Причина хронической болезни почек (ХБП) - анемия

Контактное лицо: Одри Ху Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Электронная почта:audrey.hu@wecistanche.com

ЧАСТЬ Ⅰ: Хроническая болезнь почек с протеинурией связана с измененной продолжительностью жизни эритроцитов, их деформируемостью и метаболизмом.

Рози Биссинджер, Трэвис Немков и др.

Развитиеанемияявляется типичным осложнением запущенногохроническое заболевание почек(ХБП) и связано с ухудшением качества жизни¹и повышенный риск сердечно-сосудистых событий²и госпитализация,³а также снижение когнитивных функций.⁴Тяжестьанемиярассматривается как независимый предиктор смертности как при диализозависимой, так и при не диализозависимой ХБП.хроническое заболевание почек) пациентов.⁵Патофизиология заболеваний почек, ассоциированных санемияявляется сложным и включает дефицит железа и эритропоэтина (ЭПО) на фоне вялотекущего воспаления, что, в свою очередь, нарушает нормальный эритропоэз при ХБП.хроническое заболевание почек) пациентов.⁶При прогрессирующей ХБП (хроническое заболевание почек), реакция ЭПО неадекватно низка по отношению к степенианемия.^7,8 Высокая распространенность сопутствующего дефицита железа при ХБП (хроническое заболевание почек) является следствием нарушения гомеостаза железа.⁹ Забытый механизм потери железа при ХБП (хроническое заболевание почек) является протеинурия, которая может привести к потерям связанного с трансферрином железа с мочой (до 0,3 мг/сут), когда протеинурия достигает нефротического уровня.¹⁰Еще один фактор, который, как считается, способствуетанемияпри ХБП (хроническое заболевание почек) patients is the shortened lifespan of red blood cells (RBCs), first described >60 лет назад.^6,11,12

Польза Цистанхе: лечение заболеваний почек и улучшение функции почек

Недавнее исследование с использованием дыхательного теста с угарным газом показало, что продолжительность жизни эритроцитов прогрессивно снижалась со 120 дней у пациентов с ХБП 1 стадии.хроническое заболевание почек) до 60 дней у пациентов с 5 стадией ХБП (хроническое заболевание почек).¹³ Примечательно, что переливание аллогенных эритроцитов от здоровых доноров пациентам с ХБП (хроническое заболевание почек) у пациентов наблюдался быстрый клиренс перелитых эритроцитов без признаков гемолиза.¹²Вероятным механизмом этого наблюдения может быть стимуляция апоптозоподобной гибели клеток в безъядерных эритроцитах, что указывает на характер повреждения, при котором целостность клеточной мембраны не нарушается, а цитоплазматическое содержимое остается интактным.¹⁴Эритроциты, подвергшиеся гибели клеток, демонстрируют различные морфологические изменения, возникающие в результате повреждения цитоскелета, такие как образование поверхностных пузырьков, потеря эластичности мембраны и/или клеточная дегидратация.¹⁵На молекулярном уровне гибель эритроцитов связана с внутриклеточным накоплением Са2+, изменением клеточного энергетического статуса и нарушением асимметрии фосфолипидов, что в конечном итоге приводит к экстернализации фосфатидилсерина (ФС) на внешней плазматической мембране.^15,16Как следствие, макрофаги и специализированные дендритные клетки быстро распознают ФС-экстернализированные эритроциты, что приводит к фагоцитозу эритрозы и их катаболизму в селезенке и печени.¹⁷Из-за неоднозначной патофизиологииБолезнь почек–связанныйанемияу людей необходимы исследования на животных, чтобы точно определить способствующие механизмы. Доксорубицин-индуцированная нефропатия (DIN) у мышей 129S1/SvImJ¹⁸и мыши с индуцируемым дефицитом подоцина (Nphs2Dipod)¹⁹2 модели, которые характеризуются индукцией протеинурии нефротического диапазона в течение нескольких дней, прогрессированием до почечной недостаточности через 3 недели и смертью через 6-7 недель.^19–21Обе мышиные модели эффективно повторяют все стадии ХБП у человека.хроническое заболевание почек). В настоящем исследовании мы проверили, является ли прогрессирующая почечная недостаточность у этих мышей с протеинурией.Болезнь почеквлияет на продолжительность жизни эритроцитов и способствуетанемия. Параллельно мы исследовали фенотип эритроцитов в крови, взятой при ХБП (хроническое заболевание почек) пациенты с протеинурией нефротического диапазона.

