Ингибитор фарнезилтрансферазы LNK-754 ослабляет аксональную дистрофию и уменьшает амилоидную патологию у мышей. Часть 2

Живая визуализация нейронов

Для экспериментов с живым изображением нейроны готовили, как описано выше, и помещали в чашки со стеклянным дном диаметром 35 мм (MatTek # P35G-1.5-14C) на 7 дней в культуре. Затем к кондиционированной среде добавляли 10 нМ LNK-754 или лонафарниба, контрольные культуры обрабатывали ДМСО в качестве носителя. Через 48 часов обработки среду заменяли кондиционированной средой из необработанных параллельных пластинок нейронов. К кондиционированной среде добавляли 25 нМ LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen) и нейроны инкубировали в течение 30 минут при 37 градусах.

Нейроны — важная часть нервной системы, способная получать, обрабатывать и передавать информацию, и являются материальной основой интеллекта и поведения человека. Иммунитет является важной гарантией сопротивляемости организма человека болезням. Он может идентифицировать и уничтожать патогены и аномальные клетки, а также поддерживать здоровье организма.

Исследования показывают, что существует прочная связь между нейронами и иммунной системой. Нейроны могут влиять на иммунную систему, высвобождая различные нейротрансмиттеры, такие как норадреналин, адреналин и т. д. Эти нейротрансмиттеры могут изменять активность иммунных клеток, усиливать пролиферацию и функцию иммунных клеток, а также улучшать иммунитет организма. В то же время иммунная система также может влиять на функцию нейронов различными путями. Иммунные клетки могут секретировать различные цитокины и гормоны, влияя на рост, развитие и функцию нейронов через иммунные пути.

Кроме того, психологические и социальные факторы могут влиять на иммунитет и функцию нейронов. Негативные эмоции, такие как стресс, тревога и депрессия, могут отрицательно повлиять на иммунную систему и нейроны, снижая иммунитет организма. Положительные эмоции, позитивные социальные отношения и здоровый образ жизни могут способствовать здоровому развитию иммунитета и нейронов.

Подводя итог, можно сказать, что между нейронами и иммунитетом существует интерактивная и взаимоподдерживающая связь. Поддержание психического здоровья, позитивное отношение к жизни и принятие хороших жизненных привычек могут способствовать укреплению иммунитета организма и здоровому развитию нейронов. Видно, что нам необходимо улучшить нашу память. Cistanche Deserticola может значительно улучшить память, поскольку Cistanche Deserticola также может регулировать баланс нейротрансмиттеров, например, повышая уровень ацетилхолина и факторов роста. Эти вещества очень важны для памяти и обучения. Кроме того, мясо также может улучшить кровоток и способствовать доставке кислорода, что может гарантировать, что мозг получает достаточное количество питательных веществ и энергии, тем самым повышая жизнеспособность и выносливость мозга.

Нажмите, чтобы узнать, как улучшить работу мозга

Покадровую визуализацию нейронов проводили с использованием широкопольного микроскопа Ti2. Визуализация начиналась сразу через 30 минут и продолжалась не более 30 минут. Снимки 1- делались каждую минуту, и в течение 30 минут были получены изображения 20–30 отдельных областей на каждую чашку. Количественное определение расстояния и скорости частиц LysoTracker и анализ кимографа были выполнены с использованием программного обеспечения NIS Elements и подробно описаны ниже. В отдельных экспериментах к кондиционированной среде добавляли 1 мкм Lysosensor-Green DND-189 (#L7535, Invitrogen), а полученные изображения живых нейронов снимали в течение не более 15 минут с использованием конфокального микроскопа Nikon A1 с объективом 60X. (NA 1.4) и программное обеспечение NIS Elements.

