS составила 76,00 процентов и 99,05 процентов при концентрациях 1 мг/мл. IHRP могут способствовать пролиферации эпидермальных клеток и заживлению клеточных царапин. Между тем, IHRP могут способствовать экспрессии генов, связанных с замедлением старения. В целом, IHRP могут быть желательным природным источником антиоксидантов и продуктов против старения во многих аспектах.

Гликозид цистанхе также может повышать активность СОД в тканях сердца и печени и значительно снижать содержание липофусцина и МДА в каждой ткани, эффективно удаляя различные активные кислородные радикалы (ОН-, Н₂О₂ и др.) и защищая от повреждения ДНК, вызванного ОН-радикалами. Цистанхефенилэтаноидные гликозиды обладают сильной акцепторной способностью свободных радикалов, более высокой восстановительной способностью, чем витамин С, улучшают активность СОД в суспензии сперматозоидов, снижают содержание МДА и оказывают определенное защитное действие на функцию мембран сперматозоидов. Полисахариды цистанхе могут усиливать активность СОД и GSH-Px в эритроцитах и ​​тканях легких экспериментально стареющих мышей, вызванную D-галактозой, а также снижать содержание МДА и коллагена в легких и плазме, повышать содержание эластина, хороший очищающий эффект на DPPH, продлевает время гипоксии у стареющих мышей, улучшает активность SOD в сыворотке и задерживает физиологическую дегенерацию легких у экспериментально стареющих мышей Эксперименты с клеточной морфологической дегенерацией показали, что Cistanche обладает хорошей антиоксидантной способностью и потенциально может стать лекарством для профилактики и лечения заболеваний кожи, вызывающих старение. В то же время эхинакозид в цистанхе обладает значительной способностью улавливать свободные радикалы DPPH и может улавливать активные формы кислорода, предотвращать вызванную свободными радикалами деградацию коллагена, а также оказывает хорошее восстанавливающее действие на повреждение анионов свободных радикалов тимина.

Нажмите на преимущества rou cong rong

【Для получения дополнительной информации:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Ключевые слова: конопля техническая; полисахарид; добыча; антиоксидантная активность; омолаживающая активность

1. Введение

Конопля (Cannabis sativa L.), однолетнее травянистое растение семейства каннабиса, используется уже тысячи лет [1]. Содержание тетрагидроканнабинола (ТГК) в промышленной конопле составляет менее 0,3 мас.%, что отличается от медицинской марихуаны и рекреационной марихуаны [2,3]. Следовательно, промышленную коноплю можно было легально выращивать в больших масштабах. Химический состав технической конопли очень сложен, включая каннабиноиды, терпеноиды, алкалоиды и флавоноиды [4]. Наиболее биологически активными соединениями являются каннабиноиды, включающие более 130 терпеновых фенольных соединений, которые в основном накапливаются в верхушках цветков [5]. Основными каннабиноидами являются ТГК, каннабидиол (КБД), каннабинол (КБН), каннабигерол (КБГ), каннабидиварин (КБДВ), каннабидиол (КБТ) и каннабициклол (КБЛ) [6]. Среди них ТГК, психоактивное соединение, ограниченное в разных странах, и КБД являются наиболее изученными каннабиноидами из-за их значительной биологической активности [7], такой как нейропротекторная, противоэпилептическая, противораковая и иммунорегуляторная активность [8]. Существование этих соединений увеличивает значение технической конопли. В настоящее время промышленная конопля широко используется в областях бытовой химии, материалов, энергетики и медицины [9]. Нынешняя обработка отходов промышленной конопли (IHR) заключается в их непосредственном выбрасывании, что не только загрязняет окружающую среду, но и приводит к растрате ресурсов [10].

Полисахарид представляет собой полимер, состоящий из более чем 10 моносахаридов [11]. Это одна из наиболее важных биологических макромолекул. В последние годы во многих статьях сообщалось, что природные полисахариды из растений обладают хорошей биологической активностью, в том числе противораковой [12], противовоспалительной [13], антиоксидантной [14], иммуномодулирующей [15], гипогликемической [16] и противовирусной активностью. [17]. Молекулярный состав и пространственная структура полисахаридов обычно существенно влияют на их свойства и активность [18]. С развитием технологий разделения, очистки и структурного анализа полисахаридов общепризнано, что полисахариды имеют большое значение для применения в области лекарств, косметики и пищевых продуктов [19]. Содержание полисахаридов в остатках технической конопли составляет около 10-15%. Полисахариды конопли обладают многими превосходными физико-химическими свойствами, поскольку они содержат много гидрофильных гидроксилов, таких как сильная водопоглощающая способность, эмульгирующие свойства и хорошая пленкообразующая способность. Между тем полисахариды конопли обладают влагоудерживающим, антибактериальным и нетоксичным действием. Поэтому они имеют широкие перспективы применения в области косметики. Ферментированные продукты полисахаридов конопли (олигосахариды или некоторые сахарные спирты), которые, как сообщается, обладают хорошей антиоксидантной, антивозрастной и антиусталостной активностью, использовались для разработки функциональных напитков [20]. Состав полисахаридов конопли относительно сложен и варьируется от моносахаридов до полисахаридов с молекулярной массой 5 ​​× 104 Да.