ХБП (хроническое заболевание почек) а такжеанемия: ЦИСТАНЧЕ

МЕТОДЫ

Подробная информация о материалах и методах представлена ​​в дополнительных материалах и методах.

Исследования на мышах

Эксперименты проводились на 8-недельных мышах дикого типа 129S1/SvImJ обоего пола (Charles River). ДИН индуцировали однократной инъекцией доксорубицина (14,5 мг/г массы тела), как описано ранее.^18,22Для контроля миелотоксического действия доксорубицина, не связанного с развитием нефропатии, устойчивых к доксорубицину мышей C57BL/6 также подвергали такому же протоколу лечения.²³ Кроме того, аналогичные эксперименты были проведены на 8-недельных мышах с индуцируемой делецией подоцина (B6-Nphs2tm3.1Antc*Tg [Nphs1-rtTA*3G] 8Jhm*Tg[tetO -cre]1Jaw) или мышей Nphs2Dipod, которых лечили доксициклином в течение 14 дней.¹⁹Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных и Законом Германии о благополучии животных с разрешения местных властей (Regierungspräsidium Tübingen, номера разрешений M12/17 и M17/19G). ). Экспериментальный план исследований на мышах показан на дополнительном рисунке S1.

Пациенты

Исследование пациентов проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией и было одобрено локальным комитетом по этике Университетской клиники Тюбингена (556/2018BO2). Образцы крови и мочи с литий-гепарином были получены у пациентов с протеинурией нефротического диапазона и сохраненной скоростью клубочковой фильтрации (СКФ; стадии 1–2; n=10) и у пациентов со сниженной СКФ (ХБП (хроническое заболевание почек) этап 3–5; n=15) в университетской клинике Тюбингена. В качестве контрольной группы кровь здоровых добровольцев соответствующего возраста и пола (n=25) была предоставлена ​​банком крови Университетской клиники Тюбингена. Все образцы человека были собраны после получения информированного согласия. Клиническая характеристика больных указана вТаблица 1.

Таблица 1|Характеристика пациентов с ХБП (хронической болезнью почек) и здоровых доноров крови

Анализы проточной цитометрии

Различные параметры гибели клеток эритроцитов определяли методом парной цитометрии.¹⁴ Для определения продолжительности жизни эритроцитов in vivo 25 мл красителя 5,6-карбоксифлуоресцеиндиацетат сукцинимидилового эфира [5(6)-CFDA, SE] вводили в концентрации 9,96 мМ (солюбилизированного в диметилсульфоксиде) в ретроорбитальную область. сплетение мышей дикого типа 129S1/SvImJ и инъецированных доксорубицином, как описано ранее.24 В указанные моменты времени кровь брали из ретроорбитального сплетения мышей и определяли процентное содержание клетки были обнаружены с помощью коллегиального цитометрического анализа. Наконец, данные были проанализированы с использованием программного обеспечения FlowJo (FlowJo LLC).

Деформируемость эритроцитов и эктацитометрия с осмотическим градиентом

Деформируемость эритроцитов измеряли с помощью лазерного оптического ротационного анализатора клеток (LORCA Max Sis; RR Mechatronics), подробно описанного в другом месте.²⁵Анализ осмотического градиента эктацитометрии (cosmos can) также выполняли с использованием LORCA Max Sis и измеряли деформируемость в различных осмотических условиях.²⁶

Гистологическое исследование

Для окрашивания гематоксилином и эозином селезенки и бедра окрашивали гематоксилином и эозином. Все предметные стекла окрашивали первичным антителом Ter119 (BD Pharmingen, разведение 1:500). Для периодического окрашивания кислотой–Шиффа срезы толщиной 2,5- ммпочкиокрашивали периодической кислотой–реактивом Шиффа (Carl Roth) и гематоксилином (Abcam). Окрашивание по Май-Грюнвальду-Гимзе (метод Паппенгейма) проводили для определения изменений формы эритроцитов, как описано ранее.²⁷ Выделение клубочков проводили с использованием подхода биотинилирования и сортировки клеток.¹⁹Для определения белка подоцина применяли антитело от Sigma (P0372).¹⁹Для окрашивания ядер использовали Roti-Mount Fluor Care 4, 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI; Carl Roth).

Метаболомика сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии эритроцитов мышей

Анализы были выполнены, как ранее опубликовано.²⁸Вкратце, аналитическая платформа использует сверхвысокоэффективную систему жидкостной хроматографии Vanquish (Thermo Fisher Scientific), подключенную к масс-спектрометру Q Exactive (Thermo Fisher Scientific).