Живая визуализация тканей головного мозга

{{0}}месячным мышам 5XFAD вводили внутрибрюшинно инъекции ежедневно в течение 3 недель, а по завершении лечения мышей подвергали анестезии и перфузировали раствором, содержащим 1 М KCl, 1 М MgCl2, 0,1 мМ кинуренат. , 0,01 мМ DL-2-амино-5-фосфонопентановая кислота, 5 мМ глутатион, 25 мМ глюкоза, 125 мМ NaCl, 1,4 мМ NaH2PO4 и 25 мМ NaHCO3.

Затем мозг быстро препарировали в ледяной насыщенной кислородом среде ACSF, содержащей 2,5 мМ KCl, 85 мМ NaCl, 1,25 мМ NaH2PO4, 25 мМ NaHCO3, {{10}},5 мМ CaCl2, 4 мМ 4 MgCl2, 75 мМ сахарозы, 25 мМ глюкозы, 50мкМ C6H7NaO6, 0.1 мМ кинуренат, 0.01 мМ DL-2-амино-5-фосфонопентановая кислота и 5 мМ глутатион. Корональные срезы толщиной 300 мкм получали с использованием вибрационного микротома Compresstome VF-200 (Precision Instruments) и оставляли на 30 минут для восстановления при 32 градусах в насыщенном кислородом растворе ACSF, содержащем следующие 2,5 мМ KCl, 85 мМ NaCl, 1,25 мМ NaH2PO4, 25 мМ NaHCO3, 0,5 мМ CaCl2, 4 мМ 4 MgCl2, 75 мМ сахарозы, 25 мМ глюкозы, 50 мМ C6H7NaO6, 0,1 мМ кинурената, 0,01 мМ DL2-амино-5-фосфонопентановой кислоты и 5 мМ глутатиона.

Затем срезы переносили в чашки со стеклянным дном диаметром 35 мм (MatTek # P35G-1.5-14C), содержащие оксигенированный ACSF с 25 нМ LysoTracker-Green и разведение 1:10,000 1 мг/мл. мл тиазинового красного (#S570435, Sigma Aldrich), который в остальном был идентичен ACSF, используемому в период восстановления. Жизнеспособность срезов подтверждали с помощью покадровой визуализации тканей. Срезы инкубировали с LysoTracker-Green и Tiazine Red в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем немедленно визуализировали области коры головного мозга в том же растворе при 32 градусах на конфокальном микроскопе Nikon A1 с объективом 60X (NA 1.4) и программным обеспечением NIS Elements для не более 30 минут.

Экстракция мозга и иммуноблоттинг

Мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией ксилазина (15 мг/кг) и кетамина (100мг/кг), перфузировали фосфатно-солевым буфером (1XPBS) с фенилметилсульфонилфторидом (20 мкг/мл), лейпептин (0,5 мкг/мл), ортованадат натрия (20 мкМ) и дитиотреитол (0,1 мМ) с последующим удалением мозга. Все буферы, используемые для экстракции белка, содержали коктейль ингибиторов протеаз III (#535140, Millipore) и ингибитор останавливающей фосфатазы (#78420, Thermo Fisher Scientific). Ткани полушарий мозга взвешивали и гомогенизировали вручную с использованием гомогенизатора Дауна 1:10 (мас./об.) в 1XPBS.

После гомогенизации лизаты центрифугировали при 20,8{{10}}0g в течение 30 минут при 4 градусах. Растворимую фракцию (супернатант) удаляли, а осадок ресуспендировали пипетированием в буфере для радиоиммунопреципитационного анализа (RIPA) [50 мМ Трис, 0,15 М NaCl, 1 % октилфеноксиполиэтоксиэтанол (IGEPAL), 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 0,1 % ДСН и 0,5 % дезоксихолата натрия при pH 8] инкубировать на льду в течение 30 минут.

Образцы обрабатывали ультразвуком (Misonix XL{{0}} в течение 20 секунд на льду, а затем центрифугировали при 20800 g в течение 30 минут при 4 градусах. Растворимую в RIPA фракцию (супернатант) удаляли и осадок ресуспендировали в 5М гуанидине (рН 8,0) для анализа нерастворимых белков. Каждый образец обрабатывали ультразвуком в течение 20 секунд на льду, вращали в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем центрифугировали при 20800 g в течение 30 минут при 4 градусах. Анализ те-бицинхониновой кислоты (BCA) (#23225, Thermo Fisher Scientific) использовали для измерения концентрации белка в каждом образце.