Есть несколько сообщений о разделении и экстракции полисахаридов конопли. Хиллестад и др. выделил два гликопротеина из конопли. Структуру сцепления глюкозидной цепи и связь между цепью и белком анализировали с помощью метилирования и деградации по Смиту [21]. Дж. В. Гроус и др. измерили содержание углеводов в конопле, выращенном в США, Таиланде и Вьетнаме соответственно. Отмечено, что существуют большие различия в типе и содержании соединений между сортами из разных районов [22]. Чжэн и др. проанализировали моносахаридный состав и структуру HSP0 и HSP0.2, двух компонентов полисахарида семян конопли, с помощью ВЭЖХ и FT-IR. Было обнаружено, что HSP0 и HSP0.2 содержат сульфатные радикалы [23]. Би и др. получили два полисахарида семян конопли HS1 и HS2 с помощью гель-фильтрационной хроматографии. Основными моносахаридами были D-арабиноза, D-ксилоза, D-манноза, D-галактоза и D-глюкоза, а их молярные отношения были 0.12, 0.09 , 0,15, 0,11 и 0,12 соответственно [24]. Гуо и др. получали полисахариды из листьев технической конопли и изучали влияние ультрафиолетового света, температуры и рН на их антибактериальную активность. Установлено, что минимальная бактерицидная концентрация и минимальная ингибирующая концентрация полисахаридов в отношении S. aureus составляли 6,25 и 3,125 мг/мл соответственно. Кроме того, антибактериальная активность была самой высокой при рН 7.

В этом исследовании IHR после экстракции каннабидиола использовали в качестве сырья для экстракции полисахаридов. Был оптимизирован процесс экстракции и очистки полисахаридов из остатков промышленной конопли (IHRP). Затем были проанализированы структура и состав ИГРП. Кроме того, была оценена способность IHRP поглощать ABTS и DPPH. Его омолаживающая активность также изучалась на клеточном уровне. Есть надежда, что IHRP можно будет широко использовать в области косметики и функционального питания.

2. Результаты и обсуждение

2.1. Однофакторные эксперименты по экстракции IHRP

2.1.1. Влияние методов экстракции на экстракцию полисахаридов

Влияние перколяционной экстракции, экстракции нагреванием и экстракции с помощью ультразвука на экстракцию полисахаридов показано на рисунке 1а. Видно, что содержание полисахарида в перколяционной экстракции близко к 0 процентам, что указывает на то, что полисахарид почти не экстрагируется, а экстракт в основном состоит из пигмента и других водорастворимых компонентов. Результаты были получены благодаря тому, что перколяционная экстракция была очень щадящей, а клеточная стенка IHR не разрушалась. Таким образом, полисахариды не могли быть экстрагированы из клеток, что приводило к тому, что содержание полисахаридов и коэффициент экстракции перколяционной экстракции были очень низкими. Коэффициент экстракции при нагревании был выше, чем при экстракции с помощью ультразвука. Однако содержание полисахаридов при экстракции нагреванием (11,27%) было ниже, чем при экстракции с помощью ультразвука (13,81%). Экстракция нагреванием является одним из наиболее часто используемых методов экстракции из-за простоты процесса и низкой стоимости. Однако время нагревания экстракции относительно велико, а коэффициент экстракции невысок. Температура экстракции обычно оказывает большое влияние на коэффициент экстракции. Более высокий коэффициент извлечения при нагревании в этой работе был связан с тем, что нагревание проводилось при 98 ◦ C, а ультразвуковое экстрагирование проводилось при 60 ◦ C. Ультразвуковая экстракция может сократить время экстракции, поскольку эффект кавитации и механический эффект могут разрушить клеточные стенки, улучшить проникновение растворителя и ускорить перенос полисахаридов в растворитель [25]. Таким образом, содержание полисахаридов при экстракции с помощью ультразвука было выше, чем при экстракции при нагревании. Извлечение при нагревании было выбрано для следующих экспериментов, учитывая простоту процесса и индустриализацию.

2.1.2. Влияние температуры экстракции на экстракцию полисахаридов

Влияние температуры экстракции на экстракцию полисахарида показано на рис. 1b, когда соотношение твердой и жидкой фаз составляло 1:10, время экстракции составляло 1 час, количество последовательных экстракций составляло 2, а рН составлял 7. Коэффициент экстракции и содержание полисахаридов увеличивается с повышением температуры. Когда температура составляла 98 ◦C, самый высокий коэффициент экстракции и содержание полисахаридов составляли 14,99% и 12,03% соответственно.