Цистанхе лечит заболевание почек, вызванное анемией

Статистический анализ

Данные представлены в виде среднего арифметического SEM или медианы с межквартильным диапазоном (25-75-й процентиль), где n представляет количество использованных животных или включенных пациентов соответственно. Данные были проверены на нормальность с помощью теста Колмогорова-Смирнова, теста Д'Агостино и теста Шапиро-Уилка. Дисперсия анализировалась с помощью теста Бартлетта на предмет равенства дисперсий. Последующий тест множественного сравнения Тьюки или Данна, непарный t-критерий Стьюдента или U-критерий Манна-Уитни выполняли с помощью GraphPad Prism 8 (GraphPad Software). P < 0.05="" с="" 2-="" хвостовым="" тестированием="" считалось="" статистически="" значимым.="" дополнительные="" графики="" были="" построены="" с="" помощью="" graphpad="" prism="">

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Экспериментальная протеинурическая болезнь почек вызываетанемияу мышей После индукции у мышей 129S1/SvImJ с мышами DIN и Nphs2Dipod развилась протеинурия нефротического диапазона (рисунок 1a и дополнительный рисунок S2C) и прогрессирующая почечная недостаточность, характеризующаяся высоким уровнем мочевины в плазме начиная с 20-го дня (рисунок 1b и дополнительный рисунок S2D). В течение первых 10 дней у мышей наблюдалось увеличение массы тела с асцитом (рисунок 1c и дополнительный рисунок S2E), что отражает задержку натрия, вызванную выделением сериновых протеаз или протеинурией.¹⁸После спонтанного устранения задержки натрия эти мыши неуклонно теряли вес. У мышей с DIN и у мышей Nphs2Dipod изображения световой микроскопии, полученные через 10 дней, выявили типичные гистоморфологические изменения, соответствующие фокальному сегментарному гломерулярному склерозу (рисунок 1d и дополнительный рисунок S2B). Они отсутствовали у мышей C57BL/6, которым вводили доксорубицин (рис. 1d). Лечение доксорубицином вызывало сильное снижение уровня гемоглобина, количества эритроцитов и гематокрита (рис. 1e-g) с 10-го дня у мышей 129S1/SvImJ и C57BL/6, которые у последних нормализовались на 20-й и 30-й дни. На 20-й и 30-й дни у мышей 129S1/SvImJ, которым вводили доксорубицин, и у мышей с дефицитом подоцина развился прогрессирующийанемия, характеризующийся уменьшенным средним корпускулярным объемом (рис. 1h) и сниженным гемоглобином (дополнительный рисунок S2F), что позволяет предположить, чтоанемияассоциируется с прогрессирующей почечной недостаточностью, а не с лечением доксорубицином per see.

Рисунок 1|Функция почек и явная анемия у мышей 129S1/SvImJ, которым вводили доксорубицин.(a–d) У мышей 129S1/SvImJ, которым вводили доксорубицин, развилась (a) высокая протеинурия, (b) прогрессирующее увеличение концентрации мочевины в плазме, (c) временное увеличение массы тела и (d) типичные гистоморфологические изменения, свидетельствующие о очаговом сегментарном гломерулярном склерозе. на 10-й день (окраска периодической кислотой по Шиффу; полоса=10 мм). (e–h) Кроме того, у этих мышей развилсяанемияотражается (e) снижением уровня гемоглобина, (f) снижением количества эритроцитов (RBC), (g) снижением уровня гематокрита и (h) снижением среднего корпускулярного объема. (a–d) У мышей C57BL/6, которым вводили доксорубицин, не было никаких признаков повреждения почек, и (e–g)анемияна 1-й день 0 нормализовался на 2-й 0 и 30-й дни. Показаны средние арифметические SEM. *Р < 0,05,="" **="" р="">< 0,01,="" ***="">< 0.001,and="" ****p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" healthy="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" #p=""><0.05, ##p="" <="" 0.01,="" ###p="" <="" 0.001,="" and="" ####p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" to="" the="" baseline="" of="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" mice;="" and="" §p="" <="" 0.05,="" §§p="" <="" 0.01,="" §§§p="" <="" 0.001,="" and="" §§§§p="" <="" 0.0001="" indicate="" signifificant="" difference="" between="" doxorubicin-injected="" 129s1/svimj="" and="" doxorubicin-injected="" c57bl/6="" mice.="" crea,="">

Анемия при экспериментальной протеинурической болезни почек не связана с нарушением эритропоэза.