Для вестерн-блоттинга 20 мкг белка каждого образца загружали в 4–12% гели NuPAGE (Invitrogen) и разделяли с использованием буфера MOPS в восстановленных и денатурированных условиях. Белки переносили на поливинилидендифторидную мембрану и проявляли с использованием Pierce ECL (усиленная хемилюминесценция; Thermo Fisher Scientific). Разработанные сигналы визуализировали с помощью ProteinSimple FCR (FluorChem R), а последующие хемилюминесцентные сигналы оценивали количественно с помощью программного обеспечения AlphaView (ProteinSimple). Все блоты анализировались с использованием инструмента локальной фоновой коррекции, за исключением блота HDJ-2, который анализировался с использованием инструмента фоновой связи в сочетании с многорегиональной фоновой коррекцией (программное обеспечение AlphaView).

А 42 ИФА

Для измерения A 42 в гомогенатах полушарий головного мозга мышей 5XFAD использовали коммерчески доступный иммуноферментный анализ (ELISA) (Thermo Fisher Scientific, KHB3441) в соответствии с инструкциями производителя для анализа гуанидина и PBS-растворимого A 42 в полушариях мозга. Для измерения А 42 в мозге мышей hAPP/PS1 использовали коммерчески доступный ELISA (высокочувствительный ELISA для h амилоида 42, Te Genetics Company, Цюрих, Швейцария). ИФА проводили согласно протоколу производителя.

Иммунофлуоресценция тканей головного мозга мыши

После перфузии мозг извлекали и полушария фиксировали в 10% формалине с последующей криоконсервацией в 30% растворе сахарозы в 1XPBS. Для получения корональных или сагиттальных срезов 30- мкм использовали замораживающий скользящий микротом. Срезы последовательно помещали в 12-луночный планшет в криозащитном растворе (1xPBS, 30% сахарозы и 30% этиленгликоля) и хранили при -20 градусах до использования. Иммунофлуоресцентное окрашивание осуществляли, сначала трижды промывая срезы в 1XTBS, а затем инкубируя срезы в 16 мМ глицине в 1XTBS в течение 1 часа при комнатной температуре. После 3 дополнительных промываний в 1XTBS срезы блокировали в 5% козьей сыворотке в 0,25% тритоне X-100 в 1XTBS в течение 2 часов при комнатной температуре.

Затем срезы инкубировали в течение ночи с первичными антителами в растворе 0,25% тритона X-100, 1% бычьего сывороточного альбумина и 1XTBS при 4°С. Затем проводили вторичное иммуноокрашивание с использованием вторичных антител, меченных AlexaFluor, в концентрации 1:1000 (Thermo Fisher Scientific). ProLong Gold (#P36934, Thermo Fisher Scientific) использовался для крепления срезов перед их визуализацией на широкоугольном микроскопе Ti2 или лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Nikon A1 для количественной оценки изображения с использованием программного обеспечения Nikon NIS Elements для получения изображений.

Все настройки сбора данных оставались одинаковыми для разных генотипов, и все изображения были получены в течение одного и того же периода визуализации для отдельных экспериментов (Центр передовой микроскопии Северо-Западного университета и Центр визуализации Nikon).

Количественная оценка изображения

Мышиные мозги

Количественную иммунофлуоресцентную оценку иммуноокрашивания тканей головного мозга мышей проводили на 3–5 срезах на животное, от координат Брегмы примерно от -0,94 до -2,55 мм, которые визуализировали с использованием объектива 10X на широкоугольном микроскопе Ti2. Количественный анализ, включая пороговые значения размера и интенсивности, проводился с использованием программного обеспечения Nikon NIS-Elements (Центр визуализации Nikon Северо-Западного университета).