2.1.3. Влияние соотношения твердой и жидкой фаз на экстракцию полисахаридов

Когда температура экстракции составляла 98 ◦ C, время экстракции составляло 1 час, количество последовательных экстракций составляло 2, а pH равнялся 7, влияние соотношения твердой и жидкой фаз на экстракцию полисахарида было показано на рисунке 1c. Коэффициент экстракции постепенно увеличивался с соотношением твердой и жидкой фаз от 1:6 до 1:10, а затем становился ровным. Однако содержание полисахаридов практически не зависит от соотношения твердой и жидкой фаз. Кроме того, раствор мог просто погружать сырье при соотношении твердой и жидкой фаз 1:5 из-за низкой плотности листьев растений. Поэтому в первую очередь изучалось соотношение твердой и жидкой фаз 1:6.

2.1.4. Влияние pH на экстракцию полисахаридов

При температуре экстракции 98°C, времени экстракции 1 час, количестве последовательных экстракций 2 и соотношении твердой и жидкой фаз 1:10 влияние pH на экстракцию полисахаридов показано на рисунке 1d. Когда раствор постепенно подкисляли или подщелачивали, коэффициент экстракции до некоторой степени улучшался. Однако содержание полисахаридов имело тенденцию к снижению с увеличением pH, что указывало на то, что кислая среда благоприятствовала экстракции IHRP.

2.1.5. Влияние времени экстракции на экстракцию полисахаридов

При температуре экстракции 98 ◦C, pH 7, количестве последовательных экстракций 2 и соотношении твердой и жидкой фаз 1:10 влияние времени экстракции на экстракцию полисахарида показано на рисунке 1e. Коэффициент экстракции незначительно снижался, когда время экстракции превышало 1 час. Кроме того, на содержание полисахаридов практически не влияли различные времена экстракции.

2.1.6. Влияние количества последовательных экстракций на экстракцию полисахаридов

При температуре экстракции 98°C, времени экстракции 1 час, pH 7 и соотношении твердой и жидкой фаз 1:10 влияние нескольких последовательных экстракций на экстракцию полисахарида показано на рис. 1f. Коэффициент извлечения упал до 5,11%, когда сырье экстрагировали во второй раз. Кроме того, содержание полисахаридов было очень низким, когда сырье экстрагировали в третий раз.

2.2. Ортогональный экспериментальный дизайн экстракции для IHRP

It could be seen that extraction temperature, solid–liquid ratio, number of successive extractions, and pH had a great influence on polysaccharide extraction based on the single-factor experiments. Therefore, the orthogonal experiments were carried out to further optimize the extraction conditions. As shown in Table 1, the order of effect of individual factors on polysaccharide extraction was: extraction temperature > several successive extractions>соотношение твердой и жидкой фаз > pH. Группа 5 (соотношение твердое вещество-жидкость 1:8, количество последовательных экстракций 3, температура экстракции 80 ◦C, рН 4) имела самое высокое содержание полисахаридов (12,79%), в то время как группа 9 (соотношение твердое вещество-жидкость 1 :10, количество последовательных экстракций 2, температура экстракции 98 ◦C и pH 4) имели второе место по содержанию полисахаридов (12,26%). С учетом энергопотребления и работоспособности было проведено сравнение групп 5 и 9 для определения наиболее подходящих условий экстракции. Как показано в таблице 2, проверенные эксперименты показали, что содержание полисахаридов между группами 5 и 9 было очень близким. Таким образом, для экономии энергозатрат были выбраны условия экстракции 9-й группы для извлечения ИТПХ для использования в следующих экспериментах: соотношение твердой и жидкой фаз 1:10, температура экстракции 98 ◦C, количество последовательных экстракций 2, количество последовательных экстракций 2. рН был 4.

2.3. Скрининг IHRPs Условия осаждения алкоголя

Экстракционный раствор IHRP был получен в соответствии с условиями экстракции, оптимизированными согласно 2.2. Влияние различных условий осаждения спирта показано в таблице 3. По сравнению с однократным добавлением и перемешиванием в течение 0,5 ч, непрерывное перекачивание и перемешивание могут еще больше повысить содержание полисахарида. Однако влияние скорости охлаждения на содержание полисахаридов не было очевидным. Поэтому для приготовления ИГРП были выбраны условия осаждения спиртом группы 4.