Обе модели мышей с анемией продемонстрировали значительное увеличение процента циркулирующих ретикулоцитов (рисунок 2a и дополнительный рисунок S3C). Концентрации ЭПО в плазме были резко увеличены на 10-й день у 129S1/SvImJ с DIN и здоровыми мышами C57BL/6, но снова нормализовались на 20-й и 30-й дни (фиг. 2b). У мышей с дефицитом подоцина концентрации ЭПО в плазме резко возросли на 10-й день и оставались повышенными на 20-й и 30-й дни (дополнительная фигура S2H). В гистологическом анализе костного мозга и селезенки количество эритроидных клеток-предшественников по сравнению с миелоидными предшественниками было увеличено на 30-й день (рис. 2d-g), что указывает на стимулированный эритропоэз у анемичных мышей 129S1/SvImJ с DIN.

Рисунок 2|Эритропоэз стимулируется у мышей 129S1/SvImJ, которым вводили доксорубицин, с анемией. (a) анемияу мышей 129S1/SvImJ, которым вводили доксорубицин, произошло, несмотря на увеличение числа ретикулоцитов на 2{{30}} и 30 дни. (b) Концентрация эритропоэтина в плазме была сильно увеличена в день 10 у мышей 129S1/SvImJ и C57BL/6, которым вводили доксорубицин, но снова нормализовалась на дни 20 и 30. (c–e) Количественная оценка абсолютного количества (c) миелоидных и (d) эритроидных клеток в костном мозге. Соотношение (e) миелоидных и эритроидных клеток у здоровых мышей 129S1/SvImJ, которым вводили доксорубицин, в костном мозге показало большее количество эритроидных клеток-предшественников у мышей 129S1/SvImJ, которым вводили доксорубицин, на 3-й день{{5{{52} }}}}. (f, g) Гистология (f) селезенки и (g) костного мозга показала увеличение количества клеток-предшественников эритроидного ряда, наблюдаемое даже при меньшем увеличении, у мышей 129S1/SvImJ, которым вводили доксорубицин (правые панели), по сравнению со здоровыми мышами (левые панели). ) на 30-й день. (f, g) Иммуногистохимия Ter119 (нижние панели) подтвердила результаты гематоксилина и эозина (H&E). Ter119 положителен в эритроидных предшественниках (нуклеарных клетках) и в эритроцитах (безъядерных клетках). Брус ¼ 100 мм; вставки ¼ 25 мм. Показаны средние арифметические SEM. *P <0,05, **p=""><0,01 и="" ***p=""><0,001 указывают="" на="" значительную="" разницу="" между="" здоровыми="" мышами="" 129s1/svimj="" и="" мышами="" 129s1/svimj,="" которым="" вводили="" доксорубицин;="" ##p=""><0,01 и="" ####p=""><0,0001 указывают="" на="" значительное="" отличие="" от="" исходного="" уровня="" у="" мышей="" 129s1/svimj,="" которым="" вводили="" доксорубицин;="" и="" §p=""><0,05, §§p=""><0,01 и="" §§§§p=""><0,0001 указывают="" на="" значительную="" разницу="" между="" мышами="" 129s1/svimj,="" которым="" вводили="" доксорубицин,="" и="" мышами="" c57bl/6,="" которым="" вводили="">

ПреимуществоЦистанхе: лечение заболеваний почек и улучшение функции почек

Снижение продолжительности жизни эритроцитов является основной причиной анемии при экспериментальной протеинурической болезни почек.