В зависимости от сигнала с помощью инструмента «Общий анализ» устанавливались пороговые значения на основе размера, формы и контрастности объекта, а затем создавались бинарные маски для каждого канала и интересующей области. Пороговая обработка выполнялась отдельно для каждого канала, чтобы изолировать интересующие сигналы путем оптимизации соотношения сигнал/шум и устранения неспецифических фоновых сигналов. Для расчета площади покрытия LAMP1, BACE1 или LysoTracker-Green, а также измерений интенсивности флуоресценции LAMP1 и Lysosensor в первичных нейронах интересующие области вручную отслеживались с помощью NIS-Elements, и для каждой интересующей области создавался бинарный слой.

Для расчета соотношения LAMP1 и A 42 площадь LAMP1 в дистрофических нейритах нормализовали по площади A 42 на основе отдельных бляшек и количественно определяли средние соотношения на мышь между группами лечения. Анализ коэффициента корреляции Пирсона для BACE1 и LAMP1 был выполнен с использованием NIS-Elements для каждой бляшки на проекциях максимальной интенсивности 30-микронных изображений Z-stack, полученных с использованием лазерного сканирующего конфокального микроскопа Nikon A1 с размером шага 1 мкм.

Для расчета соотношения LysoTrackerGreen и Tiazine Red площадь LysoTracker-Green в дистрофических нейритах нормализовали по площади Tiazine Red на основе индивидуальных бляшек и количественно определяли среднее соотношение на мышь между группами лечения. Четыре корональных среза с координатами Брегмы примерно от -1,70 до -2,55 мм использовали для расчета площади или интенсивности каждого сигнала в каждой соответствующей области мозга для каждой мыши. Анализ площади, покрытой бляшками, и размера бляшек проводили с использованием среднего значения пяти срезов на мышь из координат Bregma примерно от -0,94 до -2,55 мм. Выбор срезов, получение изображений, отслеживание изображений и количественные оценки выполнялись человеком, не имеющим информации о группах лечения и генотипах.

Первичные нейроны

Для количественной оценки иммуноокрашивания LAMP1 в фиксированных первичных нейронах мыши сомы вручную отслеживали на основе морфологии с использованием NIS-Elements, и для каждой интересующей области и канала создавали бинарную маску. Пороговое значение использовали для оптимизации сигналов LAMP1 и различения LAMP1 в нейритах, включая как дендриты, так и аксоны, путем выделения пикселей LAMP1, положительных для пикселей тубулина.

Сигналы LAMP1 сомы клеток исключали из общей площади LAMP1 для анализа везикул LAMP1 в нейритах. Для анализа подвижности LysoTracker-Green в нейронах изображения были количественно оценены с использованием NISElements. Скорость и расстояние всех частиц LysoTrackerGreen в каждом кадре отслеживались с помощью функции автоматического отслеживания движения в NIS-Elements. Порог был установлен и применен ко всем фильмам на основе размера и интенсивности флуоресценции частиц LysoTracker-Green для устранения фонового шума.

Для создания кимографа выполняли покадровую визуализацию отдельных нейронов на конфокальном микроскопе 60X и аксоны идентифицировали морфологически. Процент частоты частиц, движущихся в антероградном, ретроградном или стационарном направлении, определяли количественно путем деления количества частиц для каждой группы на общее количество частиц. Для анализа кимографа движущиеся частицы определялись как имеющие скорость выше 0,1 мкм/сек.

статистический анализ

Программное обеспечение GraphPad Prism v8 использовалось для проведения статистического анализа, включая дисперсионный анализ (ANOVA) с апостериорными тестами при сравнении более двух выборок и непарными t-критериями, когда сравнивались только две выборки. Конкретные детали теста, включая количество повторов, тип апостериорных тестов и значения P, указаны в подписях к рисункам. Все количественные оценки нанесены на график в соответствии со средним значением ± SEM. О значимости признавали, когда значение P было меньше 0,05, что обозначается *P.<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001.

For more information:1950477648nn@gmail.com