2.4. Выход полисахаридов и химический состав очищенных IHRP

Неочищенные IHRP обесцвечивали и очищали адсорбцией на активированном угле, мембранной фильтрацией, колоночной хроматографией и методом сточных вод соответственно. Как показано на рис. 2, обработка 8-процентным адсорбционным активированным углем дала лучший обесцвечивающий эффект, за ней следует обработка колоночной хроматографией. Кроме того, кромкооблицовочный метод и мембранная фильтрация практически не оказывали обесцвечивающего действия. Учитывая индустриализацию и простоту процесса, в этой рукописи для очистки IHRP использовалась колоночная хроматография с анионообменной смолой. Кроме того, как показано в таблице 4, масса IHRP составляла 15,26 г, когда очистку проводили после осаждения спиртом, тогда как масса IHRP составляла 12,74 г, когда очистку проводили непосредственно после экстракции нагреванием. Однако фактическая масса полисахарида в двух процессах была очень близкой (4,69 г и 4,38 г). Следовательно, для экономии затрат очистку колоночной хроматографией можно проводить сразу после экстракции нагреванием.

2.5. ИК-Фурье-спектроскопия IHRP

О некоторых структурных характеристиках полисахаридов можно судить по характерным пикам поглощения FT-IR [26]. Спектр FT-IR IHRP показан на рисунке 3, и можно наблюдать типичное поглощение полисахарида. Пик около 3378 см-1 был приписан валентным колебаниям -ОН, что указывает на существование -ОН [27]. Слабый пик при 2932 см-1 был валентным колебанием СН, включая колебание -СН2 и -СН3 [28]. Сильный пик около 1600 см-1 относится к валентным колебаниям -C=O [29], а пик около 1413 см-1 относится к валентным колебаниям CO, что указывает на существование -COOH. Кроме того, относительно сильный пик при 1080 см-1, скорее всего, соответствует деформационному колебанию ОН. Спектр FT-IR IHRP показал множество характерных пиков поглощения полисахаридов, демонстрируя полисахаридный скелет IHRP.

2.6. Анализ моносахаридного состава IHRP

Биологическая активность полисахаридов часто связана с композициями моносахаридов. В этом исследовании моносахаридный состав IHRP был получен с помощью ионной хроматографии, как показано на рисунке 4. В соответствии со стандартами моносахаридов, IHRP состояли из фукозы, арабинозы, рамнозы, галактозы, глюкозы, ксилозы, рибозы, галактуроновой кислоты, гулуроновой кислоты, и глюкуроновая кислота. Их процент качества составил 1,33, 19,60, 10,41, 20,87, 27,42, 4,23, 3,12, 6,22, 0,28 и 2,37 соответственно. Было обнаружено, что арабиноза, рамноза, галактоза и глюкоза являются основными моносахаридами в IHRP. Глюкоза была доминирующим моносахаридом в IHRP, и результат соответствовал предыдущему исследованию [30]. Содержание уроновой кислоты могло сделать полисахариды отрицательно заряженными. Этот результат оказал значительное влияние на биоактивность полисахаридов [31]. Кроме того, содержание полисахаридов в IHRP составляло от 30 до 35 процентов. Несахарные компоненты представлены в основном органическими кислотами, флавоноидами, стероидами и гликозидами. При этом содержание каждого несахарного компонента было относительно низким.

2.7. Исследование антиоксидантной активности

Способность ABTS и DPPH поглощать свободные радикалы широко изучалась для оценки антиоксидантной активности полисахаридов [32]. Способность IHRP к очистке от ABTS и DPPH показана в таблице 5. Как показано в таблице 5, скорость очистки DPPH и ABTS увеличивалась с увеличением концентрации IHRP. Когда концентрация IHRP составляла 1,0 мг/мл, скорость удаления DPPH составляла 76,00 процентов, а скорость удаления ABTS составляла 99,{{1{0}}}5 процентов. . После расчета значения EC50 ABTS и DPPH были определены как 0,34 и 0,47 мг/мл. Насколько нам известно, нет никаких сообщений об антиоксидантной активности IHRP. Изучена антиоксидантная активность соцветий 12 однодомных сортов Cannabis sativa L. [33]. Среди них ананас обладал самой сильной очищающей активностью в отношении DPPH (EC50=60,00 мкг/мл), в то время как Kc-Virtus обладал самой сильной очищающей способностью в отношении ABTS (EC50=304,77 мкг/мл). мл). Что касается антиоксидантной активности каннабидиолового масла полного спектра, сообщалось, что его DPPH EC50 составляла 158,0 мкг/мл [34]. Кроме того, сообщалось, что DPPH EC50 CBD составляет 0,937 мМ [35]. Также была изучена способность CBDV поглощать свободные радикалы, т.е. ABTS EC50 составляла 406,3 мкМ, а DPPH EC50 составляла 3736 мкМ [36]. Приведенные выше результаты показали, что IHRP проявляют большую антиоксидантную активность.

【Для получения дополнительной информации:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】