Экстернализация ФС на внешнем листке плазматической мембраны эритроцитов является индикатором клеточной гибели и промотором эритрофагоцитоза.¹⁴Гибель клеток эритроцитов определяли количественно с помощью анализа сортировки флуоресцентно-активированных клеток флуоресцентного аннексина V, связанного с поверхностным PS.¹⁴ In freshly drawn blood, the percentage of PS-exposing cells was >{{0}}кратно выше на 2-й день0 у мышей с ДИН (4,16 процента и 0,86 процента) по сравнению со здоровыми мышами (1,{{7). }} процентов и 0,11 процентов) (рис. 3а). Точно так же мыши Nphs2Dipod продемонстрировали приблизительно 2-кратное увеличение воздействия PS (1,27 процента и 0,20 процента) по сравнению со здоровыми мышами (0,58 процента и 0,05 процента) на 30-й день (дополнительный рисунок S3A). Известно, что эритроциты удаляются из кровообращения макрофагами, находящимися в селезенке. Таким образом, это наблюдение может объяснить более высокое соотношение веса селезенки к массе тела у мышей Nphs2Dipod (дополнительная фигура S2G), у которых деградирует в два раза больше эритроцитов по сравнению со здоровыми. Мыши C57BL/6. Поскольку протеинурия нефротического диапазона приводит к диспротеинемии,29 мы дополнительно исследовали, может ли усиленная гибель эритроцитов стимулироваться компонентом плазмы мышей с ДИН. Как показано на рис. 3b, воздействие PS на 10-й и 20-й дни было в два раза выше после инкубации (30 минут при 37°С).^OC) здоровых эритроцитов в плазме мышей 129S1/SvImJ, которым инъецировали доксорубицин, по сравнению с инкубацией в плазме здоровых мышей. Поступление Ca2+ в эритроциты, опосредованное потенциал-зависимыми и потенциал-независимыми неселективными катионными каналами,^30,31является одним из ключевых регуляторов гибели эритроцитов. В эритроцитах, собранных на 20-й и 30-й день от мышей 129S1/SvImJ с DIN, внутриклеточные концентрации Ca2+ были повышены (рис. 3c); это явление повторилось у мышей Nphs2Dipod на 20-й день (дополнительная фигура S3B). В обеих моделях мышей наблюдалась значительная отрицательная корреляция процента PS-позитивных эритроцитов с тяжестью заболевания.анемияотражается уровнями гемоглобина (рисунок 3d и дополнительный рисунок S3D). Более того, наблюдалась значительная корреляция с повреждением почек, отражаемым концентрацией мочевины в плазме (рисунок 3e и дополнительный рисунок S3E) и, в меньшей степени, с протеинурией (рисунок 3f и дополнительный рисунок S3F). Для компенсации потери эритроцитов ванемия, образование новых эритроцитов стимулировалось у обеих мышей, о чем свидетельствует повышенный процент циркулирующих ретикулоцитов, и это значительно коррелировало с величиной PS, обнажающей эритроциты (рисунок 3g и дополнительный рисунок S3G).

Рисунок 3|У мышей с доксорубицин-индуцированной нефропатией развивается повышенная гибель эритроцитов (эритроцитов), опосредованная повышенным уровнем внутриклеточного кальция.( а ) Экстернализация фосфатидилсерина (ФС), отражающая гибель эритроцитов, усиливалась на 2 0 и 3 0 дни после индукции доксорубицин-индуцированной нефропатии. ( б ) Инкубация здоровых эритроцитов в плазме, взятой на 1 0 и 2 0 дни у этих мышей, привела к экстернализации PS. ( c ) экстернализация PS сопровождалась повышением уровня внутриклеточного кальция в эритроцитах, взятых на 2 0 и 3 {{30}} дни после индукции. (d–g) Процент (d) эритроцитов, подвергающихся воздействию PS, коррелировал с уровнями гемоглобина, повреждением почек, на которое указывала (e) концентрация мочевины в плазме и (f) протеинурия, а также (g) образование ретикулоцитов. (d–g) Данные включают каждую временную точку (0, 10, 20 и 30 дней) каждой здоровой мыши 129S1/SvImJ и 129S1/SvImJ с доксорубицин-индуцированной нефропатией. Показаны средние арифметические SEM. **P <0,01, ***p=""><0,001 и="" ****p=""><0,0001 указывают="" на="" значительную="" разницу="" между="" здоровыми="" мышами="" 129s1/svimj="" и="" мышами="" 129s1/svimj,="" которым="" вводили="" доксорубицин="" (in.);=""><0,05,><0,01 и=""><0,0001 указывают="" на="" значительное="" отличие="" от="" исходного="" уровня="" у="" мышей="" 129s1/svimj,="" которым="" вводили="" доксорубицин;="" и="" §§§§p=""><0,0001 указывают="" на="" значительную="" разницу="" между="" мышами="" 129s1/svimj,="" которым="" вводили="" доксорубицин,="" и="" мышами="" c57bl/6,="" которым="" вводили="" доксорубицин.="" креа,="" креатинин;="" mfi,="" средняя="" интенсивность="">

ПреимуществоЦистанхе: лечение заболеваний почек и улучшение функции почек

НАЖМИТЕ ЗДЕСЬ, ЧТОБЫ ЧАСТЬ Ⅱ